Меню Закрыть

Капус зеленая упаковка: Краска для волос Kapous Studio с экстрактом женьшеня и рисовыми протеинами

Содержание

Краска для волос Kapous Studio с экстрактом женьшеня и рисовыми протеинами - «Хороши ли красители Капус Kapous. Мнение парикмахера.»

Хочу немного рассказать о красителе марки Капус, а именно линейке красителей "эконом класса" - с рисовыми протеинами и экстрактом женьшеня в зеленой упаковке.

Вообще, на момент написания отзыва, у марки Капус представлено 4 линейки красителей:

1. Капус Студио с рисовыми протеинами и экстрактом женьшеня, зелёная упаковка

2. Капус Профешнл, краситель для проф.использования в серебристой упаковке

3. Капус Гиалуроник - краситель с гиалуроновой кислотой, в бирюзовой упаковке

4. Капус Кератин - безаммиачный краситель с кератином, в коричневой упаковке

 

Капус Студио - самый бюджетный краситель марки. Проф - подороже, Гиалуроник и Кератин - самые дорогостоящие. Я понимаю, что чем дороже серия краски, тем дороже компоненты были добавлены туда производителем. И логично предположить, что чем дороже краситель, тем он лучше.

Однако, будучи очень восприимчивой к запахам, я хуже переношу краситель Проф, чем Студио, например. И даже обесцвечивающая пудра именно серии Студио, на мой взгляд, оказалась самой щадящей в плане запаха. И это отмечаю не только я, но и подруги, которым я осветляла волосы на разных видах пудр Капус и окрашивала волосы которых разными красителями этой марки.

Понимая, что краситель Студио может быть более жестким, я практически всегда добавляю улучшающие и смягчающие присадки при приготовлении красящей смеси. А по завершении процедуры окрашивания использую стабилизатор цвета и другие продукты. Таким образом, на линии Студио я добиваюсь результата на волосах не худшего, чем от красителя проф, и выше.

Любой может научиться работе с этим красителем, зная основные правила:

краситель + 3% окислитель для тонирования, затемнения и окрашивания тон-в-тон.

краситель + 6% окислитель для окрашивания седины и осветления натуральных волос на 1 уровень

и окислители 9,12% для более интенсивного осветления

Кстати, окислитель 12% желательно не использовать, по крайней мере без специальных добавок (плексов) он довольно сильно воздействует на волос, разрушая его.

В крайнем случае брать смесь 9% и 12%, получая в среднем 10,5 %

Но знаю, что частенько используется и 12% окислитель, после которого восстановить волосы сложно.

 

Хочется отметить экономичность использования красителя. Он разводится с окислителем 1 к 1,5, т.е на 30 гр.красителя, нужно взять 45 гр. окислителя. Можно взять и еще больше окислителя, если требуется разбавить цвет.

 

Очень нравится использовать блонды этой марки. Например, жемчужные розоватые оттенки 8.12, 9.12 хорошо блокируют желтизну, дают благородный цвет.

Если волосы светло-желтого лимонного цвета, для них достаточно взять 9.12. Если волосы довольно выраженного желтого цвета, то лучше воспользоваться 8.12. Или же миксовать их в разных соотношениях.

Вот, например, результат работы данного красителя на волосах (9.12 + 8.12)

 

В целом могу сказать, что краситель Капус Студио довольно стойкий, хорошо закрашивает седину, хорошо осветляет в случае необходимости, не имеет резкого химического запаха, как у некоторых других. А при использовании присадок еще и оставляет волосы в очень хорошем состоянии.

 

А вот окрашивание с помощью красителей капус, которое я выполнила себе сама:

Краска для волос Kapous Studio с экстрактом женьшеня и рисовыми протеинами - «Мои мытарства в мире красителей. Подробный разбор нескольких оттенков одной краски. Фото будет очень много, при разном освещении. Стойкость на седых волосах. »

Доброго времени суток, дорогие друзья!

 

Хочу наконец подробно, насколько смогу, рассказать о длительном опыте использования краски для волос с экстрактом женьшеня от Капус.

А опыт использования- это уже немногим больше двух лет)))

 

Итак, без долгой предыстории перейду прямо к делу.

 

Начну с краткого обзора, что из себя представляет крем-краска для волос с экстрактом женьшеня и рисовыми протеинами Studio Professional.

 

Крем- краска объемом 100 мл в картонной лаконичной упаковке.

Внешний вид

 

Вот так вы можете встретить их в магазинах, номерами тонов к покупателям:

 

 

Тюбик металлический, с плотно закручивающейся крышкой.

Крем- краска Капус

 

Палитра красок Капус с экстрактом женьшеня и рисовыми протеинами содержит ряд натуральных оттенков, дополненных подтонами, а также ряд ультра- светлых, или осветляющих красок.

 

Отличие в том, что ультра- светлые краски разводятся в соотношении 1 к 2 с оксидом. Это указано на упаковке:

Ультра- светлые тона. Смешиваем с оксидом 1:2

 

А остальные в пропорции 1 к 1.5. Т.е. на 100 мл краски нам нужно 150 мл оксида.

 

Смешивание с оксидом 1 :1. 5

И продаются они уже с соблюдением этих условий: тюбик краски 100 мл, а флакон оксида - 150. Для тонировки длины я обычно использую весь объем. При окраске корней - мне хватает с лихвой половины. Оксиды, которыми пользуюсь на постоянной основе - покупаю флаконы 1000 мл, так выгоднее.

 

Инструкция по применению находится внутри коробки. Ее нужно аккуратно разорвать. Фото оставлю внизу.

 

Купить краску можно в точках продаж профессиональной косметики.

Цена тюбика крем- краски 5 BYN (это примерно 2, 50 USD или 155 RUB). Оксида 150 мл - 1,50 BYN. Литровой бутылки 5-7 BYN.

 

Ну и помимо краски и оксида для окрашивания нам понадобятся следующий набор:

- неметаллическая емкость для смешивания;

- старое полотенце или накидка для защиты кожи и одежды;

- удобная для вас кисточка для нанесения;

- перчатки;

- расческа с острым концом и редкими зубьями для отделения и прочесывания прядей;

- заколки- крокодилы для разделения волос на зоны;

- пленка - это нужно мне, чтобы покрывать окрашенные волосы для недопущения пятен или окрашивания темным осветленных волос.

 

Отмерять крем- краску очень просто. На тюбике есть маркировка объема:

 

 

А для эмульсии я использую обычный мерный стаканчик

 

Отмерять легко, а вот выдавить сложно.

Крем- краска имеет довольно густую консистенцию. выдавить из тонкого горлышка - надо приложить усилия.

Оттенок 5.0

 

То, что оксид покупается отдельно- это плюс профессиональных красок, ведь мы можем выбирать сами процент окислительной эмульсии в зависимости от состояния волос и желаемого оттенка.

Но соответствующего марке краски оксида часто не бывает, приходится брать из других серий. Но, главное в рамках одного бренда, поэтому казусов не возникало.

Оксиды одинаковые по консистенции, жидковатые. Но при смешивании получается однородная кремовая масса.

Мешаю 5. 0

 

Краска легко наносится, распределяется, не течет:

 

Последнее окрашивание корней 5.0

 

Волосы разделяю на зоны, наносить краситель начинаю с затылочной части. После прокрашивания покрываю пленкой, на которую опускаю следующую прядь. И так по всей голове.

 

Составы у красителей различаются. Я оставлю их внизу, чтобы не загромождать отзыв. Хотя, вы должны знать и понимать - это чистой воды химозная субстанция. Я в этот состав даже не вглядываюсь. Если не красите волосы - лучше и не начинайте) Хотя, седина вылезет - все равно придется...

 

Описание и инструкция по окрашиванию:

 

Крем-краска для волос со сбалансированной системой компонентов обеспечивает стойкий результат окрашивания на долгое время натуральным, седым и ранее окрашенным волосам. Обновленная формула красителя включает в состав экстракт женьшеня и рисовые протеины, увлажняющие и ухаживающие компоненты, которые обеспечивают максимальную стойкость цвета и блеска, защиту от УФ-лучей и исключительное качество волос. Краситель бережно окрашивает волосы, надежно защищая их структуру по всей длине, придает ухоженный вид, многогранный блеск и здоровое сияние на продолжительное время.

Способ применения: Все оттенки основной палитры смешиваются с окислителями «Actiox» (1,5%, 6%, 9%, 12%). В неметаллической емкости смешать крем-краску с окислительной эмульсией в пропорции 1:1,5, например, 50 г красителя и 75 г окислителя необходимого процента (в зависимости от исходного цвета волос). При использовании крем-красок ультрасветлых оттенков необходимо смешать краситель с окислителем в пропорции 1:2 (50 мл крем-краски и 100 мл окислительной эмульсии). При окрашивании волос крем-краской «Studio Professional» время выдержки составляет 30-55 минут, для ультрасветлых оттенков – 50-55 минут (в зависимости от рефлекторного ряда), в противном случае краситель не проявится полностью, результат не будет устойчив на волосах.

 

Тон 5.0. "Светло- коричневый" и тон 903 "Ультра светлый золотой блонд".

Эти два оттенка я буду рассматривать в паре, потому как больше всего времени я проходила с ними, периодически обновляя.

В начале 2017 года я решила замутить себе модное окрашивание балаяж. Для реализации этой идеи мною были куплены красители Капус в оттенках 5.0 для корней и 903 для длины и окисляющая эмульсия 6 % для двух красителей.

База перед началом была примерно 8-9 уровня, крашеные в светлые тона волосы. Как мы это делали, я подробно описывала здесь.

 

Результат получился вот такой.

Корни 5.0, длина 903. Электрический свет.

 

Краска легла ровно, без пятен. Вопреки моим страхам темный оттенок не дал нежданных оттенков в виде зеленцы там, где он попадал на светлые волосы.

 

После полученного результата я перешла на такую схему:

1) окрашивание корней 1 раз в месяц: оттенок 5.0 + 6 % оксид.

2) тонирование длины раз в 2-3 месяца: оттенок 903 + 1,5 % оксид.

 

Оттенки теплые, естественные. Очень гармонируют между собой.

Корни 5.0, длина 903 . Дневной свет.

Капус рекомендует при окрашивании волос тон в тон использовать 3 % оксид, но я уже имею приличное количество седых волосков, поэтому беру оксид повыше, чтобы краситель глубже проникал в волос и не вымывался.

 

Вот фото корней волос, ранее окрашенных оттенком 5.0 и отросших. Граница отросших видна по седым волоскам. Дневной свет:

 

Корни неокрашенные 5 уровня с сединой, ниже окрашены 5.0

 

Свежеокрашенные, со вспышкой:

 

Корни 5.0

 

Краска придает волосам больше блеска.

 

В общем то, большую часть времени этими двумя оттенками я пользовалась на протяжении двух лет.

Оттенок 5.0 я использовала, когда решила закрасить всю длину в одинаковый цвет.

 

 

В этом случае я взяла 3 % окислительную эмульсию, потому как осветленные волосы легко поддаются тонированию, темный цвет резко и на высоком оксиде мог дать зелень.

Получился приятный светло- коричневый оттенок, на солнце отливающий золотинкой.

Для окончательного выравнивания мне нужна была еще одна покраска, но я посмотрела на себя в темном цвете...и не захотела продолжать. Я вернулась к светлому.

 

Обратите внимание, пигмент с осветленных волос со временем вымывается. И при окрашивании темным оттенком корней пористые волосы впитывают в прямом смысле "на ходу" темный пигмент. И с течением времени длина становится темнее.

 

Корни 5.0 длина 903

Тогда я ее тонировала 903 оттенком с оксидом 3 % без покрытия минут на 40.

Оттенок 903 - из серии осветляющих оттенков. Когда волосы отрастали,светлые пряди уходили вниз, я их "протягивала" вверх именно этим оттенком. Брала 6 % эмульсию, разводила 1 к 2, наносила на пряди, которые нужно было поднять на час под фольгой. Пусть не ахти как она осветляла крашеные ранее в темный волосы, но получалось неплохо, с протяжкой.

Корни 5.0, длина 903, поднимала светлые пряди 903 + 6 % оксид

 

Тон 5.81 "Светлый коричнево- пепельный".

Этот оттенок я купила для того, чтобы придать корням немножко "холодинки", о наличии которой говорит цифра после точки (обозначает подтон).

Здесь меня ждал нежданчик:

Корни 5.81, ниже 5.0. Видна разница. Дневной свет

 

Корни получились светлее ранее окрашенных в 5.0 и вскоре я их закрасила в привычный оттенок.

Получается, что основные оттенки с подтонами идут светлее натурального тона. Это необходимо учитывать.

 

Тон 4.1 "Пепельно- коричневый".

Однажды, когда пришла пора красить корни, в моем любимом магазине не оказалось оттенка 5. 0. Учитывая вышеописанный опыт я решила взять 4.1. Т.е. основным тоном ниже, но с подтоном, чтобы он был между 4.0 и 5.0.

Получилось вот как:

Корни 4.1

 

Цвет насыщенный, натуральный, без теплых переливов (видимо тут пепел сработал). Все же немного темнее 5-ки, но мне понравилось.

 

Была попытка смешать 4.1 и оставшиеся 5.81.

Получилось светлее и 4- ех, и 5-ти, но лучше, чем 5.81 соло.

Корни 5.81 + 4.1 поровну все равно стали светлее 5.0

 

Из этого я извлекла урок: темные оттенки, особенно с подтонами, не мешать!

 

Мой оттенок для корней однозначно 5.0. Ну 4.1 мне тоже понравился, но он все же темнее моих натуральных, разница при отрастании видна больше.

 

Тон 9.13 "Очень светлый холодный бежевый блонд".

То же приподнес мне сюрпрайз. Но, в принципе виновата я сама. Я не правильно его подобрала.

Этот оттенок я покупала перед вторым осветлением. Он в линейке светлых оттенков не является ультра- осветляющим, т.е его нужно класть на чистую осветленную базу 9- го уровня, а у меня такой не вышло(((

База была такая оранжевая выше, желтая ниже. Неладное я почувствовала уже минут через 10- 15 после нанесения: волосы здорово потемнели.

Оттенок 9.13

Держать больше я не решилась и пошла смывать.

Получился вот такой оттенок, с зеленцой:

Оттенок 9.13 так лег после осветления на базу 8-9 уровня

 

Ох, я сразу его рынулась смывать))) И масла наносила на ночь, и томатную пасту наносила, и ШГО помыла волосы. Благо, волосы были только после осветления супрой, так что побледнел оттенок быстро.

 

Оттенок 5.81

Зеленца подсмылась, волос стал пустой и я его перетонировала уже привычным мне 903 оттенком. Получилось вот что:

 

Тон 921 "Ультра- светлый фиолетово пепельный блонд".

И вот наконец я после третьего осветления я получила чистую светло- желтую базу 9 уровня.

Оттенок 921 купила из- за присутствия подтонов 2 (фиолетовый) - против оранжевого тона базы, (1 (пепел) - против желтизны.

Держала на волосах минут 20. Результат:

Оттенок

 

Вот, это было уже ближе к тому, к чему я стремилась.

 

Корни 4.0, длина 921

По истечении 2-ух недель оттенок потеплел и стал таким:

Оттенок 921

 

Тон 911 "Ультра- светлый серебристо- пепельный блонд".

 

Наносила как обычно, по линиям осветленных волос.

Тонирование 9.11 в процессе

 

Рекомендую покупать в аптеке латексные перчатки, ими удобно работать, особенно если нужно руками подмочь, и они прочнее.

Красавчик! С оксидом 1.5 % и выдержкой 40 минут я получила цвет серебристый металлик!

Оттенок 911

 

Вот по длине, сразу при дневном свете:

 

911 свежеокрашенный дневной свет

И вечером со вспышкой:

Длина 911

 

В конце приведу несколько фотосравнений.

 

Это корни при дневном свете. Оттенки 5.81 - 5.0 - 4.1:

5.81 - 5.0- 4.1 соответственно. Дневной свет

Со вспышкой в том же порядке:

5.81 - 5.0- 4.1 соответственно.Вспышка

 

Длина волос, оттенки 921 и 911:

921 - 911

 

Длина волос. Оттенки 921 и 911 - немного подсмытые:

921 - 911 дневной свет

 

Вот в принципе все оттенки, которыми я пользовалась.

Некоторые правила окрашивания, которые я сама себе определила:

- при окрашивании корней в темный цвет мою и подсушиваю голову. Так легче разбирать и прокрашивать корни, краска легче распределяется, оттенок ложится ровно;

- темным крашу корни, выдерживаю около получаса, расческой с редкими зубьями прочесываю немного по отросшим темным, это позволяет делать переходы незаметным (не сыграло это только с красителем 5. 81, т.к. он оказался светлее). Выдерживаю еще минут 7-10 и смываю;

- в темную краску добавляю каку- нибудь ампулу для кожи головы;

- тонирую светлые волосы не мытые и сухие. В краску добавляю какое- нибудь масло. Сразу это было аргановое масло от капус, которое по описанию не влияет на результат окрашивания в плане оттенка, но укрепляет волос. Сейчас оно дорогое, жду акции. Попробовала добавить фруктис, шорошо зашло. Последние осветления им пользовалась. В идеале пора бы купить плексы, попробовать.

- уход за длиной волос усиленный. Но это не секрет.

 

Итак, волосы мои. У моих волос все в принципе в порядке. Почти.

 

Те, которые темные, вообще прекрасно себя чувствуют: блестят, переливаются, крепкие)))

 

Корни 4.0 электрический свет без вспышки

Со светлыми посложнее. Если в уходе что не нравится, кончики топорщатся, сухие.

 

Кончики сегодня. После всех окрашиваний и осветлений. Сухие, местами начинают сечься. Катастрофического ничего нет.

Работаю с ними, люблю их, холю и лелею! Недавно читала, что осветленные волосы не блестят. Не знаю, у меня все блестит! И со вспышкой и без. Даже пока еще несмывашки не нанесла, все равно блестит.

 

Длина 911 без вспышки дневной свет:

Длина 911

 

Длина 911 без вспышки электрический свет:

 

Оттенок 911 без вспышки электрический свет

На солнышке, недели через две после тонирования оттенком 921:

 

Длина 921 смытая после третьего осветления

 

Стойкость на седых волосах.

Вопреки всем негативным отзывам хочу сказать, что краска не вымывается с седых волос. Это очень здорово видно по волоскам, которые я вам покажу. С последней покраски корней прошло 20 дней. Видно, что седой волосок здорово отрос, а окрашенный не стал вновь седым.

Седые волосы. Видно, что окрашенные ранее не вымылись.

 

И на фото выше, где мои отросшие корни с сединой, тоже хорошо видна граница, где седой волосок окрашивался ранее и не отличается от основной массы волос.

 

Теперь обобщу все же все вышеописанное.

 

Крем-краску для волос с экстрактом женьшеня и рисовыми протеинами Studio Professional рекомендую.

1) Она хорошо прокрашивает волосы;

2) Стоит недорого. Выходит дешевле в два раза мало- мальски приличной краски из масс;

3) Разобраться в оксидах и пропорциях очень просто;

4) Сколько бы вы не красились, вы останетесь с волосами в любом случае. Здраво подходите к выбору оксида. К слову, 9 %, а уж тем более 12 % я ни разу не использовала. Для непрофессионала это может закончится плачевно;

5) Качество осветленных волос прилично лучше, чем некогда от моей горячо любимой Гарньер 111 тон.

 

Ну, без минусов тоже не обошлось.

1) Некоторые оттенки могут давать неожиданный результат. Поэтому, если вы не профи и не знаете теорию, выбирайте естественные тона, а не пытайтесь мутить с подтонами.

2) Сразу после нанесения подпекает кожу головы, через несколько минут все проходит. Бывало и похуже, оценку не снижаю.

3) Если переходить по времени, кожа на затылке начинает зудеть. Там наносится раньше всего, поэтому по времени получается краситель с кожей воздействует больше всего. Раздражение проходит через пару дней. К сожалению, у нас что- то пропал Эстель ХЭК, с ним такого не было.

4) В светлых холодных тонах быстро вымывается "пепел", остается светлый теплый блондин. Поэтому тоника - как у всех) Но я обхожусь, мне и так нравится.

 

Пожалуй, на этом закончу. Спасибо за внимание!

 

Корни 5.0, длина 903 у окна дневной свет

Красивых волос вам )))))

какие салфетки действительно пригодны для смывания, биоразлагаемые, компостируемые

Производственная среда

Партнер по сотрудничеству

Красивые столовые салфетки с вязаной каймой своими руками . ..- какие салфетки действительно пригодны для смывания, биоразлагаемые, компостируемые ,Nov 28, 2015·Красивые столовые салфетки можно сделать своими руками из обычной простой салфетки из ткани, пришив вязаную кайму или кружево. Вязаный держатель столовых салфетокСалфетки на свадебный стол - как сделать фигуры своими …Салфетки для свадебного стола могут различаться по следующим критериям: Размеру. Существуют варианты с размерами 35х35 см — 45х45 см, они идеально подходят для завтрака, обеда или ужина.

Чистый дом - легко и просто! Заходите в темку, гости ...

Nov 08, 2014·Реєстрація 16 березень 2009 Звідки Ви Чистоголикom.ua, viber 068-788-24-14 Дописів 79 378

Чистый дом - легко и просто! Заходите в темку, гости ...

Nov 08, 2014·Реєстрація 16 березень 2009 Звідки Ви Чистоголикom.ua, viber 068-788-24-14 Дописів 79 378

Все ли влажные салфетки дезинфицируют? Какие лучше?

Не все салфетки обладают дезинфицирующим эффектом. Для примера могу сказать, что существуют гигиенические салфетки. Если говорить про эти салфетки…

Капус зеленая упаковка палитра: Палитра красок для волос ...

Капус зеленая упаковка палитра: Палитра красок для волос Kapous Professional Hyaluronic Acid 09.03.2021 07.05.2021 alexxlab Содержание

Бьюти-гигиена: 7 правил безопасного хранения косметики

Игнорировать мелочи, которые магазины сознательно размещают у кассы, действительно сложно: тканевые маски и влажные салфетки внезапно …

Чистый дом - легко и просто! Заходите в темку, гости ...

Nov 08, 2014·Реєстрація 16 березень 2009 Звідки Ви Чистоголикom.ua, viber 068-788-24-14 Дописів 79 378

Бьюти-гигиена: 7 правил безопасного хранения косметики

Игнорировать мелочи, которые магазины сознательно размещают у кассы, действительно сложно: тканевые маски и влажные салфетки внезапно …

Влажные салфетки – виды, польза и вред

Влажные салфетки создают больше вреда, чем пользы. Все, что созданно на земле из искуственных предметов, создано человеком, который много думал над своим творением.

Влажные салфетки для уборки | Cleanipedia

Oct 13, 2020·влажные салфетки для уборки пола позволяют лишний раз не тянуться за шваброй, к тому же делают процесс гигиеничнее — собранную грязь можно вместе с салфеткой отправить в мусорное ведро;

Чистый дом - легко и просто! Заходите в темку, гости ...

Да Салфетки для кожи Баги тоже очень понравились. За губку спасибо, кстати из вашей листовки узнала что ей можно кожаный диван мыть. ... Если какие …

Чистый дом - легко и просто! Заходите в темку, гости ...

Да Салфетки для кожи Баги тоже очень понравились. За губку спасибо, кстати из вашей листовки узнала что ей можно кожаный диван мыть. ... Если какие …

Салфетки: на стол, бумажные, под приборы | H&M RU

САЛФЕТКИ У нас вы найдете бумажные и текстильные салфетки всевозможных размеров и расцветок. Приобретайте красивые салфетки изо льна, сочетающиеся с держателями и кольцами для …

Капус зеленая упаковка палитра: Палитра красок для волос .

..

Капус зеленая упаковка палитра: Палитра красок для волос Kapous Professional Hyaluronic Acid 09.03.2021 07.05.2021 alexxlab Содержание

Капус зеленая упаковка палитра: Палитра красок для волос ...

Капус зеленая упаковка палитра: Палитра красок для волос Kapous Professional Hyaluronic Acid 09.03.2021 07.05.2021 alexxlab Содержание

Чистый дом - легко и просто! Заходите в темку, гости ...

Nov 08, 2014·Реєстрація 16 березень 2009 Звідки Ви Чистоголикom.ua, viber 068-788-24-14 Дописів 79 378

Замок почтовый заменить: Как заменить замок на почтовом …

Содержание Как заменить замок на почтовом ящикеЧто вам понадобится:Как заменить замок на ...

Чистый дом - легко и просто! Заходите в темку, гости ...

Да Салфетки для кожи Баги тоже очень понравились. За губку спасибо, кстати из вашей листовки узнала что ей можно кожаный диван мыть. ... Если какие …

Чистый дом - легко и просто! Заходите в темку, гости ...

Да Салфетки для кожи Баги тоже очень понравились. За губку спасибо, кстати из вашей листовки узнала что ей можно кожаный диван мыть. ... Если какие …

Замок почтовый заменить: Как заменить замок на почтовом …

Содержание Как заменить замок на почтовом ящикеЧто вам понадобится:Как заменить замок на ...

Бьюти-гигиена: 7 правил безопасного хранения косметики

Игнорировать мелочи, которые магазины сознательно размещают у кассы, действительно сложно: тканевые маски и влажные салфетки внезапно …

Какие лучше влажные салфетки для новорожденных ...

Влажные салфетки – вещь незаменимая, особенно если в доме есть маленький ребенок. Их можно взять с собой на прогулку, упаковка не займет много места. Влажные салфетки помогут молодой и неопытной маме успешно ...

Капус зеленая упаковка палитра: Палитра красок для волос ...

Капус зеленая упаковка палитра: Палитра красок для волос Kapous Professional Hyaluronic Acid 09.03.2021 07.05.2021 alexxlab Содержание

Декоративные салфетки на стол: разновидности и .

..

Apr 06, 2020·Какие бывают декоративные салфетки на стол и в чем их преимущества? Об этом вам расскажет «Рушничок» - оптовый поставщик домашнего текстиля в Украине.

Замок почтовый заменить: Как заменить замок на почтовом …

Содержание Как заменить замок на почтовом ящикеЧто вам понадобится:Как заменить замок на ...

Крем-краска для волос с рисовыми протеинами Kapous Studio Professional

Описание

Крем-краска для волос со сбалансированной системой компонентов обеспечивает стойкий результат окрашивания на долгое время натуральным, седым и ранее окрашенным волосам.

Обновлённая формула красителя включает в состав экстракт женьшеня и рисовые протеины, увлажняющие и ухаживающие компоненты, которые обеспечивают максимальную стойкость цвета и блеска, защиту от УФ-лучей и исключительное качество волос.
Краситель бережно окрашивает волосы, надежно защищая их структуру по всей длине, придает ухоженный вид, многогранный блеск и здоровое сияние на продолжительное время.

Окрашивание волос крем-краской «Studio Professional»:
В неметаллической емкости смешать крем-краску с окислительной эмульсией ActiOx в пропорции 1:1,5, например, 50 гр красителя и 75 гр окислителя необходимого процента (в зависимости от исходного цвета волос).

При использовании крем-красок ультрасветлых оттенков необходимо смешать краситель с ActiOx в пропорции 1:2 (50 мл крем-краски и 100 мл окислительной эмульсии).

При окрашивании волос крем-краской Studio Professional время выдержки составляет 30-55 минут, для ультрасветлых оттенков - 50-55 минут (в зависимости от рефлекторного ряда), в противном случае краситель не проявится полностью, результат не будет устойчив на волосах.

Цветовая палитра:
(желаемый цвет указывайте в комментариях к заказу)

01 усилитель пепельный
02 усилитель фиолетовый
03 усилитель золотой
04 усилитель медный
06 усилитель красный
07 усилитель синий

1.0 черный
1.10 иссиня-черный

10.0 платиновый блонд
10.02 перламутровый блонд
10.1 пепельно-платиновый блонд
10.23 бежевый перламутрово-платиновый блонд
10.31 бежевый платиновый блонд

1000 прозрачный

3.0 темно-коричневый

4.0 коричневый
4.03 коричневый теплый
4.1 пепельно-коричневый
4.12 коричневый пепельно-перламутровый
4.20 фиолетово-коричневый
4.3 золотисто-коричневый
4.35 какао
4.4 медно-коричневый блонд
4.5 темный махагон
4.75 коричневый махагон
4.81 коричнево-пепельный

5.0 светло-коричневый
5.03 теплый светло-коричневый
5.07 насыщенный холодный светло-коричневый
5.1 светлый пепельно-коричневый
5.12 светл-коричневый пепельно-перламутровый
5.20 светлый фиолетово-коричневый
5.23 светло-коричневый бежево-перламутровый
5.3 светлый золотисто-коричневый
5.31 темный табак
5.4 светлый медно-коричневый
5.43 светло-коричневый медно-золотой
5.5 махагон
5.62 светло-коричневый красно-фиолетовый
5.64 светло-коричневый красно-медный
5.75 светло-коричневый махагон
5.8 шоколад
5.81 светлый коричнево- пепельный

6.0 темный блонд
6.03 теплый темный блонд
6.07 насыщенный холодный темный блонд
6.1 темный пепельный блонд
6.13 темно-бежевый блонд
6.15 темный пепельно-махагоновый блонд
6.23 темный бежево-перламутровый блонд
6.26 темный фиолетово-красный блонд
6.3 темный золотой блонд
6.31 табак
6.32 темный золотисто-перламутровый блонд
6.34 темный золотисто-медный блонд
6.4 темный медно-коричневый блонд
6.43 темный медно-золотой блонд
6.45 темный тициановый блонд
6.46 темный медно-красный блонд
6.5 темный махагоновый блонд
6.62 темный красно-фиолетовый блонд
6.64 темный красно-медный блонд
6.66 интенсивный темно-красный блонд
6.8 каппучино
6.81 темный коричнево- пепельный блонд
6.85 темный коричнево-махагоновый блонд

7.0 блонд
7.03 теплый блонд
7.04 розовый блонд
7.07 насыщенный холодный блонд
7.1 пепельный блонд
7.13 холодный бежевый блонд
7.23 бежевый-перламутровый блонд
7.3 золотой блонд
7.31 светлый табак
7.32 золотисто-перламутровый блонд
7.33 интенсивный золотой блонд
7.4 медно-коричневый блонд
7.43 медно-золотой блонд
7.44 интенсивный медный блонд
7.45 тициановый блонд
7.46 медно-красный блонд
7.62 красно-фиолетовый блонд
7.66 интенсивный красный блонд
7.8 карамель
7.81 коричнево-пепельный блонд

8.0 светлый блонд
8.03 теплый светлый
8.07 насыщенный холодный светлый блонд
8.1 светлый пепельный блонд
8.12 светлый пепельно-перламутровый блонд
8.13 светлый холодный бежевый блонд
8.23 светлый бежевый-перламутровый блонд
8.3 светлый золотой блонд
8.34 светлый золотисто-медный блонд
8.4 светлый медно-коричневый блонд
8.43 светлый медно-золотой блонд
8.44 интенсивный светлый медный блонд
8.45 светлый тициановый блонд
8.66 интенсивный светло-красный блонд

9.0 очень светлый блонд
9.02 очень светлый прозрачно-фиолетовый блонд
9.07 насыщенный холодный очень светлый блонд
9.1 очень светлый пепельный блонд
9.12 очень светлый пепельно-перламутровый блонд
9.13 очень светлый холодный бежевый блонд
9.2 очень светлый фиолетовый блонд
9.21 очень светлый фиолетово-пепельный блонд
9.22 очень светлый перламутровый блонд
9.23 очень светлый бежевый перламутровый блонд
9.26 очень светлый розовый блонд
9.3 очень светлый золотой блонд
9.44 интенсивный очень светлый медный блонд

Специальный блонд
900 суперосветляющий натуральный блонд
901 суперосветляющий пепельный блонд
902 суперосветляющий фиолетовый блонд
903 ультра-светлый золотой блонд
911 суперосветляющий серебр-пепел. Блонд
913 ультра светлый бежевый блонд
921 суперосветляющий фиолетово-пепел.блонд
923 ультра - светлый перламутровый блонд

пустые влажные салфетки упаковка подушечек многоразового использования

Производственная среда

Партнер по сотрудничеству

Контейнеры для анализов одноразовые | Купить по оптовой ...- пустые влажные салфетки упаковка подушечек многоразового использования ,Контейнер для анализа - контейнеры для сбора биоматериалов, предназначен для сбора и транспортировки на исследования общеклинических анализов и других биологических материалов в медицинских учреждениях (больницы ...Алкоголь оптом в Самаре. Купить Недорого у Проверенных ...Tiu.ru — товары и услуги в Самаре. Потребительские, промышленные и оптовые товары - все для вашего бизнеса, быта и отдыха!

Купить в КАН-Тэррии - Клейкие квадраты двухсторонние ...

Продажа качественной продукции в интернет-магазине КАН-Тэррия - «клейкие квадраты двухсторонние монтажные "kores gum fix" размер 1.5 х 1.5 х 0.5 мм 84 шт/упак». Товары для дома и офиса всегда в наличии.

Как оформить стеклянную банку своими руками: Страница не ...

Как оформить стеклянную банку своими руками: Страница не найдена — Обзор Посуды

Тканевая маска для лица Holika Holika makgeolli ...

Oct 23, 2016·Маска не предназначена для многоразового использования, вы же не кладете влажные салфетки обратно в упаковку после использования, это же как минимум не гигиенично.

Решаем вопросы по доставке воды для бойцов АТО

Jul 31, 2014·Адрес куда везти: 1. Карла Маркса 119а - пустые (новые и чистые б/у баклажки 5 и больше литров) и с водой (заводская упаковка) , ВЛАЖНЫЕ САЛФЕТКИ - обязательно сказать для АТО 2. Комсомольскую 58, ком 315(это если уже с водой ...

Julia's Blog

Apr 28, 2018·Влажные салфетки Рецепты бабушки Агафьи "Ягодные". Упаковка веселенькая) 20). Маска для лица Etude House AC Clean Up Mask Sheet. 21). Тканевая маска для лица FoodAHolic 3D-маска с экстрактом бамбука 3D Natural Essence Mask [Bamboo].

Каталог Дукат 2013 by Roman Shtogrin - Issuu

Feb 05, 2013·БЛАНК ЗАКАЗА № Артикул. Наименование. Ед. измерения. Количество. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 ...

Хирургическая и гигиеническая обработка рук медицинского ...

Приказ № 798 «ХИРУРГИЧЕСКАЯ И ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РУК МЕДИЦИНСКОГО ПЕРСОНАЛА» Утверждено Приказом Министерства здравоохранения Украины №798 от …

УКАЗАНИЯ ПО СОРТИРОВКЕ ОТХОДОВ

• Пустые банки из-под аэрозолей ... многоразового использования можно возвращать по-ставщику) • Фейерверки, оружие и патроны — обратитесь в поли- ... • Бумажные полотенца и салфетки

Аптечка первой помощи военная: что входит в набор средств ...

Аптечка первой помощи военная: что входит в набор средств медицинской самопомощи военнослужащего, предназначение, порядок и правила использования содержимого

Просмотр темы - 89СП АЛЬФА 812 - САМЫЕ ПОЛЕЗНЫЕ И ...

Влажные салфетки Мастер Блеск для Обуви из гладкой кожи, 15шт : 13: Включено в счет ...

Для салонов красоты и парикмахерских

Простыня 70х200, sms 15 г/м2 белая в рулоне 100шт. Полотенца 45х90 Спанлейс Европак (50 шт.). Пеньюары п/эт 100х160, (уп. 50 шт)

Влажные салфетки заказать и купить в интернет-магазине

Влажные салфетки оптом и в розницу купить в интернет-магазине по низким ценам. Доставка по Алматы и почтой по Казахстану.

Просмотр темы - 89СП АЛЬФА 812 - САМЫЕ ПОЛЕЗНЫЕ И ...

Влажные салфетки Мастер Блеск для Обуви из гладкой кожи, 15шт : 13: Включено в счет ...

Тканевая маска для лица Holika Holika makgeolli ...

Oct 23, 2016·Маска не предназначена для многоразового использования, вы же не кладете влажные салфетки обратно в упаковку после использования, это же как минимум не гигиенично.

Julia's Blog

Apr 28, 2018·Влажные салфетки Рецепты бабушки Агафьи "Ягодные". Упаковка веселенькая) 20). Маска для лица Etude House AC Clean Up Mask Sheet. 21). Тканевая маска для лица FoodAHolic 3D-маска с экстрактом бамбука 3D Natural Essence Mask [Bamboo].

Как почистить экран монитора в домашних условиях

Как почистить экран ноутбука в домашних условиях? Любому владельцу современной техники полезно знать, как почистить экран ноутбука. Ведь на него постоянно садится пыль, а иногда возникают и более серь...

Чем очистить монитор компьютера в домашних условиях ...

1. Влажные салфетки, предназначенные для чистки мониторов. Следите, чтобы они подходили для матриц tft tn, tft ips. Они должны быть изготовлены из безворсового материала.

Капус зеленая упаковка палитра: Палитра красок для волос ...

Капус зеленая упаковка палитра: Палитра красок для волос Kapous Professional Hyaluronic Acid 09.03.2021 07.05.2021 alexxlab Содержание

Товары и услуги в Владивостоке — портал Vladivostok.tiu.ru

Tiu.ru — товары и услуги в Владивостоке. Потребительские, промышленные и оптовые товары - все для вашего бизнеса, быта и отдыха!

Влажные салфетки - купить на cайте ОФИСМАГ. Недорого ...

Влажные салфетки - купить в ОФИСМАГ по низкой цене. Бесплатная доставка, большой выбор товаров для офиса! Низкие цены, акции, подарки. Участвуем в ЕАИСТ.

Контейнер для заготовки крови и ее компонентов | Купить по ...

Контейнер для заготовки крови и ее компонентов с целью последующего фракционирования ...

Сайт Покупок - Лейкопластыри, мед.товары, тесты и товары ...

Совместные закупки товаров у оптовиков - самый большой выбор, онлайн оплата прямо на сайте, быстрая доставка по всей России. Защита покупателей - официальное сотрудничество с организаторами.

Упаковка влажных салфеток: что нового? | Журнал «Сырье и ...

Упаковка влажных салфеток: что нового? ... Влажные салфетки для детей стали очень популярным и широко используемым средством. ... до момента их использования. Салфетки имеют размер 22х24 см и не ...

Хирургическая и гигиеническая обработка рук медицинского ...

Приказ № 798 «ХИРУРГИЧЕСКАЯ И ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РУК МЕДИЦИНСКОГО ПЕРСОНАЛА» Утверждено Приказом Министерства здравоохранения Украины №798 от …

Похожие сообщения

Случайные сообщения

Green Hulu Kapuas Kratom - Кратом Crazy

Green Hulu Kapuas происходит из листьев дерева Mitragyna Speciosa, растения из семейства кофе, которое содержит большое количество сильных алкалоидов и антиоксидантов. Зеленый цвет относится к насыщенному цвету жилок, которые проходят через каждый лист Mitragyna Speciosa (Kratom).

Алкалоиды, присутствующие в каждом штамме кратома, сильно различаются в зависимости от факторов окружающей среды. В случае Green Hulu Kapuas на его алкалоидный профиль влияет богатая минералами почва, в которой он выращен.Это приводит к появлению множества интересных алкалоидов в высоких концентрациях.

Где выращивают этот штамм кратома?

Наш Зеленый Хулу Капуас произрастает в лесу Хулу, который расположен недалеко от острова Борнео в Индонезии. Зеленый Хулу Капуас собирают фермерами на берегу реки Капуас, отсюда и его привлекательное название.

Сбор урожая Green Hulu Kapuas может оказаться затруднительным, поскольку близость деревьев к берегам реки Kapuas может привести к затоплению растений.Таким образом, Green Hulu Kapuas Kratom - более редкая форма кратома, чем другие сорта.

Продолжительность жизни

Green Hulu Kapuas составляет от 1 до 5 лет, и наши фермеры стараются обеспечить оптимальное созревание. Это еще один фактор, из-за которого не хватает Green Hulu Kapuas. Редкое население региона является еще одним препятствием, когда дело доходит до закупки Капуас Кратом, поскольку здесь мало фермеров, и еще меньше тех, кто понимает процесс выращивания.

Из-за сезонного сбора урожая мы можем хранить Green Hulu Kapuas только в течение ограниченного времени.Этим объясняется его цена и ограничения, которые мы должны наложить на наш объемный порошок Green Hulu Kapuas.

Насколько популярен Green Hulu Kapuas?

Всякий раз, когда вы имеете дело с сортом Кратом, который трудно найти, вокруг него будет много шума. Зеленый Хулу Капуас не исключение. Сообщество кратома открыто заявляло о его востребованности, и мы прислушивались к их просьбам добавить его в наш магазин.

Немногие поставщики могут достать премиальный высококачественный Hulu Kapuas Kratom, но нам это удалось.Используя нашу обычную политику контроля качества, нам удалось получить несколько исключительных Green Hulu Kapuas в течение ограниченного времени.

Судя по полученным электронным письмам, мы ожидаем, что это будет распродано раньше, чем позже, так что сейчас самое время разместить заказ на кратом.

Какие алкалоиды задействованы?

Химические компоненты Green Hulu Kapuas отличаются от большинства других штаммов Кратома наличием значительных объемов следующих активных алкалоидов:

  • Кориноксин
  • Коринантеидин
  • Изомитрафиллин
  • Митрацилиатин
  • Митрафилин
  • Paynanthein
  • Специофолин
  • Специоноксеин

Сколько стоит Green Hulu Kapuas Kratom?

Важно помнить, что этого несравненного и необычного сорта в лучшем случае мало.Редкость, с которой его выращивают, объясняет высокую стоимость его поставок из региона Хулу на Борнео. Технологии производства, используемые для доставки Green Hulu Kapuas, накладывают денежные ограничения на поставщиков.

Это имеет значение, когда дело доходит до цены Green Hulu Kapuas, потому что нет реального способа предложить его по цене более доступных сортов, таких как Maeng Da или Red Bali. Поэтому цена за унцию немного выше наших обычных цен. То же самое можно сказать и о покупке Green Hulu Kapuas оптом.

Например, упаковка из 50 капсул доступна по цене 35 долларов США по сравнению со средней стоимостью 20 долларов США, но для достижения желаемых результатов вам, возможно, придется принять сразу четыре таблетки. Потребители, которые решат приобрести наш порошок Green Hulu Kapuas, также обнаружат, что цена выше, чем у других наших порошков Kratom.

Порошок Кратом и капсулы Кратом

Многие клиенты предпочитают приобретать кратом в виде порошка, используя его для приготовления собственного чая из кратома. Порошок кратома позволяет пользователям отмерить количество тонко измельченного Mitgragyna speciosa, которое им подходит.

Кроме того, некоторые люди предпочитают покупать капсулы с кратомом, которые избавляют от необходимости пользоваться мерной ложкой. Здесь, в Kratom Crazy, наши капсулы кратома на 100% чисты, поскольку они находятся в вегетарианских капсулах.

Мы понимаем большой спрос на справедливые массовые цены, поэтому мы сделали оптовые поставки капсул кратома в нашем интернет-магазине. Вы выбираете штамм, мы готовим капсулы. Чем больше ты покупаешь, тем больше экономишь. Просто как тот.


ОТКАЗ ОТ ОТВЕТСТВЕННОСТИ НА ПРОДУКТ: НА ДАННОМ ВЕБ-САЙТЕ ИЛИ НА УПАКОВКЕ НЕ ПРЕДОСТАВЛЯЮТСЯ НАПРАВЛЕНИЯ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ИЛИ НАЗНАЧЕНИЮ.ПОЖАЛУЙСТА, СМОТРИТЕ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ ОБ ИМПОРТЕ FDA 54-14 ДЛЯ ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ИНФОРМАЦИИ О KRATOM. ДАННЫЙ ПРОДУКТ НЕ УТВЕРЖДЕН FDA. ДАННЫЙ ПРОДУКТ НЕ ПРЕДНАЗНАЧЕН ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ, ЛЕЧЕНИЯ, ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ЛЮБЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.

Зеленый малайский кратом - полное руководство

Что такое Кратом?

Кратом дерево - вечнозеленое тропическое дерево, которое растет в Юго-Восточной Азии в таких странах, как Борнео, Таиланд и Малайзия. Кратом имеет большие зеленые листья и ценится за его приспособляемость.

В традиционных условиях жители Юго-Восточной Азии приняли Кратом в свои общины на сотни лет.Традиционно жеванный или завариваемый в горький чай, чернорабочие использовали лист Кратома, чтобы вдохновить мотивацию на долгие дни, а общины используют его для усиления праздничной атмосферы во время местных обрядов.

Кратом был завезен на Запад в прошлом веке как растение, которое может дать множество преимуществ, в том числе повышенное внимание, спокойствие и мотивацию. Что отличает Кратом от других растений, так это встречающиеся в природе алкалоиды, особенно митрагинин, которые невероятно полезны для человека.

Green Malay , хотя и не из Малайзии, носит это название в целях брендинга. Мы решили назвать этот сорт зеленым малайским из-за его высокого содержания алкалоидов. Энтузиасты кратома, которые любят зеленый малайский, точно знают, насколько мощным может быть этот кратом с зеленой жилкой.

Различные штаммы

Как правило, существует три различных штамма Кратома - зеленый, красный и белый. Их можно смешивать для создания гибридных штаммов. У каждого сорта есть свой результат, и, в зависимости от вашей цели, знание того, что вам больше всего нравится, может помочь вам решить, какой тип Кратома подходит для вашего образа жизни.

Красная жилка Кратом способствует умиротворению и умиротворению и может помочь вам развить более медитативный и позитивный настрой. Кратом с белыми прожилками дарит ощущение благополучия и оптимизма, а также позволяет провести день. Кратом с зеленой жилкой обеспечивает мотивацию и помогает сосредоточиться на том, что нужно делать в течение напряженного дня.

Гибридные смеси обладают преимуществами более чем одного сорта Кратома. Например, белый и зеленый кратом способствует большей внимательности и общему балансу, а их сочетание раскрывает их индивидуальные качества.

Зеленый малайский кратом

Зеленый малайский Кратом - один из самых востребованных видов кратома из-за его способности выживать в неблагоприятных условиях окружающей среды и долговечности его листьев.

Kats Botanicals ’ Green Malay Кратом выращивают в регионе Нибунг в Индонезии. Сначала с листьев удаляют стебли, а затем листья сушат в течение примерно одного дня в помещении. Это 100% зеленый жильный Кратом.

Зеленый малайский имеет одну из самых высоких концентраций алкалоидов.Эти природные соединения делают Кратом таким полезным растением. Он растет в густых тропических джунглях и использовался индонезийцами на протяжении веков, помогая, например, сосредоточиться и упорствовать в длительных путешествиях. Ценители кратома рекламируют способность этого сорта сохраняться долгое время как при хранении, так и в результате. По этой причине это один из самых экономичных сортов на рынке.

Green Malay может похвастаться 40 активными алкалоидами в своем химическом составе, а также имеет более высокую концентрацию митрагинина, алкалоида с наиболее сильным влиянием.

Он также имеет более значительную концентрацию другого алкалоида - 7-гидроксимитрагинина. Сочетание высоких уровней этих незаменимых алкалоидов приводит к сильному результату, что делает этот штамм одним из самых востребованных во всем мире.

Обратите внимание на дозировку

Одним из важнейших элементов включения Кратома в ваш оздоровительный режим является выбор дозировки. Доза для Кратома составляет 2,4 грамма, но не более двух доз за один 24-часовой период.Так как Green Malay , в частности, содержит так много активных алкалоидных компонентов, очень важно начать с малого и найти идеальную дозировку, чтобы вы могли наслаждаться или улучшать общее самочувствие.

Начните с одного грамма и задокументируйте любые улучшения вашего самочувствия. Добавляйте в дозировку по полграмма за раз и наблюдайте. В какой-то момент вы найдете идеальный баланс, чтобы улучшить самочувствие в течение дня.

Green Malay Кратом уникален тем, что дает разные результаты в зависимости от размера дозировки.На более низких уровнях это напряжение наполняет чувство спокойствия; в более крупных этот штамм обеспечивает улучшенное познание и концентрацию внимания. В зависимости от того, какие преимущества вы хотели бы получить от Кратома, вы можете подобрать идеальную дозировку после небольших корректировок.

Хранение и использование

Хотя чай - один из самых популярных способов употребления Кратома, многие поклонники Западного Кратома отказываются от сильного травяного вкуса Кратома. С появлением порошка Кратома и возможностью потребителей делать капсулы Кратома горький вкус стал легче.

Многие пользователи Кратома добавляют порошкообразный Green Malay Kratom в смузи и продукты, такие как яблочное пюре, которые могут маскировать вкус. В общем, любая еда или напиток, в которые могут быть добавлены другие специи и травы, являются отличным кандидатом в качестве средства для порошка Кратома, поскольку вы можете использовать добавки с сильным вкусом, чтобы скрыть вкус.

Еще один невероятно полезный метод приема Кратома - это капсулы. Вы можете приготовить капсулы Кратома из любого штамма, который вам нравится. Капсулы полностью лишены вкуса, они незаметны, удобны, и вы можете легко изменить дозировку.Вы можете брать их с собой в дорогу, чтобы улучшить самочувствие, независимо от того, где вы находитесь в повседневной жизни.

Для хранения Кратома, будь то порошок или лист, выберите темное, сухое место с равномерной температурой. Главные враги долголетия вашего Кратома, даже если он известен как один из самых стойких сортов, таких как green Malay , - это сырость, свет и кислород. Храните его в темных плотно закрытых контейнерах или в полиэтиленовых пакетах, вдали от солнечного света и влаги.

Если вы только начинаете свое путешествие по Кратому, выберите подходящий для вас способ приема пищи и храните Кратом надлежащим образом.

Контроль качества

Зеленый малайский Кратом - один из самых сильнодействующих сортов. Kats Botanicals поддерживает тесные отношения с производителями и переработчиками Кратома по всей Юго-Восточной Азии и может гарантировать эффективность продаваемого ими Кратома.

Крайне важно придерживаться традиционных стандартов выращивания, сбора и сушки Кратома.Если вы собираете кратом слишком рано или слишком поздно, в листьях не будет так много активных алкалоидов. Воздействие на деревья Кратома большого количества тепла и солнца в последние недели перед сбором урожая может заставить дерево расти в неистовстве.

После сбора листьев переработчики Кратома создают различные сорта, подвергая листья определенному количеству (или отсутствию) солнечного света. В результате этого процесса получаются штаммы разного цвета, соответствующие названию штамма: зеленый, красный, белый или желтый.

Если у поставщика, кажется, нет хороших отношений с харвестерами и процессорами Kratom, вы можете поискать в другом месте.Те, кто не пользуется традиционными знаниями сообщества, могут не знать, когда собирать урожай или как точно сушить каждый штамм листьев.

Убедитесь, что выбранный вами поставщик Кратома использует стороннюю лабораторию для проверки своих продуктов на наличие примесей и качества. Внешнее тестирование обеспечивает непредвзятую химическую оценку продукта, поэтому вы знаете, что ваш Green Malay содержит 100% кратома и ничего больше.

Внешние лабораторные испытания также могут сказать вам, есть ли в продукте какие-либо примеси, такие как тяжелые металлы, пестициды или бактерии.Такой авторитетный поставщик, как Kats Botanicals, всегда предоставляет клиентам эти лабораторные результаты по запросу. Если партия Кратома не соответствует строгим стандартам тестирования Kats Botanicals, она выбрасывается.

Желтый кратом | Эффекты, штаммы и чем он отличается

Эффекты и преимущества

Если вы когда-либо пробовали купить кратом в Интернете , у вас, вероятно, были такие варианты, как зеленый, белый и красный кратом. Большинство пользователей кратома знают и любят один, если не все эти сорта кратома, поскольку они существуют с тех пор, как кратом был популярен.

Но что такое желтый кратом? Штаммы желтого кратома являются относительно новыми даже для самых опытных пользователей кратома, и поскольку энтузиасты кратома с нетерпением ждут включения еще одного сорта в свой список вариантов кратома, популярность желтого кратома быстро растет.

Что такое желтый кратом?

Желтый кратом - самая редкая форма кратома, доступная на рынке, и на самом деле существует несколько различных теорий относительно того, как именно этот кратом растет и в первую очередь производится.

Наиболее распространенный ответ заключается в том, что штаммы желтого кратома являются результатом использования другой техники сушки белого кратома и зеленых листьев, поскольку процесс сушки играет огромную роль в цвете листьев и содержании алкалоидов.

Но даже при том, что листья такие же, эффекты желтого кратома действительно различаются.

Эффекты желтого кратома

Эффекты желтого кратома часто сравнивают с эффектами зеленого кратома, хотя многие сообщают, что его эффекты немного более мягкие, что означает, что желтый кратом хорош для пользователей, плохо знакомых с миром кратома.

Некоторые другие преимущества желтого кратома включают:

- Избавление от дискомфорта

- Фокус

- Энергия

- Euphoria

- Улучшение настроения

Популярные сорта желтого кратома

Хотя желтый кратом редко, но быстро набирает обороты популярность благодаря популярным сортам, таким как:

Yellow Sumatra - эйфорический и стимулирующий, улучшающий настроение

Yellow Borneo - эйфорический и стимулирующий, избавляющий от дискомфорта

Yellow Malay - успокаивающий, стимулирующий, энергичный

Yellow Bali - использует белые и зеленые листья кратома Бали, предлагает баланс между глубоким рельефом кратома Rad Bali и бодрящим белым кратомом Бали

Yellow Vietnam - сильнейший сорт желтого кратома - эйфорический, стимулирующий, фокусирующий

Желтый Кратом от GRH

Grassroots Harvest выделяется среди кратома торговых площадок, поскольку мы упорно работаем над установлением отношений напрямую с этичными фермерами и производителями в странах Юго-Восточной Азии.Устанавливая эти конструктивные связи с поставщиками, мы можем предоставить энтузиастам кратома самый чистый кратом высочайшего качества.

Готовы найти кратом, который вам нужен? Ознакомьтесь с нашим ассортиментом сегодня!

Капсулы Red Kapuas Kratom - Purkratom

Наши самые продаваемые капсулы Red Kapuas обладают мягким успокаивающим действием, которое идеально подходит для тех, кто испытывает стресс и недостаток сна. Его расслабляющие свойства могут успокоить разум, улучшить настроение и улучшить ясность днем ​​и более спокойный сон ночью.

Преимущества капсул Red Kapuas

Наши успокаивающие капсулы Red Kapuas идеально подходят для стрессовых ситуаций и моментов, включая долгие бессонные ночи. Использование этих капсул Red Kapuas в рамках ежедневного оздоровительного режима может дать вам такие преимущества, как:

  • Общее расслабление
  • Снижение дискомфорта
  • Душевная ясность и спокойствие
  • Улучшено качество сна ночью

Почему стоит покупать красные капсулы Капуас в PurKratom?

Вы можете быть уверены, что наши капсулы Red Kapuas сертифицированы как органические и изготовлены из чистейших экстрактов кратома.Ваше удовлетворение гарантировано с каждым заказом, поскольку каждая партия капсул проходит строгий процесс проверки качества в сторонних лабораториях, прежде чем попадет к вам.

ОТКАЗ ОТ ОТВЕТСТВЕННОСТИ:
Эти заявления и продукты, представленные на этом веб-сайте, не были оценены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов FDA.
Пожалуйста, проконсультируйтесь со своим врачом перед использованием этого продукта, если вы беременны или кормите грудью, принимаете лекарства или страдаете заболеванием.Хранить в недоступном для детей месте.
Информация на этом веб-сайте, в электронных письмах или любых других сообщениях от нас предназначена только для образовательных целей. Он не предназначен для замены информированного медицинского совета или ухода. Вы не должны использовать эту информацию для диагностики или лечения каких-либо проблем со здоровьем или заболеваний без консультации с врачом.

Политика возврата

Вы можете вернуть большинство новых неоткрытых товаров в течение 30 дней с момента доставки для получения полного возмещения.Мы также оплатим стоимость обратной доставки, если возврат является результатом нашей ошибки (вы получили неправильный или бракованный товар и т. Д.).

Вы должны рассчитывать на получение возмещения в течение четырех недель с момента передачи посылки отправителю, но во многих случаях вы получите возмещение быстрее. Этот период времени включает в себя транзитное время, в течение которого мы получим ваш возврат от грузоотправителя (от 5 до 10 рабочих дней), время, необходимое нам для обработки вашего возврата после его получения (от 3 до 5 рабочих дней), и время, необходимое для этого. ваш банк для обработки нашего запроса на возврат (от 5 до 10 рабочих дней).

Если вам нужно вернуть товар, просто войдите в свою учетную запись, просмотрите заказ, используя ссылку «Завершить заказы» в меню «Моя учетная запись», и нажмите кнопку «Вернуть товар (ы)». Мы сообщим вам по электронной почте о вашем возмещении, как только мы получим и обработаем возвращенный товар.

Доставка

Мы можем отправить товар практически по любому адресу в мире. Обратите внимание, что существуют ограничения на некоторые товары, а некоторые товары не могут быть отправлены в другие страны.

Когда вы размещаете заказ, мы рассчитываем для вас сроки доставки и доставки в зависимости от наличия ваших товаров и выбранных вами вариантов доставки.В зависимости от выбранного вами поставщика доставки, приблизительные даты доставки могут отображаться на странице сметы доставки.

Также обратите внимание, что стоимость доставки для многих товаров, которые мы продаем, зависит от веса. Вес любого такого предмета можно узнать на его странице с подробными сведениями. Чтобы отразить политику транспортных компаний, которые мы используем, все веса будут округлены до следующего полного фунта.

Nam tempus turpis в Metus Scelerisque Placerat nulla deumantos solicitud felis.Pellentesque diam dolor, elementum etos lobortis des mollis ut risus. Sedcus faucibus an sullamcorper mattis drostique desmodo pharetras loremos.Donec pretium egestas sapien et mollis. Pellentesque diam dolor cosmopolis etos lobortis.

Comodous: Comodous in tempor ullamcorper miaculis
Мэттис Дарето: Pellentesque vitae neque mollis urna mattis laoreet.
Дивамус де Аметос: Дивамус сидите, амет пурус джусто.
Молести: Proin molestie egestas orci ac suscipit risus posuere loremous

Хлопковое земледелие - Пакет практик

Введение в Пакет практик хлопководства : Хлопок является основной коммерческой культурой, выращиваемой в Индии. Однако многие фермеры не знают о Комплексе практик, которым необходимо следовать при выращивании хлопка. В этом посте мы расскажем вам все о пакете практик по выращиванию хлопка i.е., от предпосевной обработки хлопка до послеуборочной обработки хлопка.

Урожай : Хлопок

Научное название : Gossypium sp.

Общее название / Народное название: Kapas, Kapus, Pathhi

Экономическое значение хлопка:

Это одна из самых важных товарных и волокнистых культур Индии. Он обеспечивает сырьем - волокном для текстильной промышленности из хлопка. Хлопковый ворс - важнейшее растительное волокно, вплетенное в ткани.Пух используется для производства матрасов, фотопленки, хирургического хлопка и бумаги. Изредка хлопковое масло используют в кулинарии. Хлопковый жмых содержит 40% белка и используется как концентрированный корм для крупного рогатого скота и птицы. Стебель хлопка используется как органическое топливо и навоз.

Типы и культивируемые виды хлопка : Gossypium arboreum, G.herbaceum, G.hirsutum и G.barbadense являются четырьмя выращиваемыми в Индии видами в промышленных масштабах.

Список местных сортов хлопка: MCU 5, MCU 7, MCU 11, LRA 5166, LH 900, LH 1556, HS 6, H 974, H 1098, HS 182, RST 9, Ganganagar Ageti, RS 875, Vika , Lohit, Maljari, Jawahar Tapti, DHY 286, Purnima, AKH 081 Rajat.

Список гибридных сортов хлопка: Suvin, Jayalakshmi, TCHB 213, Savitha, HB 224.

ХЛОПОК ПАКЕТ ПРАКТИЧЕСКИХ ПРАКТИК

Предварительный посев в хлопководстве Пакет практик :

Подготовка земли для хлопка: Широко выращивается в тропических и субтропических условиях.Для лучшего прорастания в полевых условиях необходима минимальная температура 15 градусов по Цельсию. Оптимальная средняя температура для вегетативного роста составляет около 21-27 градусов по Цельсию. Более теплые дни и более прохладные ночи во время плодоношения способствуют хорошему формированию и развитию коробочек и волокон. Обычно его выращивают на различных почвах, от хорошо дренированных глубоких аллювиальных почв до черных глинистых почв. Хлопок полупустынен к засолению, но очень чувствителен к переувлажнению. Хлопок хорошо растет на правильно подготовленном, выровненном поле, свободном от сорняков и комков.Также практикуется выравнивание с помощью выравнивателя, делаются гребни и борозды.

Время посева и норма высева хлопчатника: Посев сельскохозяйственных культур можно проводить в апреле-июне. Май наиболее предпочтителен для посева. В зависимости от типа и разновидности, типа почвы, методов выращивания и метода посева выбираются нормы высева и междурядье. Наиболее часто применяемая норма высева составляет 15-25 кг / га и междурядья 75-90 см для условий орошения. Однако для богарных культур соблюдается норма высева 12-16 кг / га и междурядья 45-60 см.

Руководство по выращиванию арахиса

Управление питательными веществами при выращивании хлопка: Внесение 12,5 т FYM или компоста или 2,5 т биогумуса на га в качестве базальной дозы во время последней вспашки. Внесение N в количестве 60-80 кг, P в количестве 30-40 кг и Kat 30-40 кг в зависимости от сорта и почвенных условий. Применение 50 процентов полной дозы азота и калия в качестве базовой и оставшейся половины дозы азота и калия через 40–45 дней после посева. Также можно провести внекорневую подкормку 2% DAP и 1% KCl для повышения урожайности Kapas.

Управление водными ресурсами в хлопководстве Пакет практик:

Хлопку требуется 700–1200 мм воды для удовлетворения его максимальной потребности в воде в зависимости от климата и режимов выращивания. Потребность в воде меньше в течение первых двух месяцев после посева и больше во время цветения и развития коробочек. Хлопок, как правило, орошается затоплением, хотя полив по бороздам или по другим бороздам является более эффективным методом. Для супесчаных почв северной зоны обычно дают 3-5 поливов.На красных супесчаных почвах дают -13 легких поливов.

Борьба с сорняками в хлопководстве:

Борьба с естественными сорняками в хлопчатнике: Как правило, для удаления сорняков и для обеспечения аэрации и экономии воды используются одно- или двухручные лопаты.

Химическая борьба с сорняками в хлопке: Флухлоралин или пендиметалин @ 1 кг действующего вещества / га в качестве предпосадочной заделки рекомендуется прополка одной рукой.

Борьба с насекомыми в хлопководстве:

Leafhopper : Amrasca biguttula biguttula - научное название цикадки.Симптомы его повреждения заключаются в том, что и нимфы, и взрослые особи высасывают сок с нижней поверхности листьев. Молодые зеленые листья желтеют, а края листьев скручиваются вниз. Ожог хоппера в случае сильного заражения. Естественное управление - установка световых ловушек. Химический контроль - опрыскивание Monocrotophos36SL @ 1000 мл / га.

Тля: Научное название хлопковой тли - Aphis gossypii . Симптомы повреждения включают то, что нимфы всасывают сок и вызывают задержку роста, постепенное высыхание растений.Развитие черной сажистой плесени из-за выделения пади в случае сильного заражения.

Пятнистая или колючая совка: Earias vittela или Earias insulana - научное название. Симптомы повреждения включают то, что личинки проникают в растущие нежные побеги и питаются внутренним содержимым, что приводит к опусканию и усыханию побегов. В зараженных коробочках видны забитые отверстия, заполненные экскрементами.

Розовая совка: Pectinophora gossypiella - научное название розовой совки.Симптомы повреждения включают заражение личинками бутонов, цветков и их опадение. Они протыкали коробочки и позже питались внутренним содержимым. Когда личинки попадают в коробочки, их очень маленькие входные отверстия, становится чрезвычайно трудно идентифицировать зараженные коробочки, пока они не упадут на землю.

Американская совка: Научное название американской совки - Helicoverpa armigera . Личинки питаются нежной листвой, квадратами, цветами и коробочками и наносят серьезный ущерб.Практика борьбы с совками заключается в том, что зараженные растения немедленно срезают и уничтожают. Установка феромонных ловушек из расчета 5 ловушек на гектар для каждой совки. Распылите profenophos 50 EC из расчета 2 мл / л во время заражения.

Красный хлопковый клоп : Dysdercus cingulatus - научное название красного хлопкового клопа. И нимфы, и взрослые особи высасывают клеточный сок из листьев, нежных побегов и семян хлопка. Из-за экскрементов насекомых и раздавливания нимф во время уборки ворсинок окрашивается, поэтому его обычно называют «красителем хлопка».Обработка производится путем опудривания метилпаратионом 2D из расчета 20 кг / га сразу после появления насекомого.

Темный хлопковый клоп: Oxycaraenus hyalipennis - это научное название темного хлопкового клопа. И нимфы, и взрослые особи высасывают сок из незрелых семян в открытых коробочках хлопка. Обработка осуществляется путем опудривания метилпаратионом 2D из расчета 20 кг / га сразу после появления насекомого.

Борьба с болезнями в хлопководстве:

Fusarium wilt : Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum является возбудителем фузариозного увядания. Симптомы у молодых всходов - пожелтение и побурение семядолей, появление коричневого кольца на черешке и засыхание всходов. Симптомы на более поздних стадиях включают потерю опухоли, пожелтение, поникание и увядание, которое начинается со старых листьев и продолжается вверх. Побурение сосудистых тканей происходит на стебле и распространяется вверх и вниз по растению. Лечение заключается в обработке семян тирамом в дозе 4 г / кг семян. Также точечное промывание 0.Рекомендуется 05% беномил или 0,1% карбендазим.

Вертициллиум увядание : Возбудитель вертициллийского увядания - Verticillium dahlia. Симптомы включают межжилковый хлороз с бронзовым оттенком жилок, пожелтением и высыханием краев листьев и участков между жилками, известного как «симптом полосатой полосатости». Пораженные растения остаются бесплодными с розоватым обесцвечиванием стебля и древесины растений. Лечение осуществляется обработкой очищенных семян карбендазимом в дозе 4 г / кг семян.Также рекомендуется залить точечное покрытие 0,05% беномилом или 0,1% карбендазимом.

Серая плесень или ареолистная роса : Ramularia areola является возбудителем серой мучнистой росы. Симптомы включают бледные полупрозрачные образования неправильной или угловатой формы на нижней поверхности, связанные прожилками, и серые порошкообразные образования со светло-зелеными пятнышками на верхней поверхности. В случае сильного заражения беловато-серый порошкообразный нарост на верхней поверхности. Управление осуществляется путем удаления и уничтожения пожнивных остатков.Опрыскивание посевов карбендазимом в дозе 250-375 г с повторением через неделю.

Alterneria фитофтороз: Возбудитель альтернариоза является Alternaria macrospora. Симптомы, включая e Маленькие, пластинчатые или коричневые, неправильные или круглые пятна могут появляться на листьях, и каждое пятно имеет центральное поражение, окруженное концентрическими кольцами. Несколько пятен на листьях сливаются вместе, образуя пораженные участки. Пораженные фитофторозом листья становятся ломкими и опадают.Химический контроль путем опрыскивания манкоцеба или оксихлорида меди в дозе 2 кг / га при первых признаках заболевания.

Cercospora пятнистость листьев : Cercospora gossypina является возбудителем пятнистости листьев Cercospora. Симптомы включают коричневые пятна с сероватым фоном на листьях № . Химический контроль путем опрыскивания манкоцеба или оксихлорида меди в дозе 2 кг / га при появлении признаков болезни.

Бактериальный ожог: Возбудитель бактериального ожога: Xanthomonas campestris p.v malvacearum. Симптомы включают водянистых, круглых или нерегулярных поражений семядолей, которые позже распространяются на черешок и стебель, и, наконец, увядание и гибель сеянцев, называемые « Фитофтороз». Кроме того, на нижней поверхности листьев образуются небольшие темно-зеленые, пропитанные водой участки, которые постепенно увеличиваются и становятся угловатыми, позже ограниченными прожилками и прожилками, и эти пятна видны на обеих поверхностях листьев, называемые Угловые пятна на листе. Инфекция жилок и прожилок имеет черноватый оттенок со сморщенными и скрученными листьями и бактериальными выделениями. называется некрозом жилок или поражением жилок. Также черные поражения на стебле и ветвях с преждевременным опаданием листьев, приводящим к отмиранию, известному как Черная рука. Также вызывает гниение коробочек.

Борьба с бактериальным ожогом хлопчатника: Обработка семян концентрированной серной кислотой в дозе 100 мл / кг семян. Также обработка семян, очищенных от кислоты, карбоксином или оксикарбоксином в дозе 2 г / кг или замачивание семян в 1000 ч. / Млн сульфата стрептомицина на ночь.

Индексы зрелости хлопка: Зрелость определяется, когда коробочки полностью открываются.

Уборка хлопка: Уборка проводится в более прохладные часы дня. Собирать капас только из колодца, лопнуть коробочки и удалить только капас, а прицветники оставить в самом растении.

Руководство по выращиванию сои

Послеуборочная обработка в хлопководстве Пакет практик

Высушите капас или хлопковое волокно в тени сразу после сбора коробочек. Цвет изменится, что снизит рыночную стоимость, если не высушить сразу.Прямая сушка на солнце не практикуется, так как это ухудшает прочность и блеск волокна. Оценка Капаса на хорошее и второе качество. Рассыпьте землю тонким слоем сухого песка и положите на него вату. Его также хранят в кучах или упаковывают в мешки.

Урожайность хлопка : Урожайность около 20-25 ц / га для улучшенных сортов и около 30-40 ц / га для гибридов.

Экономика хлопководства: Фермер инвестирует около рупий. 1,40 000 за обработку одного акра.Он получает около рупий. 1 95 000 на акр. Таким образом, чистая прибыль или чистый доход от этого выращивания составляет около рупий. 45000.

(PDF) Последние достижения в области гидрогелей на основе пищевых полимеров как устойчивой альтернативы обычным полимерам

(308) Qu, J .; Чжао, X .; Ma, P. X .; Го, Б. Acta Biomater. 2017,58,

168-180.

(309) Priya James, H .; John, R .; Alex, A .; Anoop, K. R. Acta Pharm.

Sin. В 2014,4 (2), 120−127.

(310) Соппимат, К. С.; Аминабхави, Т. М .; Дэйв, А. М .; Kumbar, S.

G .; Rudzinski, W. E. Drug Dev. Ind. Pharm. 2002, 28 (8), 957−974.

(311) Wu, J .; Wei, W .; Wang, L.-Y .; Вс, З.-Г .; Ма, Г.-Х.

Биоматериалы 2007,28 (13), 2220-2232.

(312) Zhu, X .; Вс, М .; Tang, S .; Wang, L .; Лян, X .; Meng, F .;

Hong, Y .; Xu, Z. Mol. Vis. 2012,18, 1973−1982 гг.

(313) Джордж, М .; Abraham, T. E. J. Controlled Release 2006,114

(1), 1-14.

(314) Бартон М.J .; Морли, Дж. В .; Mahns, D. A .; Mawad, D .;

Wuhrer, R .; Fania, D .; Frost, S.J .; Loebbe, C .; Лауто, А. Дж.

Биофотоника 2014,7 (11-12), 948-955.

(315) Hoemann, C.D .; Sun, J .; Légaré, A .; McKee, M.D .;

Buschmann, M. D. Osteoarthr. Хрящ. 2005, 13 (4), 318-329.

(316) Deng, Y .; Ren, J .; Chen, G .; Li, G .; Wu, X .; Wang, G .; Gu, G .;

Li, J. Sci. Rep. 2017,7, 2699.

(317) Shu, Y .; Hao, T .; Yao, F .; Qian, Y .; Ван, Ю.; Ян, Б .; Li, J .;

Wang, C. ACS Appl. Матер. Интерфейсы 2015,7 (12), 6505-6517.

(318) Zhou, H. Y .; Jiang, L.J .; Cao, P. P .; Li, J. B .; Chen, X. G.

Carbohydr. Polym. 2015,117 (Приложение C), 524-536.

(319) Li, L .; Wang, N .; Джин, X .; Deng, R .; Nie, S .; Вс, л .; Wu, Q .;

Wei, Y .; Гонг, К. Биоматериалы 2014, 35 (12), 3903-3917.

(320) Wei, C.-Z .; Hou, C.-L .; Gu, Q.-S .; Jiang, L.-X .; Чжу, Б .; Шэн,

А.-Л. Биоматериалы 2009,30 (29), 5534-5540.

(321) Gao, J .; Liu, R .; Wu, J .; Liu, Z .; Li, J .; Чжоу, Дж .; Hao, T .; Wang,

Y .; Ду, З .; Duan, C .; Wang, C. Biomaterials 2012,33 (14), 3673−

3681.

(322) Liu, Z .; Wang, H .; Wang, Y .; Lin, Q .; Yao, A .; Cao, F .; Li, D .;

Zhou, J .; Duan, C .; Ду, З .; Wang, Y .; Ван, К. Биоматериалы 2012,33

(11), 3093-3106.

(323) Ashford, M .; Fell, J .; Attwood, D .; Sharma, H .; Woodhead, P.

J. Controlled Release 1993,26 (3), 213-220.

(324) Butte, K .; Момин, М .; Deshmukh, H. Int. J. Biomater. 2014,

2014, 924278.

(325) Zhang, W .; Mahuta, K. M .; Микульски, Б. А .; Harvestine, J. N .;

Crouse, J. Z .; Lee, J. C .; Кальчев, М. Г .; Tritt, C. S. Pharm. Dev.

Technol. 2016,21 (1), 127-130.

(326) Мунарин, Ф .; Guerreiro, S.G .; Grellier, M. A .; Tanzi, M. C .;

Barbosa, M.A .; Petrini, P .; Гранья, П. Л. Биомакромолекулы 2011,12

(3), 568-577.

(327) Van Tomme, S. R .; Mens, A .; van Nostrum, C.F .; Hennink,

W. E. Biomacromolecules 2008,9 (1), 158-165.

(328) Gombocz, K .; Beledi, Á .; Alotti, N .; Kecskés, G .; Gábor, V .;

Bogár, L .; Kőszegi, T .; Garai, J. Crit. Уход 2007,11 (4), R87.

(329) Booi, D. I. Eur. J. Plast. Surg. 2011,34 (2), 81−86.

(330) Роблесс, П .; Оконько, Д .; Михайлидис, Д. П .; Стэнсби, Г.

Тромбоциты 2004, 15 (4), 215−222.

(331) Там, С.-C .; Blumenstein, J .; Wong, J. T. Proc. Natl. Акад. Sci.

США 1976,73 (6), 2128−2131.

(332) Sun, G .; Мао, Дж. Дж. Наномедицина (Лондон, США) 2012,7 (11),

1771−1784.

(333) Van Tomme, S. R .; Hennink, W. E. Expert Rev. Med. Приборы

2007,4 (2), 147−164.

(334) Hennink, W. E .; Де Йонг, С. Дж .; Bos, G.W .; Veldhuis, T. F. J .;

van Nostrum, C. F. Int. J. Pharm. 2004, 277 (1-2), 99-104.

(335) Пачелли, С.; Paolicelli, P .; Casadei, M. A. Carbohydr. Polym.

2015,126, 208-214.

(336) Vermonden, T .; Censi, R .; Hennink, W. E. Chem. Ред.2012,

112 (5), 2853−2888.

(337) Maia, J .; Ferreira, L .; Carvalho, R .; Ramos, M. A .; Гил, М. Х.

Полимер 2005,46 (23), 9604-9614.

(338) Де Гроот, К. Дж .; Van Luyn, M. J. A .; Van Dijk-Wolthuis, W. N.

E .; Cadée, J. A .; Плантинга, Дж. А .; Оттер, В. Ден; Хеннинк, В. Э.

Биоматериалы 2001,22 (11), 1197-1203.

(339) Азиз, М. А .; Cabral, J.D .; Brooks, H. J. L .; Moratti, S.C .;

Hanton, L. R. Antimicrob. Агенты Chemother. 2012,56 (1), 280−287.

(340) Levesque, S.G .; Lim, R.M .; Шойчет, М.С. Биоматериалы

2005,26 (35), 7436-7446.

(341) Hanauer, N .; Latreille, P. L .; Alsharif, S .; Банки, X. Curr.

Фарм. Des. 2015,21 (12), 1506-1516.

(342) Lévesque, S.G .; Shoichet, M. S. Bioconjugate Chem. 2007,18

(3), 874-885.

(343) Weng, L .; Романов, А .; Руни, Дж .; Чен, В. Биоматериалы

2008,29 (29), 3905-3913.

(344) Sun, G .; Чжан, X .; Shen, Y.-I .; Себастьян, Р .; Дикинсон, Л. Э .;

Fox-Talbot, K .; Reinblatt, M ​​.; Steenbergen, C .; Harmon, J. W .;

Gerecht, S. Proc. Natl. Акад. Sci. США. 2011,108 (52), 20976−

20981.

(345) Jin, R .; Морейра Тейшейра, Л. С .; Dijkstra, P.J .; van Blitterswijk,

C. A .; Карпериен, М .; Фейен, Дж.Биоматериалы 2010,31 (11), 3103-

3113.

(346) Ferreira, L .; Gil, M. H .; Cabrita, A.M.S .; Дордик, Дж. С.

Биоматериалы 2005, 26 (23), 4707-4716.

(347) Bernkop-Schnürch, A .; Kast, C.E .; Richter, M. F. J. Controlled

Release 2001,71 (3), 277−285.

(348) Draget, K. I .; Stokke, B.T .; Yuguchi, Y .; Urakawa, H .;

Kajiwara, K. Biomacromolecules 2003,4 (6), 1661–1668.

(349) Gwon, S. H .; Юн, Дж .; Сок, Х.К .; О, К. Х .; Солнце, Ж.-Й.

Макромол. Res. 2015, 23 (12), 1112-1116.

(350) Yang, C. H .; Wang, M. X .; Haider, H .; Yang, J. H .; Sun, J.-Y .;

Chen, Y. M .; Чжоу, Дж .; Suo, Z. ACS Appl. Матер. Интерфейсы 2013,5

(21), 10418-10422.

(351) Lee, K. Y .; Муни, Д. Дж. Прог. Polym. Sci. 2012,37 (1), 106−

126.

(352) Cong, Z .; Shi, Y .; Wang, Y .; Wang, Y .; Niu, J .; Chen, N .; Сюэ,

H. Int. J. Biol. Макромол. 2018,107 (Часть A), 855-864.

(353) Chen, S.-C .; Wu, Y.-C .; Mi, F.-L .; Lin, Y.-H .; Ю., Л.-Ц .; Сун,

H.-W. J. Controlled Release 2004, 96 (2), 285-300.

(354) Li, J .; Муни, Д. Дж. Нат. Rev. Mater. 2016,1, 16071.

(355) Liu, M .; Цзэн, X .; Ma, C .; Yi, H .; Али, З .; Mou, X .; Li, S .;

Deng, Y .; Он, N. Bone Res. 2017,5, 17014.

(356) Bouhadir, K. H .; Lee, K. Y .; Alsberg, E .; Damm, K. L .;

Андерсон, К. В .; Mooney, D. J. Biotechnol. Прог. 2001,17 (5), 945-

950.

(357) Gong, R .; Li, C .; Zhu, S .; Zhang, Y .; Du, Y .; Jiang, J.

Carbohydr. Polym. 2011,85 (4), 869−874.

(358) Саркер, Б .; Rompf, J .; Silva, R .; Lang, N .; Detsch, R .; Kaschta,

J .; Fabry, B .; Boccaccini, A.R. Int. J. Biol. Макромол. 2015,78,72−78.

(359) Zimmermann, H .; Shirley, S.G .; Zimmermann, U. Curr.

Diabetes Rep. 2007,7 (4), 314-320.

(360) Banerjee, A .; Arha, M .; Choudhary, S .; Ashton, R. S .; Бхатия,

С.Р.; Schaffer, D. V .; Kane, R. S. Biomaterials 2009, 30 (27), 4695-

4699.

(361) Tan, W.-H .; Takeuchi, S. Adv. Матер. 2007,19 (18), 2696−

2701.

(362) Queen, D .; Orsted, H .; Sanada, H .; Sussman, G. Int. Рана J.

2004,1 (1), 59−77.

(363) Boateng, J. S .; Matthews, K. H .; Стивенс, Х. Н. Э .; Eccleston,

G. M. J. Pharm. Sci. 2008,97 (8), 2892−2923.

(364) Fischbach, C .; Kong, H.J .; Hsiong, S. X .; Евангелиста, М.B .;

Yuen, W .; Mooney, D. J. Proc. Natl. Акад. Sci. США, 2009, 106 (2),

,

, 399−404.

(365) Kreeger, P.K .; Deck, J. W .; Woodruff, T. K .; Ши, Л. Д.

Биоматериалы 2006, 27 (5), 714-723.

(366) Коламбкар Ю. М .; Дюпон, К. М .; Boerckel, J.D .; Huebsch,

N .; Муни, Д. Дж .; Hutmacher, D.W .; Гульдберг, Р. Э. Биоматериалы

2011,32 (1), 65-74.

(367) Silva, E. A .; Муни, Д. Дж. Биоматериалы 2010, 31 (6), 1235-

1241.

(368) Prang, P .; Müller, R .; Eljaouhari, A .; Heckmann, K .; Kunz, W .;

Weber, T .; Faber, C .; Вроемен, М .; Bogdahn, U .; Weidner, N.

Biomaterials 2006, 27 (19), 3560-3569.

(369) Rajanahalli, P .; Хуанг Дж. Система гидрогеля

без животного происхождения для трехмерной клеточной культуры множественных клеточных линий, http: // www.

thewellbio.com/products/.

Обзор сельскохозяйственной и пищевой химии

DOI: 10.1021 / acs.jafc.8b01052

J.Agric. Food Chem. 2018, 66, 6940-6967

6965

Целостность межклеточных контактов является критическим регулятором индуцированного TGF-β1 перехода эпителия-миофибробласта

Abstract

Повреждение эпителия канальцев и индуцированное TGF-β1 Превращение эпителиальных клеток в миофибробласты, экспрессирующие α-гладкомышечный актин (SMA), являются ключевыми признаками фиброза почек. Поскольку травма повреждает межклеточные соединения и способствует фиброзу, мы предположили, что клеточные контакты являются критическими регуляторами триггерного TGF-β1 эпителиально-мезенхимального перехода (EMT).Здесь мы показываем, что TGF-β1 был неспособен индуцировать ЭМП в интактных сливных монослоях, но три различные модели потери целостности эпителия, вызванной повреждением (субконфлюэнтность, ранение и контактная разборка с помощью удаления Ca 2+ ), восстановили его ЭМП. побуждающий эффект. Это проявляется в потере E-кадгерина, увеличении продукции фибронектина и экспрессии SMA. Только TGF-β1 или контактная разборка лишь незначительно стимулировали промотор SMA в сливающихся слоях, но вместе проявляли сильную синергию.Поскольку β-катенин является компонентом неповрежденных спаек, но при освобождении от дестабилизированных контактов может действовать как коактиватор транскрипции, мы исследовали его роль в TGF-β1-провоцируемом EMT. Сама по себе контактная разборка индуцировала деградацию E-кадгерина и β-катенина, но TGF-β1 селективно восстанавливал β-катенин и стимулировал управляемый β-катенином репортер TopFLASH. Более того, хелатирование свободного β-катенина с цитоплазматическим хвостом N-кадгерина подавляло активацию промотора SMA и экспрессию белка, индуцированную TGF-β1 плюс контактную разборку.Эти результаты предполагают β-catenin-зависимый механизм двух ударов, при котором для EMT требуются как начальное повреждение эпителия, так и TGF-β1.

Эпителиально-мезенхимальный переход (EMT) играет центральную роль в развитии и канцерогенезе. 1 Недавно появилась революционная концепция, согласно которой ЭМП является одним из ключевых механизмов, лежащих в основе фиброза органов, включая почки. 2–4 Действительно, тубулоинтерстициальный фиброз (ТИФ) является распространенным патологическим путем, по которому хронические заболевания почек прогрессируют до терминальной стадии почечной недостаточности.TIF характеризуется постепенной потерей канальцевого эпителия, сопровождающейся прогрессирующим накоплением фибробластов и миофибробластов, положительных по отношению к α-гладкомышечному актину (SMA), что приводит к избыточной продукции и отложению компонентов внеклеточного матрикса. 5 Ключевое значение миофибробластов в TIF дополнительно подтверждается сильной положительной корреляцией между экспрессией SMA и потерей функции почек. 6

Как клинические исследования, так и модели TIF ​​на животных показывают, что фибробласты и миофибробласты могут происходить из канальцевого эпителия, подвергающегося EMT 7–9 в ответ на воспалительные цитокины, преимущественно трансформирующие фактор роста-β 1 (TGF- β1). 10,11 Наиболее убедительные доказательства EMT при фиброзе были предоставлены Iwano et al, 12 , которые обнаружили, что у мышей с генетически помеченными клетками проксимальных канальцев 36% почечных фибробластов происходили из эпителия в модели TIF.

Чтобы исследовать лежащие в основе механизмы, несколько групп, включая нашу, разработали клеточные модели индуцированного TGF-β1 перехода эпителиально-фибробласты / миофибробласты. 13–15 Эти исследования показали, что ключевые особенности EMT включают раннюю потерю межклеточных контактов из-за подавления ZO-1 и E-кадгерина, реорганизацию цитоскелета, приобретение веретенообразной морфологии, и, наконец, экспрессия SMA, отличительного признака фенотипа миофибробластов.Этот процесс занимает несколько дней и требует взаимодействия множества путей, индуцируемых TGF-β1, включая белки SMAD, 16 интегрин-связанную киназу, 17 и GTPases семейства Rho. 15,18

Обширные исследования в области опухолей и биологии развития укрепили представление о том, что внутриклеточные контакты являются не только пассивными мишенями, но и активными регуляторами ЭМП. Соответственно, потеря E-кадгерина способствует EMT, в то время как форсированная экспрессия E-кадгерина может восстанавливать эпителиальный фенотип в трансформированных опухолевых клетках. 19–22 Более того, недавние исследования Zeisberg и Kalluri 23 предоставляют убедительные доказательства важности потери E-cadherin в EMT в канальцевых клетках. Эти авторы показали, что ингибирование индуцированного TGF-β1 подавления E-cadherin обращает EMT. Соответственно, известно, что повреждение эпителия и последующее восстановление, которое включает повреждение или потерю межклеточных контактов, способствует фиброзу тканей. 24 Что касается основного механизма, β-catenin, внутриклеточного связывающего партнера E-cadherin, по-видимому, является хорошим кандидатом для участия в контактно-зависимой регуляции EMT из-за его двойной функции.А именно, в клетках с интактными межклеточными контактами β-катенин является неотъемлемым компонентом слипчивых соединений, однако, когда он освобожден от контактов, он может действовать как коактиватор транскрипции, связываясь с членами фактора Т-клетки / фактора лимфоидного энхансера. (TCF / LEF) семейство факторов транскрипции. 25 В самом деле, передача сигналов β-catenin участвует в прогрессировании EMT в опухолевых клетках, 26–28 , хотя его роль в обеспечении фиброза органов еще предстоит определить. В соответствии с его потенциальным участием мы и другие показали, что TGF-β1 индуцирует повышенное ядерное накопление β-катенина в канальцевых клетках, 15,29 и β-катенин, как сообщается, взаимодействуют с белками SMAD. 30,31 Кроме того, эпителиальные клетки пациентов с легочным фиброзом показали сильное ядерное окрашивание на β-катенин. 32 Наконец, β-catenin нацелен на определенные гены, которые участвуют в EMT. 33–35 Тем не менее, остается спорным вопрос, индуцирует ли TGF-β1 β-catenin-зависимую транскрипцию в доброкачественных эпителиальных клетках, 29,30,36 , и если да, то может ли такой процесс влиять на переход эпителиально-миофибробластов. Соответственно, мы предположили, что целостность межклеточных контактов в целом и передача сигналов β-catenin в частности могут быть важными регуляторами TGF-β1-индуцированного образования миофибробластов.

Наши настоящие исследования предоставляют доказательства того, что клеточные контакты являются критическими детерминантами чувствительности ЕМТ к TGF-β1. Мы показываем, что частичное отсутствие или разборка межклеточных соединений является предпосылкой для TGF-β1-провоцируемого EMT. Исследуя основной механизм, мы обнаружили, что β-катенин играет важную роль в TGF-β1 и в зависимой от клеточного контакта синергетической регуляции промотора SMA и экспрессии белка. Эти результаты предполагают модель с двумя ударами, в которой для EMT требуются как начальное повреждение ткани, так и TGF-β1.

Материалы и методы

Материалы и антитела

Использовали следующие первичные антитела: анти-β-катенин, анти-Rho (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Калифорния), анти-E-кадгерин (Transduction Laboratories, Миссиссауга, США). ON), анти-SMA (1A4), антифибронектин, анти-β-актин и антитубулин (Sigma, Сент-Луис, Миссури). Родамин-фаллоидин был из Cytoskeleton (Денвер, Колорадо). Антитела против IgG мыши и кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена, были приобретены в Amersham Biosciences (Baic d’Urfé, QC), а антитела против козла в Санта-Крус.Флуоресцеина изотиоцианат и Cy3-меченные вторичные антитела коз, кролика и мыши были получены от Jackson Immunoresearch Laboratories (West Grove, PA).

Клетки

Для большинства наших исследований мы использовали клетки LLC-PK1 CL4, стабильно экспрессирующие рецептор AT 1 , ​​поскольку мы подробно охарактеризовали EMT в этой линии клеток проксимальных канальцев в наших предыдущих исследованиях. 15 Однако процесс EMT был качественно и количественно аналогичным в клетках LLC-PK1 дикого типа.Клетки культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллин / стрептомицин (Gibco, Burlington, ON) при 37 ° C и 5% CO 2 в увлажненном инкубаторе. Клетки выращивали до 30% или 100% слияния, а затем обрабатывали только носителем (4 ммоль / л HCl и 0,1% альбумин) или 4 нг / мл человеческого рекомбинантного TGF-β1 (Sigma) в течение указанного времени. В некоторых экспериментах среду конфлюэнтных слоев, выращенных на пластиковой или проницаемой подложке (Corning, Acton, MA), заменяли на DMEM, не содержащую Ca 2+ , номинально не содержащую Ca 2+ (Gibco) без FBS.

Вестерн-блоттинг

После обработки клетки соскребали в буфер для лизиса Тритона (30 ммоль / л N -2-гидроксиэтилпиперазин- N -2-этансульфоновая кислота (HEPES) (pH 7,4), 100 ммоль / л NaCl , 1 ммоль / л этиленгликоль-бис (2-аминоэтиловый эфир) -N, NN 'N'-тетрауксусная кислота (EGTA), 20 ммоль / л NaF, 1% Triton X-100, 1 ммоль / л фенилметилсульфонилфторид (PMSF) , 20 мкл / мл коктейля, ингибирующего протеазу (Pharmingen BD Biosciences, Сан-Диего, Калифорния), и 1 ммоль / л Na 3 VO 4 ).Часть образцов сохраняли в виде общих лизатов, затем цитозольную (растворимый в тритоне) и цитоскелетную (нерастворимый в тритоне) фракции разделяли центрифугированием. Образцы растворяли в буфере Лэммли и кипятили в течение 5 минут. Равное количество белка разделяли на SDS-полиакриламидных гелях и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Bio-Rad, Hercules, CA). Иммуноблоттинг выполняли, как описано ранее. 15 Иммунореактивные полосы визуализировали с помощью набора для реакции усиленной хемилюминесценции (Amersham).

Приготовление гранул GST-RBD и измерение активности Rho

Активность Rho определяли, как описано ранее 15,37 , используя анализ сродства с понижением, основанный на способности Rho-связывающего домена (RBD) Rhotekin захватить загруженную GTP форму Rho. Рекомбинантный слитый белок глутатион-S-трансфераза (GST) -RBD получали из E.coli и адсорбировали на покрытых глутатионом гранулах. Конфлюэнтные монослои на 10-сантиметровых чашках Петри истощали сывороткой в ​​течение 3 часов в нормальной среде DMEM или без кальция, а затем подвергали воздействию 10 нг / мл TGF-β1 в течение 10 минут.Затем клетки промывали ледяным фосфатно-солевым буфером (PBS) и соскребали в 800 мкл буфера для лизиса с добавлением 0,1% SDS, 0,5% Na-дезоксихолата. Супернатанты инкубировали с шариками GST-RBD в течение 45 минут при 4 ° C. После промывки шарики кипятили в буфере Лэммли. Связанный с гранулами белок Rho был обнаружен с помощью вестерн-блоттинга.

Анализ ран

Конфлюэнтные монослои, выращенные на 25-миллиметровых стеклянных покровных стеклах, были ранены резиновым полицейским, образовавшим зазор размером ~ 3 мм.После обширной промывки клетки помещали в DMEM и обрабатывали 4 нг / мл TGF-β1 или носителем в течение 3 дней.

Иммунофлуоресцентная микроскопия

Клетки, выращенные на покровных стеклах, фиксировали в 4% параформальдегиде, инкубировали с PBS, содержащим 100 ммоль / л глицина, и промывали PBS. Клетки пермеабилизировали в PBS, содержащем 0,1% тритона X-100, блокировали 5% альбумином в течение 1 часа и инкубировали с первичными антителами в течение еще одного часа. После обширной промывки добавляли флуоресцентно меченые вторичные антитела на 1 час, покровные стекла снова промывали и помещали на предметные стекла с использованием среды для фиксации флуоресценции (DAKO Diagnostics, Mississauga, ON).Образцы анализировали с помощью микроскопа Nikon Eclipse TE200 (объектив × 100) (Nikon, Mississauga, ON) и охлаждаемой CCD камеры Hamamatsu (C4742–95) (Hamamatsu, Bridgewater, NJ), управляемой с помощью программного обеспечения Simple PCI.

Плазмиды

Кусок промотора SMA крысы длиной 765 пар оснований, содержащий несколько цис- - элементов, включая связывающие мотивы элементов ответа сыворотки (блоки CArG A и CArG B), контрольный элемент TGF-β1 (TCE), бокс TATA и два E-бокса лигировали в вектор люциферазы PA 3 -Luc (pSMA-Luc).Конструкция была любезным подарком доктора Р. А. Неменоффа (Департамент медицины, Отделение почек, Центр медицинских наук Университета Колорадо, Денвер, Колорадо). 38 Репортерная плазмида LEF / TCF, TopFLASH и ее мутантный контроль, FopFLASH, были приобретены в Upstate Biotechnology (Charlottesville, VA). Управляемый тимидинкиназой вектор люциферазы Renilla (pRL-TK, Promega, Madison, WI) использовали в качестве внутреннего контроля. Конструкция, кодирующая цитоплазматический хвост N-кадгерина, лигированного с GFP (N-cad-GFP), была щедрым подарком Dr.Б. Гейгер (Отделение химической иммунологии, Научный институт Вейцмана, Реховот, Израиль). 39 Доминантно-отрицательная конструкция TCF4 (dN-TCF4), клонированная в pcDNA 3 Вектор был получен от Drs. О. Тецу и Ф. Маккормик (Институт исследований рака, Калифорнийский университет, медицинский факультет, Сан-Франциско, Калифорния). 40 Эта конструкция кодирует усеченный мутант TCF-4, меченный Myc-эпитопом, в котором область между аминокислотами 2–53 удалена. Вектор pEGFP был от Clontech Laboratories (Пало-Альто, Калифорния), а pcDNA 3 был от Invitrogen (Берлингтон, Онтарио).

Переходная трансфекция и анализ люциферазы

Клетки, высеянные на 6-луночные планшеты, трансфицировали при 100% или 30% слияния с использованием FuGENE6 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN; соотношение реагент: ДНК 2,5 мкл / мкг). Для измерения активности промотора клетки котрансфицировали 0,5 мкг промоторной плазмиды, 0,05 мкг pRL-TK вместе с 2 мкг специфической ингибирующей конструкции или pcDNA 3 на лунку. Через 16 часов клетки промывали сбалансированным солевым раствором Хэнка (HBSS) и инкубировали в бессывороточной среде DMEM с нормальным или низким содержанием кальция в течение 3 часов с последующей обработкой носителем или 10 нг / мл TGF-β1 в течение 24 часов.Затем клетки лизировали в 250 мкл пассивного лизатного буфера (Promega), подвергали замораживанию / оттаиванию, и образцы осветляли центрифугированием. Активность люциферазы Firefly и Renilla определяли с помощью набора для анализа репортерной люциферазы Dual-Luciferase Reporter Assay Kit (Promega) и люминометра Berthold Lumat LB 9507 в соответствии с инструкциями производителя. Результаты нормализовали путем деления активности люциферазы Firefly на активность люциферазы Renilla того же образца. Каждую трансфекцию проводили в двух экземплярах, и определения для каждой группы повторяли не менее трех раз.

Ретровирусная инфекция

Для создания векторов pFB-N-cad и pFB-GFP кодирующую область плазмид N-cad-GFP и pEGFP вставляли в плазмиду pFB-Neo (Stratagene, La Jolla, CA) с использованием Ферменты Eco RI и Xho. Для получения ретровирусов упаковывающие клетки 293T трансфицировали векторами pFB-N-cad, pFB-GFP или pFB-Neo, соответственно, вместе с pVpack-GP и pVpack-VSVG. Через 24-36 часов супернатанты собирали и фильтровали через фильтр 0,45 мкм.Клетки LLC-PK1, помещенные на 6-луночные планшеты, трансдуцировали вирусом при 20% конфлюэнтности. После 16-часовой трансдукции клетки дополнительно инкубировали в свежей среде в течение 36 часов и обрабатывали носителем или 4 нг / мл TGF-β1. Через три дня готовили лизаты клеток и анализировали образцы с помощью вестерн-блоттинга.

Статистический анализ

Данные представлены в виде репрезентативных блотов из трех аналогичных экспериментов или в виде средних значений ± SEM для указанного количества экспериментов (n). Статистическая значимость определялась с помощью теста Стьюдента t или дисперсионного анализа (односторонний дисперсионный анализ, SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс), используя апостериорные тесты Бонферрони и Тьюки. P <0,05 значение принимается значимым.

Результаты

Слияние клеток является критическим детерминантом ЭМП, индуцированной TGF-β1 в трубчатых клетках LLC-PK1 конфлюэнтные и редкие культуры, т. е. в условиях, когда клетки имеют зрелые межклеточные соединения или менее развитые контакты и свободные границы.В отсутствие TGF-β1 клетки LLC-PK1 обладают эпителиальным фенотипом

15 и не экспрессируют SMA, независимо от уровня слияния клеток (вверху). Однако слияние клеток оказало сильное влияние на способность TGF-β1 индуцировать ЭМП. Примечательно, что когда клетки LLC-PK1 высевали при 30% конфлюэнтности и затем обрабатывали TGF-β1 в течение 3 дней, около 50% клеток проявляли окрашивание на SMA, признак фенотипа миофибробластов. Напротив, SMA-положительные клетки не наблюдались, когда TGF-β1 добавляли к сливным слоям в течение 3 дней (внизу).Чтобы подтвердить этот вывод, мы провели вестерн-блоттинг, чтобы определить экспрессию SMA и других белков, уровень которых показывает характерные изменения во время EMT. Примечательно, что обработка TGF-β1 в течение 5 дней не вызывала какой-либо экспрессии SMA в 100% конфлюэнтных культурах, тогда как она запускала устойчивую экспрессию SMA, когда клетки подвергались воздействию цитокина при 30% конфлюэнтности. Кроме того, TGF-β1 вызывал лишь незначительное увеличение фибронектина в конфлюэнтных культурах, в то время как он сильно увеличивал содержание этого матричного протеина при добавлении при 30% конфлюэнтности.Важно отметить, что в конфлюэнтных культурах TGF-β1 неспособен подавлять адгезивный соединительный белок E-cadherin, классический маркер эпителиальных клеток. Напротив, белок E-кадгерин не был обнаружен в клетках, которые были обработаны TGF-β1 до достижения слияния. Вместе эти результаты показывают, что высокая плотность клеток предотвращает или сильно подавляет ряд ключевых особенностей мезенхимального перехода, индуцированного TGF-β1, включая потерю эпителиальных маркеров, повышенную продукцию внеклеточного матрикса и экспрессию маркера миофибробластов, SMA.

Плотность клеток определяет трансформирующий эффект TGF-β1 в клетках LLC-PK1. A: Клетки выращивали на покровных стеклах до 100% или 30% слияния, а затем обрабатывали носителем (контроль) или 4 нг / мл TGF-β1 в течение 3 дней. Затем их окрашивали антителом против SMA (красный) и ядерным маркером DAPI (для проверки наличия клеток). B: Клетки выращивали на 6-луночных планшетах до 30% или 100% слияния и обрабатывали носителем (-) или TGF-β1 (+) в течение 5 дней. Равные количества белка подвергали SDS-PAGE и анализировали на SMA, E-кадгерин и фибронектин с помощью вестерн-блоттинга.Чтобы проверить равную нагрузку, мембрану зондировали на тубулин.

Роль межклеточных контактов в индуцированном TGF-β1 эпителиально-миофибробластном переходе

Мы стремились определить, действительно ли способность TGF-β1 индуцировать EMT связана с отсутствием межклеточных контактов. Чтобы решить эту проблему, мы создали механическую рану в конфлюэнтных монослоях и протестировали влияние TGF-β1 на экспрессию SMA. Само по себе ранение не индуцировало продукцию SMA, в то время как воздействие TGF-β1 приводило к экспрессии SMA.Поразительно, что экспрессия SMA ограничивалась исключительно клетками, расположенными на краю раны, т. Е. Происходила в клетках, которые частично утратили контакты со своими соседями. Точно так же усиленное мечение фибронектина показало сильный градиент, начиная с нескольких рядов клеток позади раны и резко увеличиваясь к свободному краю. Распад межклеточных контактов в рядах возле раны был четко визуализирован по окрашиванию β-катенина. Клетки, выстилающие рану, утратили свою метку β-катенином на свободном крае, но сохранили большую часть нормального периферического распределения β-катенина на границах клетки-клетки.При обработке TGF-β1 β-катенин перераспределялся в клетках рядом с раной. Это проявляется в расширении окраски периферического β-катенина, повышении уровня цитозольного мечения и накоплении β-катенина в ядрах клеток, расположенных на краю или мигрирующих в рану.

Потеря межклеточных контактов из-за ранения восстанавливает способность TGF-β1 индуцировать ЭМП. Клеткам давали возможность расти до 100% слияния, а затем с помощью резинового полицейского в монослое создавали рану.Впоследствии клетки обрабатывали носителем (контроль; A , C и E ) или 4 нг / мл TGF-β1 ( B , D и F ) в течение 3 дней, затем фиксировали. , проницаемость и окрашивание на SMA ( A и B ), фибронектин ( C и D ) или β-катенин ( E и F ). Увеличение было × 40 для A до D и × 100 для E и F .

В качестве еще одного метода проверки роли межклеточных контактов в EMT мы использовали подход, не связанный с механическими повреждениями. Мы индуцировали разборку зрелых межклеточных контактов в конфлюэнтных культурах с помощью удаления Ca 2+ , маневра, который, как известно, нарушает гомотипическую адгезию между кадгеринами. 41 Примечательно, что удаление Ca 2+ полностью восстановило способность TGF-β1 провоцировать ЕМТ. В течение 3-дневного эксперимента в присутствии Ca 2+ TGF-β1 не индуцировал экспрессию SMA и не вызывал значительного снижения E-кадгерина, как сообщалось выше.Удаление Ca 2+ без добавления TGF-β1 не вызывало экспрессии SMA и лишь незначительно влияло на экспрессию фибронектина, но вызывало существенное снижение E-кадгерина. Важно отметить, что TGF-β1, добавленный в отсутствие Ca 2+ , запускал постепенно увеличивающуюся экспрессию SMA, приводил к полному устранению E-кадгерина и сильно стимулировал продукцию фибронектина. В соответствии с этими данными, в среде, свободной от Ca 2+ , эпителиальные клетки все еще сохраняли свою многоугольную форму.Однако воздействие на эти клетки TGF-β приводило к мезенхимальной морфологии. Таким образом, отсутствие стабильных межклеточных контактов, независимо от того, вызвано ли оно неслияниями или механическим или химическим нарушением клеточных контактов, является предпосылкой для индуцирующего EMT эффекта TGF-β1.

Разрушение межклеточных контактов низким содержанием кальция восстанавливает трансформирующий эффект TGF-β1 в конфлюэнтных монослоях. A: Конфлюэнтные клетки промывали и инкубировали в бессывороточной нормальной или не содержащей Ca 2+ среде DMEM, а через 3 часа обрабатывали носителем (контроль) или 4 нг / мл TGF-β1 в течение указанного времени.Экспрессию SMA, E-кадгерина и фибронектина определяли с помощью вестерн-блоттинга. B: Обработка TGF-β1 (24 часа) вызвала морфологические изменения в среде DMEM с низким содержанием кальция (фазово-контрастная микроскопия, увеличение, × 40).

Мы рассмотрели возможность того, что в конфлюэнтных слоях TGF-β1 не может способствовать EMT при добавлении с апикальной стороны, потому что он не может получить доступ к базолатеральной мембране, где могут находиться рецепторы TGF-β1. 29 Чтобы проверить это, мы провели контрольные эксперименты с использованием клеток LLC-PK1, выращенных на проницаемой подложке, чтобы обеспечить свободный доступ к обоим мембранным доменам.Как показано ниже, в конфлюэнтных монослоях ни апикально, ни базолатерально добавленный TGF-β1 не индуцировал экспрессию SMA. Однако, когда клеточные контакты были разобраны с помощью удаления Ca 2+ , апикальное или базолатеральное введение TGF-β1 провоцировало устойчивый и сходный ответ SMA. Эти данные исключают, что устойчивость к TGF-β1 была вызвана дифференциальной доступностью. Затем мы спросили, проявляют ли слившиеся культуры общую невосприимчивость к TGF-β1 или подавляется только трансформирующий эффект. Чтобы решить эту проблему, мы определили, остается ли TGF-β1 способным стимулировать Rho GTPase, важный сигнал для ремоделирования цитоскелета.В соответствии с нашими предыдущими результатами, 15 TGF-β1 индуцировал значительную активацию Rho в конфлюэнтных культурах, которая была аналогичной в присутствии или отсутствии Ca 2+ . Это говорит о том, что разборка контактов для этого ответа не потребовалась. В соответствии с этими результатами, воздействие TGF-β1 на сливающиеся слои стимулировало образование стрессовых волокон. Вместе эти данные показывают, что сигнальные пути TGF-β1 функционируют в конфлюэнтных клетках LLC-PK1, предполагая, что неудачная трансформация происходит не из-за общей невосприимчивости, а, скорее, из-за отсутствия пермиссивного фактора (ов), регулируемого клеточным контактом.

Конфлюэнтные клетки остаются чувствительными к TGF-β1. A: Клетки культивировали до слияния на вставках для культур пористой ткани (размер пор 3 мкм), затем лишали сыворотки в нормальной (+) или низкокальциевой среде (-). Через 3 часа клетки обрабатывали носителем (-) или 4 нг / мл TGF-β1 с верхней (U) или нижней стороны (L) в течение 3 дней. Готовили лизаты общих клеток и исследовали экспрессию SMA с помощью вестерн-блоттинга. B: Для определения активности Rho истощали сыворотку в течение 3 часов в нормальном (+) или низком Ca 2+ (-) DMEM, а затем обрабатывали носителем (-) или 10 нг / мл TGF-β1 (+ ) в течение 10 минут.После лизиса активный Rho был захвачен гранулами GST-Rhotekin и обнаружен вестерн-блоттингом. Аликвоты тех же лизатов исследовали на общий Rho. C: Конфлюэнтные культуры обрабатывали носителем (контроль) или 4 нг / мл TGF-β1. F-актин визуализировался родамином фаллоидином.

Клеточно-клеточные контакты регулируют промотор SMA

Чтобы оценить, могут ли контакты между клетками влиять на регуляцию промотора SMA, мы исследовали влияние TGF-β1 на конструкцию люциферазы промотора SMA в условиях, когда на соединениях клеток манипулировали указанным выше -Описанные средства.В конфлюэнтных культурах со стабильными клеточными контактами (100%, нормальная среда Ca 2+ ) TGF-β1 индуцировал умеренное ~ 3-кратное увеличение активности промотора SMA, подтверждая базальную чувствительность к TGF-β1 в конфлюэнтных слоях. . Восстановление Ca 2+ без добавления TGF-β1 приводило к ~ 4-кратному увеличению активности промотора SMA. Важно отметить, что TGF-β1, добавленный к конфлюэнтным слоям, в которых соединения клеток были разобраны с помощью удаления Ca 2+ , вызывал 14-кратное увеличение активности промотора SMA.Таким образом, контактная разборка и TGF-β1 действовали синергетически, о чем свидетельствует мультипликативный эффект. Затем мы проверили влияние субсогласия в присутствии нормального Ca 2+ . Базальная активность промотора SMA была в 5 раз выше в 30%, чем в 100% конфлюэнтных культурах. Добавление TGF-β1 к 30% конфлюэнтных клеток привело к 20-кратному увеличению активности промотора SMA по сравнению с конфлюэнтными нестимулированными клетками. Эти данные показывают, что общая стимуляция промотора SMA TGF-β1 сильно зависит от состояния межклеточных контактов в обеих моделях, независимо от того, были ли контакты разобраны в уже слившихся слоях или еще не полностью сформированы в процессе роста. субконфлюентные культуры.

Подвлияние или разборка межклеточных контактов потенцирует эффект TGF-β1 на активность промотора SMA. Клетки LLC-PK1, выросшие до 100% или 30% слияния, котрансфицировали pSMA-Luc (0,5 мкг / лунку) и конструкцией люциферазы Renilla (pRL-TK, 0,05 мкг / лунку). Через 16 часов клетки промывали и инкубировали с бессывороточной нормальной (+) или с низким содержанием Ca 2+ (-) DMEM в течение 4 часов, а затем обрабатывали носителем (-) или 10 нг / мл TGF-β1 (+ ) в течение 24 часов. После лизиса активность люцифераз Firefly и Renilla определяли люминометрией.Значения были нормализованы к базовой активности, измеренной в группе, получавшей 100% сплошной носитель, в присутствии нормального кальция ( n = 6).

TGF-β1 стимулирует транскрипционную активность β-катенина в трубчатых клетках LLC-PK1

Поскольку β-катенин выполняет двойную функцию в качестве компонента адгезивного соединения и коактиватора транскрипции, и он перераспределяется во время EMT в LLC-PK1 клеток (, 15, и), он может действовать как медиатор контактно-зависимых транскрипционных ответов.Чтобы обратиться к этой возможности, мы сначала определили, может ли TGF-β1 стимулировать β-катенин-зависимую транскрипцию. Клетки с 30% слияниями трансфицировали β-катенин-зависимым репортером TopFLASH или его неактивным мутантом FopFLASH, а затем подвергали воздействию носителя или TGF-β1. Базальная активность TopFLASH была в 10 раз выше, чем активность FopFLASH, что указывает на то, что экспрессия TopFLASH отражает специфичную для β-катенина транскрипцию и что существует легко обнаруживаемая β-катенин-зависимая транскрипция даже в нестимулированных субконфлюэнтных клетках.Важно отметить, что TGF-β1 индуцировал двукратное увеличение активности TopFLASH, в то время как он не оказывал значительного влияния на маргинальную активность FopFLASH. Более того, LiCl, ингибитор деградации β-катенина, также стимулировал активность TopFLASH. Вестерн-блоттинг подтвердил, что LiCl действительно увеличивает стабильный уровень β-катенина в клетках LLC-PK1. Вместе эти находки подтверждают, что непрерывная деградация β-catenin ограничивает передачу сигналов β-catenin в нестимулированных клетках. Затем мы исследовали кинетику TGF-β1-индуцированного ответа TopFLASH.показывает, что активность TopFLASH постепенно увеличивалась в течение первых 24 часов после обработки TGF-β1, а затем достигла плато.

TGF-β1 активирует β-катенин-зависимую репортерную конструкцию TCF / LEF TopFLASH. A: Клетки, выросшие до 30% слияния на 6-луночных планшетах, трансфицировали либо TopFLASH (0,5 мкг / лунку), либо его неактивным мутантом FopFLASH (0,5 мкг / лунку) вместе с pRL-TK (0,05 мкг / лунку). . Через шестнадцать часов после трансфекции среду заменяли бессывороточной DMEM в течение 4 часов с последующим воздействием носителя (контроль), 10 нг / мл TGF-β1 или 30 ммоль / л LiCl.Клетки лизировали через 24 часа и определяли активность люциферазы. Значения были нормализованы к относительной активности люциферазы, измеренной в контрольной группе, трансфицированной TopFLASH, и выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 8). Блот показывает влияние обработки LiCl на стабильный уровень β-катенина. Равную нагрузку определяли путем зондирования блота на тубулин. B: Тридцать процентов конфлюэнтных культур, трансфицированных TopFLASH, как в A , обрабатывали носителем или 10 нг / мл TGF-β1 и лизировали в указанные моменты времени. C: Эффект субвлияния или разборки межклеточных контактов на активность TopFLASH исследовали путем трансфекции клеток при указанном слиянии смесями ДНК, как указано выше. Через 16 часов клетки промывали и дополнительно инкубировали в бессывороточной нормальной (+) среде или среде с низким содержанием кальция (-) в течение 4 часов перед обработкой носителем или 10 нг / мл TGF-β1. Через двадцать четыре часа клетки лизировали и измеряли активность люциферазы. Результаты выражены в виде средних значений ± SEM, нормализованных к активности, измеренной в группе, обработанной 30% сплошным носителем, в нормальной кальциевой среде ( n = 6).

В последующих экспериментах мы проверили, влияет ли состояние межклеточных контактов на β-катенин-зависимую транскрипцию. После достижения слияния базальная активность TopFLASH составляла ~ 60% от уровня, наблюдаемого в субконфлюэнтных культурах. Добавление TGF-β1 к конфлюэнтным слоям вызывало лишь небольшое (незначительное) увеличение TopFLASH по сравнению с этим уменьшенным исходным уровнем. Разборка соединений путем удаления Ca 2+ сама по себе не оказывала значительного эффекта, но значительно усиливала индуцированное TGF-β1 увеличение активности TopFLASH.Вместе эти результаты показывают, что TGF-β1 индуцировал β-катенин-зависимую транскрипцию, и амплитуда этого эффекта зависела от состояния межклеточных контактов.

TGF-β1 восстанавливает β-катенин, но не E-кадгерин после дестабилизации клеточных контактов

Чтобы изучить механизм, посредством которого TGF-β1 стимулирует β-катенин-зависимую транскрипцию, мы исследовали судьбу соединительных белков после разборки межклеточных контактов. Удаление Ca 2+ привело к резкому снижению E-кадгерина и значительному снижению белка β-катенина, что указывает на то, что диссоциация контактов способствует деградации их компонентов.В интактных монослоях TGF-β1 не влиял на уровень этих белков. Однако, когда TGF-β1 был добавлен к монослоям, содержащимся в среде без Ca 2+ , он оказывал совершенно разные эффекты на два соединительных белка: хотя он не влиял на деградацию E-кадгерина, он в значительной степени предотвращал потерю β-катенин. Массовое подавление E-cadherin, трансмембранного партнера по связыванию β-catenin, вместе с избирательным восстановлением β-catenin должно увеличивать уровень свободного β-catenin.В соответствии с этим предположением, в интактных клетках β-катенин присутствовал как в цитозольной, так и в цитоскелетной (нерастворимой в тритоне) фракции, тогда как после обработки с низким содержанием Ca 2+ плюс TGF-β1 восстановленный β-катенин не связывался с цитоскелет (, справа).

TGF-β1 спасает β-катенин, но не E-кадгерин, от деградации, вызванной контактной разборкой. A: Конфлюентные клетки LLC-PK1 инкубировали в бессывороточной нормальной (+) или с низким содержанием кальция (-) DMEM в течение 16 часов, а затем обрабатывали носителем (-) или 4 нг / мл TGF-β1 (+) для 24 часа.Затем клетки промывали и лизировали в буфере для лизиса Triton. Аликвоты из полных клеточных лизатов и экстрактов, нерастворимых в тритоне, подвергали SDS-PAGE, и компоненты адгезивного соединения определяли вестерн-блоттингом. Равную нагрузку проверяли повторным зондированием мембран на β-актин. B: Конфлюэнтные клетки обрабатывали диметилсульфоксидом-носителем (ДМСО) или ингибитором протеасом MG132 (1 мкмоль / л) с последующей инкубацией в нормальной (+) или низкокальциевой (-) среде в присутствии ДМСО или MG132 в течение 24 часов. .β-катенин и E-кадгерин измеряли вестерн-блоттингом в общих клеточных лизатах. Мембрану перепробовали на тубулин. C: Конфлюэнтные клетки инкубировали в нормальной или низкокальциевой (-) среде в присутствии или отсутствии 30 ммоль / л LiCl в течение 30 минут или 24 часов, как указано. Впоследствии клетки лизировали, и β-катенин и тубулин (в качестве контроля нагрузки) определяли вестерн-блоттингом. D: Для оценки роли контактной разборки в деградации β-катенина синтез белка блокировали в конфлюэнтных монослоях циклогексимидом 100 мкг / мл, и клетки инкубировали в течение 30 минут или 24 часов в присутствии или в отсутствие Ca . 2+ .Обратите внимание, что удаление Ca 2+ сильно стимулировало потерю β-катенина также в присутствии циклогексимида, указывая на то, что он ускоряет деградацию β-катенина.

Чтобы понять механизм, ответственный за уменьшение белка β-catenin при контактной разборке, мы проверили, вносит ли деградация протеасомный путь вклад в этот процесс. MG132, мощный ингибитор протеасом, сильно снижает деградацию β-катенина, вызванную удалением Ca 2+ .Кроме того, LiCl, ингибитор киназы-3β гликогенсинтазы, фермента, который фосфорилирует и тем самым облегчает протеасомный процессинг β-катенина, также сильно снижает вызванное удалением Ca 2+ падение белка β-катенина. Вместе эти данные предполагают, что протеасомная деградация участвует в элиминации β-катенина, а TGF-β1 ингибирует этот процесс. Интересно, что MG132 не ингибирует вызванную контактной разборкой потерю E-cadherin, предполагая, что подавление E-cadherin может быть связано с альтернативными путями деградации и / или ингибированием его синтеза.Ожидается, что фармакологическое ингибирование деградации β-катенина уменьшит потерю β-катенина, даже если контактная разборка не ускоряет деградацию β-катенина как таковую , но ингибирует синтез β-катенина. Чтобы выяснить, действительно ли контактная разборка влияет на деградацию β-катенина, мы ингибировали синтез белка с помощью циклогексимида и протестировали эффект удаления Ca 2+ в этих условиях, когда любое изменение должно быть связано с разницей в деградации. Циклогексимид, добавленный отдельно, через 24 часа незначительно снижал уровень β-катенина.Важно отметить, что удаление Ca 2+ сильно облегчает потерю β-катенина даже в присутствии циклогексимида, указывая на то, что нарушение контактов действительно способствует деградации β-катенина. Эти результаты не исключают возможность того, что измененный синтез также способствует снижению β-катенина.

β-катенин участвует в индуцированной TGF-β1 активации промотора SMA и экспрессии белка.

. β-катенин в процессе.Таким образом, мы намеревались вмешаться в β-катенин и проверить влияние этой манипуляции на активность промотора SMA и экспрессию белка. Мы использовали конструкцию, которая кодирует химеру зеленого флуоресцентного белка (GFP) и цитозольный хвост N-кадгерина. Эта конструкция предлагает уникально селективный способ ингибирования зависимой от β-катенина передачи сигналов: она связывается со свободным β-катенином, но не нарушает функцию β-катенина в соединениях клеток. 39 Конфлюэнтные клетки котрансфицировали контрольной плазмидой или плазмидой N-cad плюс репортерной системой SMA-люцифераза, и активность промотора тестировали в условиях, когда целостность контакта изменялась с помощью Ca 2+ в отсутствие или в присутствии TGF. -β1.В контрольной группе промотор проявлял такое же синергетическое поведение, как показано на. В клетках, трансфицированных N-cad, только TGF-β1 вызывал слабую активацию, аналогичную контрольной, трансфицированной пустой плазмидой, в то время как активация, индуцированная удалением Ca 2+ , была несколько снижена. Важно отметить, что N-cad подавлял устойчивую активацию Ca 2+ -удаления плюс TGF-β1 на 65%. Чтобы подтвердить, что вмешательство в передачу сигналов β-катенина ингибирует активацию промотора SMA, мы использовали другую конструкцию, доминантно-отрицательный dN-TCF4.Эта конструкция препятствует β-катенин-зависимой транскрипции, конкурируя с эндогенными факторами транскрипции TCF. 40 dN-TCF4 незначительно снижал активацию промотора SMA, вызванную удалением TGF-β1 или Ca 2+ , и сильно (~ 50%) подавлял активацию промотора, вызванную комбинацией двух стимулов. Вместе эти данные предполагают, что β-catenin участвует в регуляции промотора SMA во время EMT, и показывают, что ингибирование передачи сигналов β-catenin нарушает синергизм между TGF-β1 и активацией промотора SMA, вызванной разборкой клеток.

Вмешательство в передачу сигналов β-катенина ингибирует TGF-β1 плюс низкую индуцированную кальцием активацию промотора SMA. Клетки, выросшие до слияния, трансфицировали pSMA-Luc (0,5 мкг / лунку) вместе с pRL-TK (0,05 мкг / лунку) и либо пустым вектором (pcDNA 3 , ​​2 мкг / лунку), либо N-cad-GFP или доминантным -отрицательный TCF4 (dN-TCF4). Через день после трансфекции клетки промывали и инкубировали в бессывороточной нормальной (+) или с низким содержанием кальция (-) DMEM в течение 4 часов, а затем подвергали воздействию носителя (-) или 10 нг / мл TGF-β1 (+) в течение 24 часов. .Впоследствии активность люциферазы определяли и нормализовали по активности, измеренной в клетках, обработанных носителем, в нормальной кальциевой среде в каждой группе, трансфицированных либо pcDNA 3 , ​​либо различными тестовыми плазмидами ( n = 6). Клеточные лизаты получали из каждой трансфицированной группы и зондировали соответствующими антителами, то есть анти-GFP для N-cad-GFP и анти-myc для меченного myc dN-TCF4. Обработки (TGF-β1, Ca 2+ - удаление), которые были начаты после 24 часов трансфекции, не влияли на экспрессию трансфицированных конструкций.

Затем мы исследовали, влияет ли передача сигналов β-катенина на белок SMA. Это важный вопрос, поскольку сильная (14-20-кратная), но не умеренная (≤5-кратная) активация промотора соответствовала экспрессии белка SMA, что предполагает наличие порога. Для отслеживания экспрессии SMA 30% конфлюэнтных культур трансфицировали GFP или N-cad-GFP, экспонировали TGF-β1 и окрашивали на SMA. После 3-дневной обработки TGF-β1 ~ 45% клеток, трансфицированных GFP, были SMA-положительными.Напротив, только 21% клеток, экспрессирующих N-cad-GFP, окрашивался на SMA, что указывает на то, что N-cad-GFP проявляет сильное (> 50%) ингибирование экспрессии SMA по сравнению с GFP.

Хелатирование β-катенина ингибирует TGF-β1-индуцированную экспрессию белка SMA. A: Клетки, выращенные на покровных стеклах, трансфицировали одним GFP или N-cad-GFP (2 мкг / лунку) при 30% слиянии за 16 часов до обработки 4 нг / мл TGF-β1. Через 3 дня клетки фиксировали, повышали проницаемость и окрашивали на SMA. Успешно трансфицированные клетки идентифицировали по GFP-положительности (GFP, , нижний ). Стрелки указывают идентичные ячейки. Экспрессия SMA не была обнаружена в клетках, трансфицированных либо GFP, либо N-cad-GFP без добавления TGF-β1 (не показано). B: Для количественной оценки 100 GFP-положительных клеток подсчитывали в каждом из трех независимых экспериментов. Значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение, P <0,02. C: N-cad-GFP был клонирован в pFB-neo ретровирус (pFB-N-cad-GFP), что обеспечивало по меньшей мере 80% -ную степень инфицирования. Клетки с 30% слиянием трансдуцировали pFB-Neo (контроль), или pFB-GFP, или pFB-N-cad-GFP.Через 16 часов клетки обрабатывали носителем (-) или 4 нг / мл TGF-β1 (+) в течение 3 дней, затем лизировали и исследовали равные количества общих клеточных лизатов на SMA. Мембрану повторно зондировали на тубулин, чтобы проверить равную нагрузку. Белок SMA был количественно определен денситометрией и нормализован до уровня тубулина. D: Клетки, выросшие до 100% слияния, трансдуцировали вирусом pFB-GFP или pFB-N-cad-GFP. Через 16 часов клетки промывали и инкубировали в среде DMEM с нормальным (+) или низким содержанием кальция (-). После 3-дневной обработки носителем (-) или TGF-β1 клетки лизировали и измеряли экспрессию SMA.

Мы также обнаружили экспрессию SMA биохимически. Этот подход более точен, чем подсчет трансфицированных клеток, потому что в последнем случае оценка основана на ответе «все или ничего» (SMA + по сравнению с SMA-), и частично подавленная экспрессия не может быть точно оценена. Для этого мы создали ретровирус, экспрессирующий N-cad-GFP. Вирусная трансдукция приводила к эффективности доставки гена от 80 до 90%, о чем судили по положительности GFP (не показано). Мы использовали обе модельные системы (субвлияние и удаление Ca 2+ ), чтобы проверить влияние N-cad или GFP на белок SMA.Вестерн-блоттинг, представленный в, демонстрирует, что инфицирование N-cad вирусом эффективно подавляло индуцированную TGF-β1 экспрессию SMA в обеих моделях EMT.

Наконец, мы рассмотрели, является ли недостаточная передача сигналов β-catenin в конфлюэнтных культурах важным фактором снижения способности TGF-β1 стимулировать промотор SMA. Если это так, увеличение свободного β-катенина путем ингибирования его деградации должно увеличивать индуцированную TGF-β1 активность промотора SMA. Чтобы проверить эту идею, мы использовали LiCl, так как он стимулировал активность TopFLASH даже сильнее, чем TGF-β1.Конфлюэнтные клетки в нормальной среде Ca 2+ подвергали воздействию 30 ммоль / л NaCl (в качестве контроля) или LiCl в отсутствие или в присутствии TGF-β1 и определяли активность промотора SMA. Хотя LiCl имел лишь умеренный эффект в отсутствие TGF-β1, он значительно усиливал индуцированную TGF-β1 активацию промотора SMA. LiCl вызывает 2–3-кратное увеличение эффекта TGF-β1, повышая общую активацию промотора до 10–15-кратного. Поскольку эта активация приблизилась к уровню, при котором экспрессия SMA произошла после удаления Ca 2+ , мы проверили белок SMA с помощью вестерн-блоттинга.Примечательно, что LiCl восстанавливает способность TGF-β1 индуцировать детектируемую продукцию SMA в конфлюэнтных слоях, хотя эффект был значительно слабее, чем после полного разрушения клеточных соединений. Вместе эти данные показывают, что специфическое ингибирование функции β-катенина существенно снижает активность промотора SMA, индуцированную TGF-β1, и экспрессию белка, тогда как усиление передачи сигналов β-катенина восстанавливает активность промотора.

Влияние LiCl на активацию промотора SMA, индуцированную TGF-β1, и экспрессию белка в конфлюэнтных культурах. A: Конфлюэнтные клетки трансфицировали pSMA-Luc и pRL-TK, а затем подвергали воздействию 30 ммоль / л NaCl (-, контроль) или LiCl (+) в течение 1 часа с последующей 24-часовой обработкой носителем или TGF. -β1. Активность промотора SMA была нормализована для группы, обработанной NaCl и носителем ( n = 8). B: Конфлюэнтные клетки обрабатывали, как указано выше, за исключением того, что белок SMA определяли вестерн-блоттингом после 3-дневного воздействия носителя или TGF-β1.

Обсуждение

Наши исследования открывают новое понимание патофизиологии эпителиально-миофибробластного перехода, процесса, центрального в тубулоинтерстициальном фиброзе.Мы предоставляем доказательства того, что начальное отсутствие или потеря межклеточных адгезий является предпосылкой для того, чтобы TGF-β1 индуцировал полный переход миофибробластов, и что β-catenin является ключевым компонентом контактно-зависимой регуляции EMT. В частности, передача сигналов β-катенина играет сильную потенцирующую и синергетическую роль в индуцированной TGF-β1 активации промотора SMA и экспрессии белка. Было показано, что TGF-β1 подавляет ключевые белки, контактирующие с клетками, 13–15,42 , а потеря контактов с клетками, вызванная TGF-β1, была идентифицирована как ранний шаг в EMT. 14 Более того, наши данные свидетельствуют о существовании реципрокных регуляторных отношений. В частности, для начального трансформирующего эффекта TGF-β1 может потребоваться местное повреждение клеточных соединений. Это мнение подтверждается нашими выводами о том, что, хотя интактные монослои устойчивы к полной трансформации TGF-β1, три различных метода, которые мешают контактам с клетками (субконтакт, ранение и удаление Ca 2+ ), восстанавливают способность TGF-β1. для индукции трех основных характеристик перехода миофибробластов (подавление E-кадгерина, усиленная продукция фибронектина и экспрессия SMA).Основываясь на этих наблюдениях, мы предлагаем модель с двумя ударами для EMT. Происходит начальная потеря целостности эпителия, которая, in vivo , может быть связана с различными поражениями, которые, как известно, вызывают фиброз, включая отложение иммунного комплекса, 8 гипоксическое повреждение, 43 непроходимость мочеточника или физическое повреждение. 44 Когда эти поврежденные участки подвергаются действию TGF-β1 (второе попадание), они служат начальными очагами для EMT, откуда он распространяется саморасширяющимся способом. Эти локальные группы клеток претерпевают переход, что приводит к усилению продукции TGF-β1 и отложению внеклеточного матрикса (ЕСМ), что, в свою очередь, разрушает соседние области.Примечательно, что в других трубчатых клеточных системах TGF-β1 вызывал EMT в очевидно сливающихся слоях (например, 10,13 ). Однако в большинстве этих исследований TGF-β1 добавлялся до того, как монослой достиг слияния, и он становился сливающимся только к концу нескольких дней воздействия TGF-β1. Интересно, что Strutz et al. 45 отметили, что EMT в клетках проксимальных эпителиальных канальцев мыши (MCT) была более выраженной, когда обработка TGF-β1 начиналась с более низкой плотности. Кроме того, было показано, что тканевые фибробласты спонтанно дифференцируются в миофибробласты с гораздо более высокой частотой при посеве с низкой плотностью. 46 Наши данные вместе с этими наблюдениями предполагают, что контактно-зависимая чувствительность к TGF-β1 является общим явлением. Однако можно предположить, что различные клетки или сегменты канальцев по-разному чувствительны к ингибирующему эффекту целостности контакта на индукцию EMT под действием TGF-β1 или других стимулов. 47

Мы обнаружили, что неспособность TGF-β1 вызывать полный переход в конфлюэнтных культурах не является следствием общей невосприимчивости. Эти данные согласуются с предыдущими наблюдениями, показывающими, что определенные особенности EMT присутствуют в очевидно слившихся клетках. 29 Однако в нашей модели отсутствуют определенные компоненты, необходимые для полного эффекта, и мы определили один из них как свободный β-катенин.

Существует значительный объем литературы, предполагающей, что передача сигналов β-catenin играет важную роль в EMT во время туморогенеза и метастазирования (напр., 48-50 ). В соответствии с этим представлением, потеря E-cadherin, которая, вероятно, увеличивает уровень свободного β-catenin, способствует EMT, тогда как экспрессия E-cadherin может обратить трансформированный фенотип. 19–22 В качестве более прямого указания на роль β-катенина, Eger et al. 26 показали, что в эпителиальных клетках молочной железы, которые экспрессируют слитый белок рецептора фос-эстрадиола, эстрадиол вызывает усиление β-катенин-зависимой транскрипции. сопутствующий ЕМТ. За несколько дней до представления настоящего исследования та же группа сообщила, что передача сигналов β-катенина и TGF-β1 кооперировалась для поддержания мезенхимального фенотипа в опухолевых клетках молочной железы. 28 Кроме того, было обнаружено, что сверхэкспрессия LEF-1 провоцирует ЕМП в эпителиальных опухолевых клетках. 51 Недавние исследования показали, что TGF-β1 ингибирует экспрессию E-кадгерина на уровне транскрипции также в клетках почечных канальцев. 42 Тем не менее, оставалось сомнительным, а на самом деле спорным, 29,30,36 , вносит ли β-катенин в нормальные эпителиальные клетки, без сверхэкспрессии сигнальных белков, вклад в TGF-β1-индуцированную EMT, и особенно в дифференцировку миофибробластов. . Субконфлюэнтные культуры могут содержать меньше E-кадгерина, чем зрелые полностью конфлюэнтные культуры, что само по себе может способствовать зависимой от β-катенин передаче сигналов.Однако, чтобы доказать участие β-катенина в TGF-β1-индуцированном переходе эпители-миофибробласты, необходимо продемонстрировать, что цитокин индуцирует усиленную передачу сигналов β-катенина и что вмешательство в β-катенин приводит к подавлению перехода, индуцированного TGF-β1. Что касается первого критерия, наши предыдущие 15 и текущие результаты, а также Tian et al. 29 показали, что в нормальных эпителиальных клетках почек TGF-β1 индуцирует диссоциацию β-катенина из контактов и транслокацию в ядро.Разборка контактов путем удаления Ca 2+ также приводит к высвобождению β-катенина из соединений, однако это само по себе не приводит к EMT. Этот факт полностью согласуется с нашим открытием, что в отсутствие TGF-β1 как E-cadherin, так и β-catenin быстро деградируют после контактной разборки. Однако мы показали, что TGF-β1 избирательно восстанавливает β-катенин, тем самым позволяя ему оказывать нижестоящие эффекты. Недавние исследования предлагают вероятные механизмы, посредством которых TGF-β1 может стабилизировать β-катенин; Было показано, что TGF-β1 стимулирует киназу Akt 52 и интегрин-связанную киназу (ILK), 17 , обе из которых участвуют в EMT.Недавно было обнаружено, что индуцированная TGF-β1 активация ILK является необходимой и, возможно, достаточной для EMT в клетках почечных канальцев. 17 Важно отметить, что обе киназы могут активировать β-катенин / LEF-зависимую транскрипцию путем ингибирования киназы-3β гликогенсинтазы, фермента, который фосфорилирует β-катенин, направляя его на деградацию. 53

Мы показываем, что индуцированное TGF-β1 повышение уровня свободного β-катенина достаточно для осуществления TCF / LEF-зависимой транскрипции (TopFLASH). Этот результат отличается от результатов, полученных на канальцах гепатомы 30 и HK2, 29 , где TGF-β1 не стимулировал TopFLASH.Однако между экспериментальными системами есть важные различия. Помимо того факта, что клетки гепатомы обладают аномальной передачей сигналов β-катенина, примечательным моментом является то, что без трансфекции LEF-1 активность TopFLASH была маргинальной в клетках HK2. Таким образом, в этих клетках лимитирующим фактором является LEF-1, а не β-катенин. Очевидно, что это не так в нашей модели, где и TGF-β1, и LiCl активируют TopFLASH, что указывает на наличие достаточного количества TCF / LEF. В этом отношении различные клетки канальцев или сегменты канальцев могут показывать различия в своей чувствительности к переходу в миофибробласты.Вторым важным моментом является то, что клетки HK2 были конфлюэнтными при заражении TGF-β1, и, как мы показали, в этих условиях активация β-катенин-зависимой транскрипции очень слабая. Соответственно, базальная активность TopFLASH была обратно пропорциональна слиянию клеток, открытие согласуется с недавними исследованиями, показывающими, что плотность клеток регулирует клеточную локализацию и транскрипционную активность β-катенина. 54,55 Таким образом, состояние клеточных контактов определяет общую величину TCF / LEF-зависимой транскрипции, индуцированной TGF-β1.Чтобы выяснить, влияет ли β-catenin-зависимая передача сигналов на переход миофибробластов, мы использовали две конструкции, которые мешают передаче сигналов β-catenin: цитозольный хвост N-кадгерина (N-cad) и dN-TCF4. Оба они сильно подавляли синергетический эффект, оказываемый разборкой клеточного контакта плюс TGF-β1 на промотор SMA. Эти данные вместе с открытием того, что LiCl частично восстанавливает эффект TGF-β1 в конфлюэнтных клетках, предоставляют доказательства участия пути β-катенин-TCF / LEF в регуляции промотора SMA.Однако стоит отметить, что TGF-β1 может активировать передачу сигналов TCF / LEF не только за счет усиления связывания β-катенина с TCF / LEF. Кроме того, было показано, что TGF-β1 и β3 стимулируют ассоциацию LEF-1 с белками SMAD, и этот комплекс может индуцировать транскрипцию через SMAD-связывающие элементы. 30,56 Более того, TGF-β1 способствует ассоциации SMAD4 и 3 с β-катенином, 31 , который также может рекрутировать TCF / LEF, инициируя кооперативную регуляцию, которая включает как SMAD, так и TCF / LEF-зависимые мотивы.Эти взаимодействия ясно указывают на совместные, синергетические отношения между путями SMAD и β-catenin. В соответствии с этим, хотя ингибирование β-катенина сильно снижает влияние TGF-β1 на промотор SMA и экспрессию белка, эти действия не были полными. Интересно, что интактные контакты обладали более сильным ингибирующим эффектом, чем элиминация β-catenin, предполагая, что другие компоненты клеточных соединений также участвуют в этой регуляции. В связи с этим, экспрессия усеченных мутантов белка плотных контактов ZO-1, как сообщается, вызывает EMT 48 и индуцирует экспрессию SMA. 57 Однако укороченный ZO-1 может также действовать через β-катенин, поскольку его трансформирующий эффект может быть предотвращен за счет подавления β-катенина. 48 Будущие исследования должны выяснить, какие другие соединительные белки вносят вклад в EMT.

Наконец, остается главный вопрос: как β-catenin регулирует транскрипцию SMA? β-катенин может образовывать комплекс с белками SMAD и действовать через SMAD-зависимые мотивы, и / или его действие является косвенным. В соответствии с последним механизмом, сам промотор SMA не содержит мотивов связывания TCF / LEF, и ни LiCl, ни сверхэкспрессия β-катенина недостаточны для индукции экспрессии SMA в отсутствие TGF-β1.Однако существует ряд известных зависимых от β-катенина генов-мишеней, продукты которых могут быть критически важными для экспрессии SMA. Среди них потенциальными кандидатами являются гены, кодирующие фибронектин и металлопротеиназы, которые регулируются β-catenin 34,58 и, как предполагается, играют важную роль в регуляции экспрессии SMA. 59,60 Необходимы дальнейшие исследования для рассмотрения этих возможностей.

После повышения регуляции β-катенин может модифицировать экспрессию целого ряда ключевых белков во время ЕМТ: например, он может ускорять понижающую регуляцию E-кадгерина, 33 повышающую регуляцию виментина 35 и фибронектин. 34 В самом деле, белки Wnt, внеклеточные активаторы канонической передачи сигналов β-catenin, участвуют в качестве медиаторов почечного фиброза. 44

Таким образом, мы предоставляем доказательства того, что целостность клеточного контакта и передача сигналов β-catenin регулируют экспрессию SMA во время TGF-β1-индуцированной EMT.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *