Меню Закрыть

3 d окрашивание: техника покраски и 14 модных идей с фото

Содержание

3D окрашивание волос. 115 фото и техника

Такое окрашивание позволяет придать цвету волос многогранности и естественности, ведь натуральный волос выглядит гораздо живее чем окрашенный, и все это благодаря присутствию в нем разных тонов, это можно увидеть на фото до и после.

3D окрашивание подразумевает один и тот же цвет, но разные его тона — этим и отличается от колорирования, которое сулит внесение контрастных цветов.

Кому подходит 3D окрашивание?

3D окрашивание подходит абсолютно всем, не зависимо от цвета волос. Как блондинка так и шатенка могут разнообразить свой цвет волос.

Тонким и редким волосам подобное окрашивание придаст объем, а окрашенные волосы будут выглядеть живо, как натуральные.

Брюнетки редко прибегают к 3D окрашиванию, ведь могучий и бархатный черный цвет лучше всего смотрится ровным тоном.

Виды 3D окрашивания

Блонды с 3D окрашиванием блестят золотыми переливами для теплых оттенков, а холодные блондинки окрашивают пряди пепельными бликами.

Русые цвета волос, окрашенные 3D технологией просто потрясающе выглядят, это видно на фото, которые опровергнут тот факт, что русый цвет волос — «мышиный». Темные и светлые, теплые и холодные русые волосы засияют пепельными и бронзовыми переливами.

Шатенки могут насытить свои волосы многогранными коричневыми цветами. 3D окрашивание позволит каштановым волосам сиять бронзой, холодным и шоколадным цветам проявить всю свою красноватую или сероватую глубину.

Рыжие девушки просто обязаны сделать такое окрашивание, ведь богатые медные оттенки смотрятся очень естественно с 3D окрашиванием и подходящим цветотипом лица. Темные и клубничные рыжие — все они потрясающе заиграют объемом и бликами.

Черные волосы можно лишь насытить бликами. Отдельные мягкие прядки будут окрашены в графитовый оттенок черного, что придаст волосам стальной блеск.

По фото ниже можно наблюдать невероятно красивые результаты 3D окрашивания на разных цветах волос.

3д окрашивание волос пошагово на темные и светлые волосы » WomanMirror

Еще не так давно натуральные и красивые оттенки волос считались для девушек утопией. Любая барышня, у которой возникало желание поменять цвет своей шевелюры, знала, что достичь естественности образа с покрашенными прядями будет довольно сложно. К счастью, стремительно развивающиеся современные технологии затронули и процессы окрашивания волос.

Мало кому известно, почему естественный оттенок локонов выглядит более объемным и глубоким по сравнению даже с самой профессиональной краской. На самом деле причиной этому является неравномерность цветовых оттенков. Отличительная особенность естественной шевелюры заключается в содержащейся в ней гамме цветов, поражающих своей неоднородностью. Так при свете дня и в темное время суток локоны выглядят абсолютно по-разному. На протяжении длительного периода времени такого эффекта не могли добиться ни при помощи колорирования, ни мелирования. Однако с тех пор как появилось объемное 3д окрашивание волос, достичь такой результат стало вполне реально.

Особенности метода окрашивания волос с эффектом 3д

Главной особенностью технологии является не только использование смежных оттенков, но и сама система нанесения краски.

  • В первую очередь необходимо отметить, что объемное 3d окрашивание волос подразумевает наличие основного оттенка и одного или двух дополнительных тонов. Обратите внимание, что все тона должны находиться в рамках одного цвета, что позволяет сделать плавный и более естественный переход. Более того, сочетание оттенков одного цвета создает эффект как глубины и полноты, так и объема.
  • Окрашивание волос 3д требует и определенной методики нанесения краски. Это объясняется тем, что при покраске локонов особое внимание нужно уделять прикорневой и затылочной части. Для того чтобы поддержать естественный переход, некоторые пряди необходимо окрасить при помощи дополнительного цвета.

Техника 3д окрашивания волос

Инструкция покраски шевелюры включает в себя несколько этапов:

  1. На первом этапе необходимо окрасить затылочную часть базисным оттенком.
  2. Затем, используя более светлый оттенок, красят несколько прядей около затылка, толщина которых составляет около 1,5 см.
  3. После этого, необходимо опуститься к низу затылка, прокрашивая пряди с помощью чередования светлого и темного оттенков.
  4. То же самое проделывают, переходя к височной части. Обратите внимание, что первую прядь нужно обязательно окрасить базисным цветом.
  5. Эта же схема наблюдается при работе с теменной областью, красить которую необходимо в последнюю очередь.

Конечно, абсолютно точной методики объемного 3д окрашивания не существует, поскольку все будет зависеть от длины шевелюры и количества используемых оттенков. Однако если поэтапно изучить вышеперечисленные принципы, они смогут помочь разобраться в основе технологии покраски шевелюры нового поколения. Главное пошагово следовать предложенной схеме.

3д окрашивание на светлые волосы

3 д окрашивание волос будет великолепно смотреться на блондинках. В этом можно убедиться, посмотрев на фото, на котором изображены волосы до и после объемного окрашивания. Этот довольно сложный цвет прядей должен быть естественным и гармоничным на столько, насколько это возможно, а ни в коем случае не напоминать куклу. Именно поэтому 3д окрашивание на светлые волосы будет как раз кстати.

Более того, окрашивание волос 3д позволит плавно переходить из одного цвета в другой. Так, к примеру, абсолютно реально перекраситься из черного цвета в светлый. Правда для этого нужно большое количество терпения, чтобы добиться качественного результата и сохранить здоровье своей шевелюры.

3д окрашивание на темные волосы

Первоначально 3d окрашивание волос было опробовано на светлых локонах, поскольку на блондинках такой эффект выглядит наиболее натурально. Однако со временем популярностью стало пользоваться и 3д окрашивание на темные волосы. Причина солнечных бликов на обладательницах темной шевелюры кроется в специальной технике покраски. Так, при передержке осветляющего красителя пряди могут получиться совсем неестественными, что абсолютно не украсит девушку. При этом обязательно провести процедуру тонирования, которая сгладит контраст между натуральными и обесцвеченными волосами.

Преимущества и недостатки 3D окрашивания шевелюры

Прежде чем решиться на современную процедуру необходимо изучить все положительные и отрицательные стороны этой покраски прядей. 3д окрашивание волос обладает рядом достоинств, таких как:

  • Оно создает иллюзию мелирования. Однако цвет при этом выглядит более естественно и, что немало важно благородно.
  • 3д волосы зрительно увеличиваются в объеме.
  • Данное мероприятие позволяет сделать любую прическу более привлекательной и ухоженной.
  • После 3д окрашивания цвет локонов более динамичный и интересно играющий на свету.
  • На “гриве” появляются блики, привлекающие внимание окружающих, что делает образ еще более женственным.
  • Техника 3д окрашивания волос выделяет определенные пряди или отдельные части прически.
  • Не зависимо от “роста шевелюры” цвет все равно остаётся довольно насыщенным, таким образом, корректировать его можно примерно раз в месяц.

Недостатки 3д окрашивания:

  • Техника является довольно сложной, поэтому проводить объемное 3d окрашивание самостоятельно в домашних условиях практически невозможно.
  • 3d волосы требуют дополнительного ухода. Неухоженные локоны будут казаться не переливающимися, а тусклыми и грязными.
  • Освежать цвет шевелюры нужно при помощи только опытного специалиста.
  • Если неправильно подобрать оттенки цвета, то результат, безусловно, не оправдает своих ожиданий.

Необходимо отметить, что эта техника покраски шевелюры считается совсем новой. В связи с этим существует не такое большое количество специалистов, которые выполнят работу на действительно высоком уровне. Немногие из них способны адекватно оценить пожелания клиента и выбрать нужные оттенки. Поэтому, если девушка решила сделать самой себе такой подарок, в первую очередь нужно уделить особое внимание поиску опытного мастера, иначе результат может получиться абсолютно непредсказуемым.

Видео: Техника объёмного 3D окрашивания волос

кому подойдет? (фото до и после)

На чтение 4 мин. Просмотров 19k. Опубликовано Обновлено

3д окрашивание волос – одна из модных новинок, которая уже успела снискать большую популярность у стилистов и колористов.

Что собою представляет 3D окрашивание?

Давайте вместе разберемся, что собою представляет покраска волос 3Д и что же это такое? Под окрашиванием прядей в технологии 3D необходимо понимать абсолютно новый метод, при котором на шевелюру наносят несколько тонов. Один из них – основной, его называют базой. Остальные 2-3 тона обязаны находиться в том же цветовом сегменте, но быть немножечко светлее. Правильный подбор оттенков – самый главный признак 3Д.

Окрашивание 3Д – достоинства и недостатки

Эта техника имеет массу весомых преимуществ:

  • Увеличивает объем, придает цвету глубину;
  • Не вредит здоровью волос — 3d красители содержат 85% натуральных компонентов;
  • Делает прическу более привлекательной и ухоженной, естественной и блестящей;
  • Освежает цвет лица;
  • Технология 3Д подходит абсолютно всем – и блондинкам, и шатенкам, и рыженьким, и брюнеткам. Но на темных волосах она смотрится эффектней;
  • В прядях создаются блики, которые придают динамику волосам и позволяют им играть под солнечными лучами;
  • Позволяет обозначить отдельные части прически или же выделить пряди в обрамлении лица;
  • Создает визуальный эффект ламинирования;
  • Может смело выполняться на ослабленных волосах;
  • Для покраски применяют голографический краситель с восстанавливающим эффектом, что позволяет шевелюре быть подвижной и живой;
  • При отрастании корней цвет будет таким же ярким, потому корректировку можно делать лишь раз в месяц.

Что касается недостатков, их будет не так уж много:

  • Эта техника под силу только опытным мастерам, ведь окрасить пряди в 3Д – это задача не из легких;
  • Окрашенным волосам – дополнительный уход. Если пряди запустить, результат будет плачевным;
  • Неправильный подбор оттенков негативно отразится на конечном результате;
  • Освежать корни и цвет также будет очень сложно – именно это объясняет достаточно большую цену проводимой процедуры;
  • 3d покраску крайне сложно выполнять в домашних условиях.

До и после окрашивания:

Что нужно для процедуры и как ее выполнять?

Если вы все же решитесь провести процедуру дома, обязательно подготовьте такие материалы:

  • Голографическая краска 3-4 оттенков (базовый и дополнительные). Средства берите одной марки! Некоторые мастера пользуются обычной краской – эффект также неплохой;
  • Защитный фартук;
  • Перчатки;
  • Специальная фольга, разрезанная на полоски;
  • Неметаллические миски для смешивания составов;
  • Несколько кисточек (для каждого цвета краски) шириной 2-3 см;
  • Пластиковые зажимы – понадобятся для разделения волос на зоны;
  • Мерный стакан для измерения нужного количества краски.

Процедура окрашивания в технологии 3Д может выполняться двумя способами. Рассмотрим каждый из них.

Способ 1

  1. Для начала шевелюру нужно поделить на зоны. Для удобства воспользуйтесь зажимами.
  2. На затылочном участке отделите треугольник с направленной к шее вершиной. Прокрасьте его в основной или же базовый оттенок.
  3. От каждой стороны этого треугольника отделите по одной прядке (ширина – 1,5- 2 см). Покрасьте их в дополнительный тон (на тон светлее основного).
  4. Немного ниже отделите еще по одной такой же прядке. Нанесите на них краску, которая будет светлее предыдущего оттенка на полтона или тон.
  5. Для следующей пары прядей возьмите оттенок из третьего шага (на тон светлее основного).
  6. Теперь идет основной цвет.
  7. Повторите шаг 3-5.
  8. Вновь нанесите базовый цвет, двигаясь к нижней части затылка.
  9. Нижне затылочную часть (5-7 см от шеи) прокрасьте по той же схеме, чередуя основной цвет с дополнительными.
  10. Отделите височные зоны. Возьмите одну прядку сверху и смажьте ее главным цветом. Нанесите дополнительные оттенки и вновь вернитесь к основному. Прядки около лица прокрасьте базовым оттенком!
  11. По точно такой же схеме обработайте теменную зону. Не забудьте отделять отдельные пряди волос полосочками фольги, дабы не смешать тона.
  12. Выдержав 20-40 минут (время зависит от исходного цвета волос), вымойте голову водой без применения шампуня.

Внимание! Если хотите сделать стрижку или подравнять концы, сделайте это до процедуры. Мастеру нужно учесть слоистость и длину волос. Краситель нужно наносить только на сухие пряди, уложенные в прическу.

Способ 2

3д окрашивание прядей может также выполняться по принципу разнопрядного мелирования, при котором на каждую прядку наносят краску другого оттенка. Затем шевелюру прокрашивают основным красителем. Конечно, в этом случае о полноценном 3Д эффекте говорить не приходится. Данный способ усилит блеск и позволит обыграть основной цвет шевелюры.

Вам будет интересно:

3d окрашивание волос и креативное окрашивание волос в салоне красоты «NuAnce»

Самые модные техники окрашивания! Лучшие материалы от Paul Mitchell (США)!

Данная услуга предоставляется в салонах:

Модные тенденции в окрашивании колеблются от сезона к сезону! Но парикмахеры-стилисты студии красоты NuAnce всегда в курсе всех новинок!

Парикмахеры-стилисты NuAnce имеют высокую квалификацию в области колористики и постоянно предлагают различные новшества в области окрашивания волос. Самыми востребованными тенденциями сегодня являются техника омбре и брондирование. Также, по-прежнему очень актуально окрашивание в один тон (наиболее приближенный к натуральному оттенку). Мелирование и частичное колорирование тоже в тренде.

Наши мастера одни их самых лучших по окрашиванию в нужный оттенок блонда! Любые, самые современные техники окрашивания всегда доступны для Вас в NuAnce. Мастера работают на самой известной американской косметике для волос PAUL MITCHELL. Уходы и красители этого бренда используют топовые стилисты по всему миру. С окрашиванием в NuAnce Вы не только приобретете новый, модный образ, но и позаботитесь о здоровье своих волос!

Кратко о модных тенденциях

Брондирование – это методика модного окрашивания волос. С ее помощью можно воссоздать эффект, выгоревшего цвета на солнце, который встречается только у женщин, не пользующихся краской. Слово "бронд" – это соединение английских слов "brown" (шатен) и "blond" (блондин). То есть, в названии заложена суть метода – сочетание оттенков. Брондирование, в отличие от популярного некогда мелирования, способствует сохранению природной цветовой гармонии, так как отдельные пряди не обесцвечиваются радикально, а мягко высветляются на несколько тонов от главного цвета. "Выгоревшие" волосы при этом не выглядят поврежденными и безжизненными, а сверкают янтарными, пшеничными и медовыми бликами.

На пике популярности техника модного окрашивания омбре. Омбре, или деграде – это двухцветная окраска с размытой или резкой горизонтальной границей. В отличие от брондирования, этот способ основан на контрасте и допускает различные варианты переходов: от темных волос к светлым и наоборот, а также от мягкого естественного цвета к любому насыщенному. Выбор ограничен только фантазией. Деграде одинаково хорошо смотрится как на коротких стрижках, так и на длинных волосах, а окрашивание модными яркими цветами способно полностью изменить образ. Зрительный объем, созданный с помощью этой техники, можно усилить укладкой волнами или локонами. Самой стильной считается растяжка цвета от каштанового до блонда или наоборот. На темных волосах эффектно выглядит постепенный переход к красному, медному или золотистому, который оставляет впечатление пламени.

Также в NuAnce стилисты выполняют популярные сложные техники изменения цвета – 3D окрашивание, мелирование с естественными нотками – голливудское мелирование, частичное колорирование для брюнеток и блондинок.

В сочетании с такими уходовыми процедурами, как ламинирование, кератиновое восстановление или выпрямление, ботокс для волос, niophlex – ваше окрашивание будет просто бесподобно красивым, а волосы потрясающе ухоженными!

А для мужчин в NuAnce предлагается эксклюзивная, быстрая система безаммиачного окрашивания, сочетающие в себе эффективное ретуширование седины одновременно с уходом за волосами. Полученные оттенки выглядят естественно, без контраста с отрастающими корнями. Процедура занимает всего 10 минут и очень долго радует клиентов результатом!

Об используемых материалах

Стойкая краска для волос THE COLOR от PAUL MITCHELL содержит всего 1,5% аммиака. Ее основу составляет пчелиный воск и масло листа эвкалипта, защищающего от повреждений. Краска обеспечивает устойчивый цвет и закрашивание седины. Богатая палитра оттенков, удовлетворит потребности даже самой взыскательной клиентки.

Полироль Flash Finish™ от Paul Mitchell. Полироль – процедура, эксклюзивно представленная маркой Paul Mitchell. Это поверхностное покрытие волос, которое придаёт чистый, глянцевый тон и убирает нежелательные эффекты (жёлтые и жёлто-оранжевые оттенки). Краситель основан на растительных пигментах. Одновременно, Flash Finish™ обогащён гидролизованными соевыми протеинами (заполняют повреждённые участки структуры и выравнивают её по всей длине) и маслом мускатного ореха, нормализующим гидробаланс волоса и защищающим от негативных внешних воздействий. Наибольший эффект от полироли смогут оценить блондинки (оттенки от снежно-белого до светло-золотистого). При русых и более тёмных волосах полироль может применяться в качестве дополнительной восстанавливающей и защитной меры (улучшает внешний вид волос, придаёт блеск и т.п.).

Безаммиачные красители PM SHINES от Paul Mitchell

PM SHINES - это современные безаммиачные красители для полу-перманентного тонирования. Создают яркий, насыщенный оттенок, потрясающий блеск и одновременно ухаживают за волосами. PM SHINES содержит эксклюзивный увлажняющий комплекс IHC, проникающий в структуру, который восполняет нехватку влаги и препятствует её дальнейшей потере. Красители подходят даже для очень повреждённых волос, так как не содержат аммиака и обогащены эксклюзивным увлажняющим комплексом. Создают естественный искрящийся оттенок на осветлённых волосах, наполняют волосы яркостью и энергией. Они мгновенно становятся более эластичными и приобретают роскошный блеск.

Звоните, мы проконсультируем Вас по ценам, времени процедуры, используемых материалах более подробно. Про наших парикмахеров Вы можете почитать в разделе Специалисты.

Мы подготовили для вас полезные материалы:

3D окрашивание волос

3D окрашивание волос

3D окрашивание – это креативное окрашивание волос, новый парикмахерский тренд. Наша студия красоты OWN Clinic Studio предлагает уникальную процедуру 3D окрашивания волос, гарантирующую объемный эффект цвета благодаря прокрашиванию отдельных прядей изнутри, набранных в определенных зонах головы. Когда мы говорим о 3D окрашивании, речь не идет о красителях или марках. Имеется в виду особая техника окрашивания, которая основана на профессиональном выборе сочетания трех цветов единой цветовой палитры. Такие выбранные цвета следует разделить на основной тон, а также на два дополнительных, которые будут добавлены к основному, что позволит достичь эффекта объема и гармоничности. Краски, как правило, выбираются из одной цветовой гаммы, однако различных тонов. Оттенки не будут резко отличаться, что гарантирует мягкий, практически незаметный переход от тона к тону.


Дополнительные цвета наносятся по специальной схеме и именно на те прядки, которые были выбраны заранее, чтобы гарантировать эффект равномерного распределения тонов. Необходимо отметить, что 3D окрашивание – это сложное дизайнерское окрашивание волос, реализовать которое смогут только самые опытные профессионалы, обладающие необходимыми навыками и превосходным вкусом.

Именно по этой причине мы настоятельно Вам советуем воспользоваться услугами наших опытных мастеров, а не отдавать предпочтение более дешевым, но значительно менее качественным услугам мелких салонов. Очевидно, что справиться с последствиями неудачного 3D окрашивания окажется намного сложнее и дороже, нежели изначально воспользоваться безусловно качественными и профессиональными услугами мастеров OWN Clinic Studio.



Вы никогда не задумывались над тем, почему волосы натурального цвета чаще всего выглядят эффектнее, нежели окрашенные? Все дело в том, что обычное окрашивание действительно не создает ощущения объема, который присущ натуральному цвету волос. Парикмахеры уже давно пытаются бороться с данной проблемой. И некоторые уже нашли идеальное решение проблемы. Речь идет как раз о 3D окрашивании. К примеру, в нашей студии красоты мы уже давно успешно применяем данное решение, обеспечивающее нашим клиенткам сто процентный результат вне зависимости от типа волос, их цвета и длины. 3D окрашивание гарантирует эффект переливающихся объемных волос, что, таким образом, выгодно отличает их от волос, окрашенных по традиционной технологии в один тон.



Не станет большим преувеличением сказать, что 3D окрашивание кардинально изменило само представления о колористике. Прежние методики, при помощи которых парикмахеры стремились добиться похожего эффекта, к примеру, мелирование, просто не могло конкурировать с новым способом. Таким образом, сегодня у модниц появилась возможность изменить цвет волос, но сохранить при этом их естественный блеск. В то же самое время объем прически при 3D окрашивании будет заметно больше, что также, как было отмечено, является одной из немаловажных особенностей данной технологии окрашивания. 3D окрашивание волос от OWN Clinic Studio – Ваша возможность добиться естественного цвета волос и потрясающего объема надолго!

 

3D окрашивание волос - Академия Парикмахерского Искусства

3D окрашивание волос  - это создание трехмерного эффекта окрашивания волос.- это создание трехмерного эффекта окрашивания волос.

3D окрашивание волос

Именно Ренато Брунас воплотил в жизнь мечту любого технолога – колориста, создав трехмерное окрашивание волос. Более тридцати лет он шел к этому открытию- « Цвет волос в 3D объеме» или 3D окрашивание волос.

 

Самый современный компьютер по сравнению с нашими глазами – ничто! Он не может сравниться по световосприятию и цветопередаче с человеческим глазом. Да, компьютер всегда даст правильный ответ при загрузке верных данных и сможет определить свет и цвет. Но не в его силах передать объемное многообразие цветовых направлений, подвластное только человеческому глазу.

Энергия света и наши глаза встречаются каждое мгновение. Глаза, как телескоп, различают даже самые неуловимые цветовые изменения и фокусируются в нашем сознании… Мы – цвет и свет – как единое целое. Зная о безграничных возможностях объемного цветового восприятия человеческим глазом, многим художникам хотелось повторить этот шедевр. И, как закономерность прогресса в искусстве – желание создать объемные, трехмерные цвета не только в живописи, но и в других направлениях творческого развития. Самым интересным эффектом и интригующим искусством оказалось - 3D окрашивание волос.

Английский бренд «RENBOW» создал инновационную систему трехмерного окрашивания волос 3D и дал возможность увидеть всю многогранность оттенков, доступное человеческому глазу в одном цветовом решении. Вы спросите : «Как это возможно?» Ответ дал легендарный химик – колорист Ренато Брунас : «Чтобы сделать что – то трудное, нужно какое – то время. Чтобы сделать невозможное – нужно немножко больше времени».


Красители COLORISSIMOи RENCOLOR, компании RENBOW, в творческом дуэте создают эффект 3D окрашивания. Весь секрет в том, что разные молекулярные массы этих двух красителей обеспечивают разное формирование цветового пигмента внутри волоса и по окончанию окрашивания, волосы приобретают объемное светоотражение. Цвет волос становится ярким, но прозрачным, полным и многогранным. Даже при окрашивании в один тон волосы будут блестеть всеми цветами спектрального круга и только наши глаза смогут воспринять настроение наших волос.

В этом уроке я расскажу вам поэтапно, используя различные варианты и методы, которые может предложить .... Читать далее

 

Академия Парикмахерского Искусства и Дизайна Анастасии Капраловой

Приглашает посетить бесплатный пробный урок парикмахера для ознакомления с программой обучения, преподавателями - это поможет Вам сделать правильный выбор перейти на страницу записи...

Г. Москва, м. Текстильщики, ул. Саратовская улица, 14/1, Время работы с 9:00 до 19:00, без выходных.

Телефон отдел обучения +7(495) 532-57-49 и +7(925) 722-97-51

Телефон записи моделей +7(925) 198-31-08

3D окрашивание волос. Цвет с эффектом 3D! Фото


Мечтаете о максимально натуральном цвете волос, без седины? Хотите вернуть волосам блеск и объем? Слышали о 3D окрашивании волос? На вопросы о новой технике отвечает стилист салона красоты "Помада" Вячеслав Храмов.

 

 

– Вячеслав, в чем особенность 3D окрашивания волос?

 

– Суть такого 3D окрашивания волос в соединении теплых и холодных оттенков усиливающих глубину доминирующего цвета благодаря физическим особенностям восприятия. Дело в том, что теплые цвета кажутся немного ближе, а холодные — отдаленными. За счет их сочетания создается эффект дополнительной глубины — мы получаем красиво градуированную цветовую композицию, визуальный объем и исключительный блеск.
Палитра подбирается индивидуально, исходя из цветотипа человека. Мастерство колориста заключается в способности найти правильные цветовые соотношения для достижения объема, да еще и так, чтобы новый дизайн гармонировал с образом в целом!
Особенность данного 3D окрашивания в том, что цветовые переходы получаются максимально мягкими, естественными, созданными как будто самой природой, а не нарочито контрастными, как например, при мелировании.

Кроме того, 3D дизайн прекрасно камуфлирует седину отрастающих корней, за счет сложной игры цветных прядей. Ваши визиты в салон станут реже!

– Можно ли радикально поменять цвет волос, используя технику 3D окрашивания?

– Да, конечно! Можно даже осветлить волосы и сделать на этой базе 3D — абсолютное преображение гарантировано! В любом случае, профессионально выполненное 3D окрашивание волос, даст вам то, чего так не хватает при обычном — богатый оттенками натуральный цвет, визуальный объем, живой и насыщенный блеск.  No images found.

– Такое окрашивания занимает больше времени?

– Да, потому что техника нанесения довольно сложная и трудоемкая.

– 3D окрашивание волос более стойкое?

– Все зависит от типа волос. Из более пористых — краситель вымывается быстрее, в плотных — держится дольше. Большое значение также имеет уход в промежутках между окрашиванием. Для поддержания цвета актуальны как специальные салонные процедуры, так и домашний уход с использованием косметики для окрашенных волос (шампуни, бальзамы, маски).

– 3D можно сделать на волосах любого цвета?

– Конечно, можно! Обязательным остается правило использования теплых и холодных оттенков при окрашивании! И особенно важно, чтобы новый цвет волос подходил человеку!

Стоимость 3D окрашивания в категории комфорт:
на короткие волосы с учетом материалов и укладки - 3000 р.
на средние волосы - 3500 р.
на длинные волосы - 4000 р.

3d окрашивание волос фото до и после можно посмотреть в разделе "Работы мастеров"

Окрашивание волос в однин цвет WELLA

Ядро-специфическое окрашивание с помощью рентгеновских лучей для трехмерной виртуальной гистологии

Использованные животные

Животные были размещены в Klinikum rechts der Isar, Технический университет Мюнхена в соответствии с инструкциями учреждения. Внутренний комитет по защите животных Центра доклинических исследований (ZPF) Klinikum rechts der Isar, Мюнхен, Германия одобрил посмертное извлечение органов (внутренний номер ссылки 4-005-09). Все процедуры соответствовали Руководству по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованному U.S. Национальные институты здравоохранения (публикация NIH № 85-23, пересмотренная в 1996 г.). Все лаборатории проверяются на соответствие принципам надлежащей лабораторной практики Организации экономического сотрудничества и развития (ОЭСР). Мы подготовили целую дольку печени мыши, используя последнюю версию процедуры окрашивания гематеином. Были проведены исследования образца мягких тканей для проверки структурной сохранности и оценки качества окрашивания, определения морфологических структур, сравнения с традиционными гистологическими методами и оценки дальнейшего гистологического окрашивания.Для остальных органов была проведена разработка протокола окрашивания и оптимизация параметров.

Скрининг образцов

Мы закупили все реагенты у Sigma-Aldrich, если не указано иное. Фиксацию и сохранение всех органов мыши проводили в условиях, описанных ниже. Развитие и оптимизацию окрашивания проводили с образцами кубовидных мягких тканей из печени мыши (длина края 2-3 мм), которые были вырезаны скальпелем (Aesculap).Все образцы хранились в контролируемых температурных условиях, помещая образцы в холодильник (4 ° C) или в условиях окружающей среды лаборатории. Инкубации проводили в держателях образцов с плоским дном, которые заменяли после каждого этапа, но не после этапов промывки или дегидратации. Было исследовано несколько параметров в отношении развития и оптимизации окрашивания: (i) тип фиксатора, (ii) концентрация фиксатора, (iii) концентрация окрашивающих агентов, (iv) время инкубации, (v) pH фиксатора или (vi) pH. красителей, чтобы назвать несколько.МикроКТ сканирование окрашенных образцов мягких тканей было выполнено на компьютерном томографе phoenix v | tome | x s 240 с типичными настройками: пиковое напряжение 50 кВ, 6,0 Вт и 1001 проекция, распределенная на 360 °. Время экспозиции 1 с на каждую проекцию с эффективным размером пикселя приблизительно 30 мкм использовалось для сбора данных КТ с низким разрешением. Реконструкция данных микроКТ была выполнена с помощью интегрированного программного обеспечения Phoenix datos x CT. Анализы были сосредоточены на таких параметрах, как (i) полнота окрашивания, (ii) внешний вид диффузионных колец, (iii) усиление контраста, (iv) появление артефактов CT в виде полос и (v) однородность окрашивания.

Приготовление рабочих растворов для окрашивания

Раствор для окрашивания (A)

Тригидрат ацетата свинца (II) (3,7896 г, 9,99 ммоль; Merck Millipore) растворяли в 15 мл дист. воду с получением водного раствора ацетата свинца (II) (c = 0,666 M). Раствор готовили свежим для каждого эксперимента и использовали максимум 4 недели после приготовления.

Окрашивающий раствор (B)

Гематоксилин (25 г, 82,7 ммоль) растворяли в 250 мл абсолютного этанола (10% (мас. / Об.), C = 0.333 М). Во время растворения реакционную колбу выдерживали на водяной бане и устанавливали температуру 56 ° C. Реакционную смесь перемешивали в течение одного месяца в лабораторных условиях, чтобы обеспечить окисление гематоксилина до гематеина. Созревший раствор гематеина хранили в темноте в течение одного года после приготовления в герметичном контейнере (Schott Bottle).

Протокол окрашивания гематеином

Орган мыши был удален хирургическим путем и немедленно помещен в 50-миллилитровую центрифужную пробирку Falcon (neoLab), которая была заполнена фиксирующим раствором, содержащим 9.5 мл 4% (об. / Об.) Раствора формальдегида (FA, полученного из 37% раствора без кислоты, стабилизированного 10% метанолом от Carl Roth; дальнейшее разбавление DPBS без кальция и магния) и 0,5 мл ледяной уксусной кислоты (AA , Альфа Эсар). Образец охлаждали на 24–72 часа, а затем промывали фосфатно-солевым буферным раствором в течение 1 часа (DPBS без кальция и магния). Орган мыши помещали в окрашивающий раствор (А). Образец мягких тканей окрашивали 3 мл окрашивающего раствора (А) в течение 72 часов (образец мягких тканей свободно перемещался в контейнере для образца).Во время инкубации образец мягких тканей хранился в темноте на горизонтальной встряхиваемой пластине, обеспечивающей плавное качание со скоростью 60 об / мин. После первого этапа окрашивания образец мягких тканей был осторожно удален и помещен на короткий период времени в пробирку Эппендорфа над паровой фазой этанола, чтобы образец мягких тканей оставался влажным (пробирка Эппендорфа содержала несколько капель 70% (v / v) этанол на дне пробирки). Тем временем 3 мл рабочего раствора (B) добавляли в тот же контейнер для образца, содержащий рабочий раствор (A), с последующим тщательным перемешиванием реакционной смеси.Наблюдалось немедленное изменение цвета до темно-пурпурного при добавлении окрашивающего раствора (B). Образец мягких тканей помещали обратно в контейнер для образца и инкубировали еще 72 часа. Во время инкубации образец мягких тканей хранился в темноте на горизонтальной встряхиваемой пластине, обеспечивающей плавное качание со скоростью 60 об / мин. После окрашивания образец мягкой ткани осторожно извлекали из контейнера для образца и доступ окрашивающего агента мягко промокали тканевой салфеткой из целлюлозы. Образец мягких тканей промывали 6 мл воды (промывочный раствор меняли каждый час в течение первых 5 часов) и оставляли на ночь в промывочном растворе.Во время инкубации образец мягких тканей хранился в темноте на горизонтальной встряхиваемой пластине, обеспечивающей плавное качание со скоростью 60 об / мин. Образец мягких тканей хранили в пробирке Эппендорфа над паровой фазой этанола (пробирка Эппендорфа содержала несколько капель 70% (об. / Об.) Этанола на дне пробирки).

X-ray microCT Imaging

Окрашенную дольку печени мыши переносили в держатель образца, который позволяет закрепить в органе мыши более 70% (об. / Об.) Паров этанола.Рентгеновские измерения microCT были выполнены с помощью ZEISS Xradia Versa 500. Все показанные изображения были получены при ускоряющем напряжении 50 кВ, 3,5 Вт и 1601 проекции, равномерно распределенной по 360 °. Данные КТ с низким разрешением были получены с объективом 0,39x и временем экспозиции 2 с на каждую проекцию с эффективным размером пикселя 13,5 мкм.

Подготовка образца для nanoCT

Окрашенная долька печени мыши была обезвожена и подвергнута критической точечной сушке (CPD) перед визуализацией наноКТ.Перед первым шагом пятая часть окрашенной доли печени мыши была отрезана и подвергнута дальнейшему секционированию для анализа изображений наноКТ. Кусочки ткани имели размер приблизительно 0,5 мм по длине края. Инкубации с дегидратацией проводили по 1 ч каждая. Перед первым этапом дегидратации маленькие кусочки переносили в новую чашку Петри, где они оставались для всех последующих этапов. Используемые концентрации (все об. / Об.) Для серии дегидратации были в%: 50, 60, 70, 80, 90, 96 и 100 этанола, уравновешенные дист.вода. Кусочки обезвоженной ткани мыши затем подвергали CPD с использованием Bal-TEC CPD 030 с CO 2 в качестве осушающего агента. Кусочки ткани мыши CPD хранили в чашке Петри в эксикаторе перед дальнейшим использованием.

Рентгеновское изображение nanoCT и анализ данных

Рентгеновские измерения nanoCT были выполнены с помощью системы nanoCT собственной разработки, которая включает нанофокусный источник рентгеновского излучения (прототип NanoTube, Excillum, Швеция) 23 , вращение столик с держателем образца и детектором счета однофотонов (PILATUS 300K-W 20 Hz, Dectris, Switzerland) 24,25 .Система не включает в себя рентгеновскую оптику и может эффективно генерировать 3D-данные с разрешением до 100 нм 10 . Поскольку поле зрения для одного КТ-сканирования ограничено примерно 1400 вокселов в горизонтальном направлении и 190 вокселов в вертикальном направлении, изображение участка печени было получено путем выполнения трех отдельных КТ-измерений в разных вертикальных положениях и последующего объединения их в одно изображение. объем. Каждое измерение CT было получено при ускоряющем напряжении 60 кВ с 1599 выступами, равномерно распределенными по 360 °, и размером вокселя приблизительно 580 нм.Время экспозиции на изображение составляло 1 с, а общее время сбора данных на набор данных составляло ~ 1,5 часа. Объемные данные были реконструированы с помощью современного алгоритма фильтрованной обратной проекции, и репрезентативный VOI был выбран для дальнейшего анализа.

Сегментация и предварительная классификация ядер клеток выполнялись с помощью интерактивного инструментария обучения и сегментации ilastik 1.2.2 31 . Небольшое количество репрезентативных примеров для трех выбранных классов объектов, то есть ядра гепатоцитов, ядра меньших клеток и фон, были вручную выбраны в нескольких срезах объемного набора данных, а классификаторы были обучены с использованием различных функций. типы объектов, а именно интенсивность, края и текстуры ядер.Впоследствии все пиксели набора данных были автоматически классифицированы в один из трех классов. Для дальнейшего улучшения результатов классификации использовалась Avizo Fire 8.1 (FEI Visualization Sciences Group, Берлингтон, Массачусетс, США) для выполнения трехмерной морфологической классификации по размеру и форме сегментированных ядер. Наконец, объемные изображения на рис. 3, 4 и Movie 1 были созданы с помощью Avizo Fire 8.1.

Гистологический анализ

После КТ-анализа дольку печени мыши обезвоживали и заливали парафином в соответствии со стандартными процедурами.Вкратце, образец мягких тканей постепенно дегидратировали восходящим градиентом этанола (50%, 60%, 70% и 96%) дважды в течение 1 часа, дважды очищали ксилолом в течение 1 часа и затем заливали парафином. Срезы толщиной 3 мкм и 7 мкм вырезали с помощью микротома (Leica). Срезы регидратировали и либо непосредственно заливали (Eukitt, Merck), либо контрастировали в течение 5 минут раствором эозина Y (Morphisto) в соответствии с протоколом производителя. Гистологический анализ выполняли с использованием микроскопа Axio Imager 2 и программного обеспечения AxioVision (Zeiss).

флуоресцентных реагентов для окрашивания трехмерных культур клеток, созданных с помощью матрицы Cell-Mate3D | Thermo Fisher Scientific

Биология рака в третьем измерении

(См. Список продуктов, представленных в этой статье.)

В отличие от своих двумерных аналогов культур тканей, опухоли и связанные с ними микросреды содержат очень сложный и динамичный набор взаимодействий между различными типами клеток [1], множественные химические градиенты [2] и множество компонентов внеклеточного матрикса [3,4].Помимо происходящих биохимических реакций, физические характеристики опухоли, включая жесткость или жесткость внеклеточного матрикса, могут регулировать ее физиологию [5–7]. Следующие открытия в области биологии и лечения рака потребуют инструментов, которые помогут создать более актуальные и прогностические модели, а также методы их эффективного анализа.

Комбинация методов трехмерного культивирования клеток с методами анализа здоровья клеток обещает предоставить новое понимание механизмов рака и новые стратегии для прерывания или подрыва критических путей.Здесь мы описываем применение основанных на флуоресценции анализов и протоколов в сложной трехмерной среде, часто с незначительными корректировками времени воздействия или концентрации реагента. Флуоресцентные реагенты от Thermo Fisher Scientific можно использовать для оценки функции клеток, включая жизнеспособность, пролиферацию и апоптоз, в ответ на различные условия 3D-культивирования и лечения.

Создание трехмерных культур с помощью матрицы Cell-Mate3D

Матрица

Cell-Mate3D ™ от BRTI Life Sciences представляет собой тканеподобную матрицу, которая предлагает исследователям биологически релевантную и химически определенную микросреду для биомедицинских исследований in vitro и in vivo.Матрица Cell-Mate3D состоит из двух природных биополимеров: хитозана, положительно заряженного полисахарида, полученного из хитина, обнаруженного в экзоскелете ракообразных; и гиалуроновая кислота, линейный полисахарид, обнаруженный во внеклеточном матриксе соединительной, эпителиальной и нервной тканей. Гиалуроновая кислота обычно участвует в пролиферации, миграции, эмбриональном развитии и заживлении ран.

Когда Cell-Mate3D Dry Blend объединяется с клетками, ресуспендированными в Cell-Mate3D Hydration Fluid, матрица образуется мгновенно за счет электростатических взаимодействий между карбоксильными группами гиалуроновой кислоты и аминогруппами хитозана.Полученный полиэлектролитический комплекс представляет собой волокнистую матрицу, которая проявляет жесткость, подобную тканям, имитируя естественную клеточную среду. Матрица Cell-Mate3D позволяет моделировать миграцию и пролиферацию клеток; С этой технологией можно использовать такие лабораторные методы, как окрашивание клеток и визуализация, проточная цитометрия и сканирующая электронная микроскопия [8].

Определение жизнеспособности клеток в 3D-культурах

Набор Invitrogen LIVE / DEAD Viability / Cytotoxicity Kit обеспечивает хорошо зарекомендовавший себя флуоресцентный анализ для определения жизнеспособности в широком диапазоне клеток животных.Анализ жизнеспособности LIVE / DEAD включает два флуоресцентных зонда - кальцеин AM, проницаемый для клеток субстрат эстеразы, и гомодимер этидия-1, не проницаемый для клеток высокоаффинный краситель нуклеиновой кислоты, которые используются одновременно для окрашивания клеток. Мы использовали анализ жизнеспособности LIVE / DEAD с трехмерными клеточными культурами, которые были созданы путем встраивания клеток рака молочной железы AU565 в матрицу Cell-Mate3D. После инкубации матрицы со встроенными клетками в течение 4 дней один образец не обрабатывали, а эквивалентный образец обрабатывали 0.5% моющее средство Triton X-100, которое разрушает клеточные мембраны и убивает клетки. Затем оба образца были проанализированы с использованием набора LIVE / DEAD Viability / Cytotoxicity Kit и прилагаемого протокола, за исключением того, что время инкубации было сокращено с 30 до 20 минут для оптимизации уровней окрашивания в этой системе. После контрастного окрашивания синим флуоресцентным красителем нуклеиновой кислоты образцы были отображены на инвертированном конфокальном микроскопе (, рис. 1, ). Необработанный образец показывает живые клетки, помеченные зеленой флуоресценцией, тогда как обработанный образец показывает мертвые клетки, помеченные красной флуоресценцией.

Рисунок 1.Обнаружение жизнеспособных клеток в матрице Cell-Mate3D с использованием анализа жизнеспособности LIVE / DEAD. Клетки рака молочной железы AU565, растущие в матрице Cell-Mate3D, окрашивали с использованием набора Invitrogen LIVE / DEAD Viability / Cytotoxicity Kit и контрастировали с использованием реагента Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes. (A) В необработанном образце живые клетки флуоресцируют зеленым цветом, а ядра - синим; обнаруживается очень мало нежизнеспособных (красных флуоресцентных) клеток. (B) После обработки 0,5% детергентом Triton X-100 образец содержит в основном нежизнеспособные (флуоресцентные красные) клетки; фиолетовый цвет клеток на изображении представляет собой перекрытие красных и синих флуоресцентных пятен.Образцы получали с помощью инвертированного конфокального микроскопа при 20-кратном увеличении.

Обнаружение пролиферации клеток в 3D-культурах

Помимо своей важной роли в развитии, пролиферация клеток является важным маркером раковых клеток и может служить мишенью для противораковой терапии.Наборы для визуализации Invitrogen Click-iT EdU обеспечивают простой и эффективный анализ пролиферации, который определяет синтез ДНК с помощью флуоресцентной микроскопии. В тесте Click-iT EdU модифицированный аналог тимидина (5-этинил-2´-дезоксиуридин или EdU) вводится в клетки, включается во вновь синтезированную ДНК, а затем метится ярко флуоресцентным красителем Invitrogen Alexa Fluor быстро , высокоспецифичная реакция на нажатие. Мы использовали Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit (без изменений прилагаемого протокола) с трехмерными клеточными культурами, которые были созданы путем встраивания клеток HeLa в матрицу Cell-Mate3D, и обнаружили, что пролиферирующие клетки (которые флуоресцируют зеленым цветом) легко визуализированы в 4-дневных культурах ( Рисунок 2 ).

Рисунок 2.Обнаружение пролиферирующих клеток в матрице Cell-Mate3D с помощью окрашивания Click-iT EdU. Клетки HeLa были встроены в матрицу Cell-Mate3D и культивированы в течение 4 дней. Пролиферирующие клетки детектировали с помощью набора Invitrogen Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit (зеленый). Клетки контрастировали с помощью реагента Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes (синий) и визуализировали с помощью инвертированного конфокального микроскопа при 60-кратном увеличении.

Обнаружение апоптоза в 3D-культурах

Реагент для обнаружения зеленого каспазы-3/7 Invitrogen CellEvent позволяет быстро и надежно определять количество апоптозных клеток в культуре.Этот нефлуоресцентный субстрат состоит из 4-аминокислотного пептида DEVD, который содержит сайт узнавания каспазы-3/7, конъюгированный со связывающим нуклеиновую кислоту красителем. В присутствии активированной каспазы-3 или -7 субстрат расщепляется, освобождая краситель для связывания с ДНК и производя ярко-зеленый флуоресцентный сигнал, указывающий на апоптоз. Чтобы протестировать этот реагент с 3D-культурами клеток, мы встроили клетки рака молочной железы AU565 в матрицу CellMate-3D и культивировали клетки в течение 12 дней. В течение этого времени один образец не обрабатывали, а эквивалентный образец обрабатывали 100 мкМ паклитакселом (родовое название фармацевтического таксола) для индукции апоптоза.Затем образцы окрашивали 15 мкМ реагентом CellEvent Caspase-3/7 (в 3 раза превышающей рекомендуемую концентрацию). Зеленые флуоресцентные апоптотические клетки были ясно видны в образце, обработанном паклитакселом, с помощью конфокальной микроскопии (, фиг. 3, ).

Рисунок 3.Обнаружение апоптотических клеток в матрице Cell-Mate3D с использованием реагента CellEvent Caspase-3/7 Green. Клетки рака молочной железы AU565 были встроены в матрицу Cell-Mate3D и культивированы в течение 12 дней. В течение этого времени клетки (A), , оставались необработанными, или (B), обрабатывали 100 мкМ паклитакселом для индукции апоптоза. Затем клетки инкубировали с реагентом для обнаружения зеленого цвета Invitrogen CellEvent Caspase-3/7 (15 мкМ) в течение 30 минут для маркировки апоптотических клеток зеленой флуоресценцией, контрастировали с реагентом Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes (синий) и отображали с помощью инвертированного конфокального микроскопа. при 20-кратном увеличении.

Применяйте протоколы флуоресценции к своим 3D-экспериментам

Хотя при применении флуоресцентных зондов к трехмерным клеточным культурам, растущим в матрице Cell-Mate3D, требовалась некоторая оптимизация, мы обнаружили, что в целом реагенты могли проникать в сложную среду и точно отображать параметры здоровья клеток и активность ферментов.Анализ функции клеток в трехмерных культурах клеток значительно выиграет от множества доступных флуоресцентных датчиков функции клеток.

Благодарности: Эта статья была предоставлена ​​Бет Линдборг, Кейтлин Джонсон, Йи Вен Чай, Эу Хан Ли и Скоттом Брашем, BRTI Life Sciences, Две гавани, Миннесота (brtilifesciences.com). Изображения были получены в Центре визуализации Университета Миннесоты (UMN-UIC); мы очень признательны члену UMN-UIC Гранту Бартелу за помощь в конфокальной микроскопии.

Список литературы

  1. Бейкер Б.М., Чен С.С. (2012) J Cell Sci 125: 3015–3024.
  2. Hoffman BD, Grashoff C, Schwartz MA (2011) Nature 475: 316–323.
  3. Kimlin LC, Casagrande G, Virador VM (2013) Mol Carcinog 52: 167–182.
  4. Soldatow VY, Lecluyse EL, Griffith LG et al. (2013) Toxicol Res (Camb) 2: 23–39.
  5. Zschenker O, Streichert T, Hehlgans S et al. (2012) PLoS One 7: e34279.
  6. Смолли К.С., Лиони М., Херлин М. (2006) In vitro Cell Dev Biol Anim 42: 242–247.
  7. Шварц М.А., Чен С.С. (2013) Science 339: 402–404.
  8. Чай YW, Ли EH, Gubbe JD et al. (2016) PLoS One 11: e0162853.

L3224, C10723, C10423, C10377, R37605, R37606

Загрузите версию этой статьи для печати.
Загрузить сейчас

Мозг мыши с беспрецедентной детализацией в 3D благодаря новой технике окрашивания | Наука

Ученые визуализировали мозг мыши с помощью нового метода окрашивания, который может отображать до четырех молекулярных мишеней одновременно (три мишени показаны выше).

RIKEN / Creative Commons

Деннис Нормайл

Ученые, изучающие мозг, другие органы и раковые опухоли, долгое время пытались получить подробные трехмерные изображения их внутренностей - вплоть до уровня кровеносных сосудов и типов клеток. Но создание таких изображений трудоемко и сложно. На этой неделе исследователи сообщают, что кардинальные усовершенствования техники трехмерной визуализации могут выявить внутренние компоненты целых органов или даже животных с помощью простой процедуры.Новый протокол окрашивания тканей позволяет проводить анализ на клеточном уровне с беспрецедентной детализацией; он может помочь в исследованиях в области нейробиологии, эволюционной биологии и иммунологии, а также может оказаться полезным при диагностике некоторых видов рака и изучении поврежденной ткани мозга после смерти.

Для визуализации биологических образцов в 3D у исследователей в основном есть два основных варианта: они могут разрезать ткани на тонкие срезы и использовать компьютерное программное обеспечение для реконструкции всего образца, или они могут сделать биологическую ткань прозрачной с помощью специальных химикатов, что позволяет исследователям просматривать ее внутреннюю часть с помощью оптический микроскоп.Чтобы различать разные типы клеток, исследователи обычно окрашивают ткани, замачивая их в смеси красителей и химикатов. Но получить окрашивающие красители для проникновения в органы и большие образцы оказалось непросто.

Чтобы решить эту проблему, исследователи из Центра исследований динамики биосистем RIKEN определили гель, который точно имитирует физико-химические свойства органов, подвергшихся процессу очистки тканей. Начиная с компьютерного моделирования и следуя лабораторным испытаниям, команда оптимизировала температуру раствора для замачивания, концентрации красителей и антител, химические добавки и электрические свойства для получения наилучших результатов окрашивания и визуализации.Затем они протестировали свой метод с более чем двумя дюжинами широко используемых красителей и антител на мозге мышей и мартышек.

Сканирование всего мозга мыши и одного полушария мозга мартышки - преобразованное в трехмерное изображение с помощью световой микроскопии - выявило сходство между нервно-сосудистыми системами двух животных, демонстрируя использование системы для сравнительной анатомии, сообщают исследователи на этой неделе в Nature Communications . Они также показали, что могут одновременно окрашивать и отображать до четырех молекулярных мишеней в мозгу мыши, о чем «никогда раньше не сообщалось», - говорит Людовико Сильвестри из Европейской лаборатории нелинейной спектроскопии, который не принимал участия в исследовании. исследование.

Команда также использовала свою технику для изображения всей молодой мартышки и небольшого образца человеческого мозга - то, что однажды может привести к новому пониманию солидных опухолей и нейродегенеративных заболеваний. Команда говорит, что ее подход к оптимизации окрашивания может быть применен к другим методам для продвижения всей области трехмерной визуализации.

Новая техника окрашивания позволяет визуализировать целые органы и тела

Исследовательская группа RIKEN разработала оптимизированный метод трехмерного (3D) окрашивания тканей и наблюдения, основанный на существующей технологии очистки тканей.В исследовании, опубликованном в Nature Communications, подробно описывается, как новый метод можно использовать для окрашивания тканей и маркировки клеток в мозге мышей, человеческом мозге и целых телах мартышек. Этот метод позволит провести подробный анатомический анализ и сравнение целого органа между видами на клеточном уровне.

Очистка тканей позволяет проводить трехмерное наблюдение органов с помощью оптического микроскопа. В 2014 году исследовательская группа под руководством Эцуо Сусаки и Хироки Уэда из Центра исследований динамики биосистем (BDR) RIKEN в Японии разработала технологию трехмерной очистки тканей под названием CUBIC, которая может отображать все тело на уровне отдельных клеток, создавая ткани. прозрачный.

Хотя очистка тканей может давать фантастические изображения, сама по себе она не имеет большого научного значения. Чтобы очистка тканей была значимой, ученые должны иметь возможность окрашивать и маркировать определенные ткани и типы клеток, которые затем могут быть изучены. Для этого требуется система, которая работает с широким спектром окрашивающих агентов и антител. Хотя было предпринято несколько попыток использования методов трехмерного окрашивания и мечения, ни один из них не оказался достаточно универсальным.

Понимая, что им необходимо лучше понимать ткани тела, команда BDR и их коллеги выполнили подробный физический и химический анализ.Они обнаружили, что биологические ткани можно определить как тип электролитного геля.

Основываясь на обнаруженных ими тканевых свойствах, они создали систему скрининга для изучения ряда условий с использованием искусственных гелей, которые могут имитировать биологические ткани. Проанализировав окрашивание и маркировку искусственных гелей с помощью CUBIC, они смогли разработать точно настроенный универсальный метод 3D-окрашивания / визуализации, который они назвали CUBIC-HistoVIsion. Используя эту оптимизированную систему с высокоскоростной трехмерной микроскопией, они преуспели в окрашивании и визуализации всего мозга мыши, половины мозга мартышки и квадратного сантиметра ткани человеческого мозга.Трехмерное изображение всего тела молодой мартышки также было успешным. Система хорошо работает примерно с 30 различными антителами и ядерными окрашивающими агентами, что делает ее полезной для ученых в самых разных областях, от изучения мозга до изучения функции почек.

Система может использоваться для многих целей, одна из которых заключается в сравнении анатомических особенностей всего органа у разных видов. CUBIC-HistoVIsion показал, что общие паттерны распределения кровеносных сосудов в мозге мышей и мартышек очень похожи и, таким образом, вероятно, эволюционно сохраняются.В то же время они обнаружили, что распределение глиальных клеток в мозжечке различается у людей, мышей и мартышек. Авторы предполагают, что эти различия в формировании паттерна глии могут привести к хорошо известным структурным различиям мозжечка у разных видов.

«Метод 3D-окрашивания, разработанный в нашем исследовании, превосходит характеристики типичных методов окрашивания, опубликованных до сих пор, и в настоящее время является лучшим методом в мире», - говорит Сусаки. «Это также обеспечивает смену парадигмы в разработке методов химии тканей, таких как построение протоколов окрашивания на основе свойств ткани.Ожидается, что эти результаты будут способствовать пониманию биологических систем на уровне органов и организмов, а также повышению диагностической точности и объективности трехмерного исследования клинической патологии ».

Ссылка

Susaki et al. (2020) Универсальное окрашивание всего органа / тела и визуализация на основе электролитно-гелевых свойств биологических тканей. Nat Comm. DOI: 10.1038 / s41467-020-15906-5

Контакт

Хироки Р. Уэда, руководитель группы
Эцуо А.Сусаки, приглашенный научный сотрудник
Лаборатория синтетической биологии
Центр исследований динамики биосистем RIKEN

Masataka Sasabe
RIKEN Отдел международных отношений
Тел: + 81- (0) 48-462-1225 / Факс: + 81- (0) 48-463-3687
Электронная почта: pr [at] riken.jp

Примеры красителей CUBIC Histo-VIsion для визуализации нейронов и кровеносных сосудов в головном мозге мышей.

Трехмерная виртуальная гистология, доступная с помощью специфичного для цитоплазмы рентгеновского окрашивания для микроскопической и наноскопической компьютерной томографии

Значимость

Доказано, что трехмерная гистология образцов мягких тканей обеспечивает важные преимущества для понимания структуры ткани.Тем не менее, низкое затухание мягких тканей затрудняет использование компьютерной томографии (КТ) в качестве инструмента неразрушающей и трехмерной визуализации внешних и внутренних структурных деталей. Мы представляем метод окрашивания цитоплазмы, адаптированный для рентгеновской компьютерной томографии, который позволяет выполнять рутинный и эффективный трехмерный объемный скрининг с высоким разрешением. Наша методика полностью совместима с традиционной гистологией и позволяет проводить дальнейшие гистологические исследования, как показано на почке мыши. Сравнительный анализ наших данных КТ с традиционной 2D-гистологией подчеркивает будущую применимость метода окрашивания цитоплазмы рентгеновскими лучами для современных гистологических и гистопатологических исследований с использованием лабораторных рентгеновских КТ-устройств.

Abstract

Многие гистологические методы требуют окрашивания цитоплазмы, что позволяет получить инструментальные данные для диагностики. Одним из основных ограничений является получение 2D-изображений, полученных путем деструктивной подготовки 3D-образцов ткани. Рентгеновская абсорбционная микро- и нанокомпьютерная томография (микроКТ и наноКТ) позволяет проводить неразрушающее исследование трехмерного образца ткани и, таким образом, помогает определить интересующие области для дальнейших гистологических исследований. Однако применение микроКТ и наноКТ к биологическим образцам (например,g., биопсия) ограничивается отсутствием контраста в мягких тканях, что важно для визуализации морфологических деталей. Мы описываем препарат на основе эозина, который преодолевает проблемы повышения контрастности и селективности для определенных тканей. Протокол окрашивания на основе эозина подходит для окрашивания всего органа, что затем позволяет получать микроконтактную томографию с высоким разрешением целых органов и наноКТ-визуализацию более мелких кусочков ткани, извлеченных из исходного образца. Наши результаты демонстрируют пригодность метода окрашивания на основе эозина для диагностического скрининга трехмерных образцов ткани, не препятствуя дальнейшей диагностике с помощью гистологических методов.

В настоящее время гистология является важным методом, когда биологическая ткань изучается в микроскопическом масштабе, чтобы предоставить инструментальную и важную информацию для медицинской диагностики и исследований (1, 2). Однако обычная гистология очень часто включает в себя трудоемкие, сложные и, кроме того, деструктивные протоколы подготовки образцов. Отдельные 2D-срезы одного изучаемого объекта наблюдаются под микроскопом, изображения оцифровываются, оцениваются и сохраняются. Эта процедура позволяет собрать объемный набор данных.Существуют различные методы трехмерной визуализации на основе гистологических срезов, и, несмотря на разработки, сделанные в отношении полуавтоматической и автоматической перестройки срезов, методы трехмерной реконструкции на основе гистологических срезов имеют ограничения и требуют специалистов (3⇓⇓ − 6).

С другой стороны, рентгеновская компьютерная томография (КТ) стала бесценным инструментом неразрушающего исследования объектов во многих областях, таких как материаловедение, промышленные испытания или медицинская диагностика (7).В связи с потребностью в более высоком разрешении в лабораторной рентгеновской компьютерной томографии в субмикронном диапазоне были созданы области микрокомпьютерной томографии (микроКТ) (8-10) и нанокомпьютерной томографии (наноКТ) (11) (в рамках этой работы микроКТ относится к размерам вокселей> 1 мкм, а наноКТ - к размерам вокселей от> 100 нм до <1 мкм). Чтобы стать почти сопоставимым с традиционной гистологией в отношении результирующего контраста, для визуализации наноКТ используется рентгеновская оптика (12) или рентгеновские трансмиссионные трубки с очень маленькими размерами фокусного пятна (13, 14).Однако применение микроКТ и наноКТ для скрининга биологических образцов остается ограниченным из-за очень низкого внутреннего контраста мягких тканей. Использование контрастных веществ необходимо для визуализации микроскопических структур (15⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓ − 23). В настоящее время наиболее широко используемый метод окрашивания основан на методе окрашивания неорганическим йодом IKI (йод-калий йодид). Здесь трийодид и йодид-анион допускают ионное взаимодействие с (поли-) катионными структурами в неминерализованных тканях.Это делает IKI оптимальным обзорным пятном, способным проникать через целые организмы, например, эмбрионы животных. Однако доступные в настоящее время методы окрашивания часто трудоемки, сложны, токсичны и препятствуют дальнейшему исследованию образца другими методами, такими как гистология. Метод окрашивания на основе эозина в сочетании с недавно разработанным лабораторным устройством рентгеновской наноКТ (24), представленным здесь, устраняет эти недостатки, предлагая значительно улучшенный контраст окрашенных мягких тканей в рамках гораздо более быстрой процедуры окрашивания с разрешением в диапазоне от от нескольких микрометров до 200 нм.Кроме того, представленный метод по-прежнему обеспечивает совместимость с традиционными гистологическими исследованиями, то есть возможность контрастного окрашивания гистологом. В целом, эта работа демонстрирует мощный потенциал трехмерной гистологии как инструмента для современных гистологических и гистопатологических приложений.

Результаты

В гистологии окрашивание цитоплазмы клеток имеет большое значение, поскольку оно дает представление о форме, размере и изменениях клеток, что дает четкие показания для диагностики или дальнейших диагностических исследований.Текущий гистологический стандарт, используемый в качестве плазмы или контрастного красителя, - это эозин. Его наносят в виде 0,1% (вес / объем) водного раствора на двумерные микроскопические срезы мягких тканей (как правило, толщиной 2-10 мкм) (25). В настоящее время такой тканеспецифический и гистологически совместимый окрашивающий агент или протокол окрашивания недоступен для рентгеновской компьютерной томографии. Однако применение описанной стандартизированной процедуры гистологического окрашивания к трехмерным образцам ткани, например, целому органу почки мыши, привело к аналогичному качеству изображения по сравнению с неокрашенным образцом ткани (рис.S1). Одна и та же почка мыши использовалась для рентгеновской компьютерной томографии до и после окрашивания с использованием тех же параметров изображения. Повышения контраста достичь не удалось. Результат для неокрашенной почки мыши был ожидаемым, подчеркивая низкие внутренние свойства ослабления мягких тканей для обычно используемых энергий рентгеновского излучения лабораторных систем микроКТ, которые в основном состоят из углерода, водорода, кислорода и азота (26). Что касается окрашенной почки мыши, низкая концентрация эозина, используемого для окрашивания, рассматривалась как ограничивающий фактор.Здесь не были соблюдены уровни чувствительности для рентгеновской компьютерной томографии в отношении элемента с высоким атомным номером брома ( Z = 35) (26), из которых одна молекула эозина содержит четыре атома бромида, ковалентно связанных с ядром флуоресцеина.

Для улучшения контрастности мягких тканей были протестированы несколько концентраций эозина (с максимальной растворимостью эозина в воде в качестве конечной точки). Как и ожидалось, лучшее усиление контраста в мягких тканях наблюдалось при наивысшей концентрации эозина.Таким образом, протокол окончательного окрашивания проводился с максимальной концентрацией. Были внесены дальнейшие улучшения для достижения окончательного протокола окрашивания, который состоит всего из трех этапов (рис. 1 A ). Здесь решающее значение имеет подкисление образца мягких тканей во время фиксации или перед окрашиванием. Это также показали Hong et al. (27). Мягкие ткани оптимально подготовлены на молекулярном уровне для процедуры окрашивания динатриевой солью эозина. Аминокислотные боковые цепи белков и пептидов, присутствующих в цитоплазме клетки, протонируются кислотой, что позволяет улучшить ионное взаимодействие с нанесенным красителем, что приводит к большему накоплению окрашивающего агента в цитоплазме клетки (рис.1 В ).

Рис. 1.

Протокол и химический состав предложенного протокола окрашивания на основе эозина для рентгеновской микроКТ. ( A ) Протокол окрашивания на основе эозина показывает отдельные этапы. Благодаря своей эффективности он особенно подходит для больших образцов (например, целых органов). ( B ) Краситель нековалентно взаимодействует с мягкими тканями на молекулярном уровне (выделено синими кружками). Показан отрицательно заряженный эозин с катионными аминокислотными боковыми цепями белков / пептидов цитоплазмы.Оптимизированное ионное взаимодействие достигается за счет подкисления мягких тканей во время фиксации или перед окрашиванием и способствует большему накоплению эозина в цитоплазме клеток. Молекула динатриевой соли эозина содержит четыре атома брома (выделены оранжевыми кружками). Компонент с высоким атомным номером ( Z = 35) создает особенно высокий контраст для рентгеновских лучей.

Перед нанесением окрашивания с использованием протокола окончательного окрашивания на основе эозина почка мыши была визуализирована с помощью микроКТ.Как и ожидалось, анатомическая структурная информация не была видна (Рис. 2 A ; объяснение см. Выше). Та же самая почка мыши была подвергнута протоколу окрашивания на основе эозина и снова визуализирована с помощью микроКТ. Фактическая стадия окрашивания довольно быстрая, что приводит к полному окрашиванию всего органа, такого как почка мыши, в течение 24 часов. Обзорная микроскопия КТ позволила четко различить анатомические структурные области почки мыши, такие как кора, внутренний и внешний мозг, сосочек и почечная лоханка (рис.2 В ). Кроме того, окрашивание было однородным в пределах одной анатомической структурной области. Замечательное усиление контраста по сравнению с неокрашенной почкой мыши далее видно на гистограммах изображений микроКТ (рис. 2 C и D ). Гистограммы отображают существующие материалы воздуха, держателя образца и мягких тканей, которые представлены пиками слева направо со значениями серого, увеличивающимися пропорционально эффективному ослаблению материала.Ожидается, что одни и те же материалы приведут к одинаковому распределению значений серого, которое видно на гистограммах для воздуха материалов и держателя образца. Сигнал, соответствующий мягкой ткани, смещается к более высокому значению серого, а ширина пика расширяется для окрашенного образца мягкой ткани (рис. 2 C и D ). Это демонстрирует влияние окрашивающего агента на свойства ослабления мягких тканей, что приводит к визуализации различных анатомических структурных областей почки мыши.

Рис. 2.

CT-срезов и гистограммы распределения одной и той же цельной почки мыши до и после окрашивания, подчеркивающие усиление контраста, полученное после применения протокола окрашивания на основе эозина. Оба набора данных были получены с помощью микроКТ Xradia Versa 500 с идентичными параметрами сбора данных. Размер вокселя в обоих наборах данных составляет 12 мкм. ( A ) Обзорное изображение неокрашенной почки мыши. ( B ) Обзорное изображение того же образца почки мыши, показанного в A , после окрашивания.Следующие анатомические структурные области могли быть идентифицированы и были обозначены: кора ( B , I ), внешний мозг ( B , II ) с дальнейшим различением внешних полос внешнего мозга ( B , IIa ) и внутренние полосы наружного мозга ( B , IIb ), внутреннего мозга ( B , III ), сосочка ( B , IV ) и почечной лоханки ( B , V ). ( C ) Гистограмма CT-среза, показанная в A , и ( D ) Гистограмма CT-среза, показанная в B .

Использование микроКТ-сканирования с высоким разрешением [область интереса (ROI), выделенная на рис. 3 A ] того же образца почки мыши без разрушения всего органа позволило получить еще более подробное изображение анатомических структур почка мыши (рис. 3 B ). Кроме того, для исследований методом наноКТ были выбраны области коры (рис. 3, B, , I, ) и внутренние полосы наружного продолговатого мозга (рис. 3, B, , IIb, ), в результате чего были рассечены анатомические области. и подвергали сушке до критической точки (CPD).Обе области содержат важные анатомические структуры, такие как почечное тельце (кора) и петля Генле (внутренние полосы наружного продолговатого мозга), соответственно, которые предлагают ценные параметры для диагностики (28). Изображения наноКТ области мозгового вещества (рис. 3, C , IIb и рис. 3, D , IIb ), представленные на рис. 3 C и D , показывают толстые восходящие конечности петля Генле. Срезы наноКТ имеют виртуальную толщину ~ 400 нм и уже очень хорошо сравниваются с гистологическими микроскопическими слайдами (рис.3 G - J ), полученный из того же образца почки мыши. Поскольку гистологические микроскопические слайды имеют толщину ∼7−10 мкм, были созданы проекционные срезы минимальной интенсивности данных наноКТ (рис. 3 E и F ), которые соответствуют толщине виртуального среза ∼7 мкм. для лучшего сравнения с гистологическими микроскопическими препаратами (рис. 3 G - J ). Проекционные срезы минимальной интенсивности данных наноКТ теперь ясно показывают ядра клеток как области без ослабления.Этот результат подтверждается гистологическими микроскопическими слайдами, показанными на фиг. 3 G и H , которые были получены непосредственно из окрашенного на основе эозина образца почки мыши без дальнейших процедур окрашивания. Полученный контраст очень хорошо подходил для определения анатомических структур у гистолога. Ядра клеток здесь выглядели белыми, будучи углубленными из эозина, который специфически окрашивает белки и пептиды цитоплазмы клетки (25).

Фиг.3.

CT-срезов данных microCT ( A и B ) и nanoCT ( C - F ) в сравнении с гистологическими микроскопическими слайдами ( G - J ), полученными из той же почки мыши. после применения разработанного протокола окрашивания на основе эозина. Они демонстрируют, в частности, совместимость с обычными гистологическими методами, то есть возможность контрастного окрашивания гематоксилином. ( A ) Обзор изображения microCT с выделением области интереса (синее поле) для изображения с высоким разрешением, видимого в B .( B ) МикроКТ-изображение с высоким разрешением, показывающее следующие анатомические структурные области: кора ( B , I ), наружный мозг ( B , II ) с дальнейшим различением внешних полосок внешнего мозга ( B , IIa ) и внутренние полосы наружного мозга ( B , IIb ), внутреннего мозга ( B , III ), малой чашечки ( B , IV ) и сосудов ( B , V и B , VI ).( C и D ) На изображениях наноКТ того же образца почки мыши, которые были получены после окрашивания, препарирования и CPD, показаны подробные структуры области ( B , IIb ), наблюдаемой в B . Они известны как толстые восходящие ветви петли Генле. ( E и F ) Срезы проекции минимальной интенсивности одного и того же набора данных nanoCT, показанного в C и D . Срезы соответствуют толщине виртуального среза ~ 7 мкм, что позволяет четко визуализировать ядра клеток.( G и H ) Типичные гистологические микроскопические препараты с приблизительной толщиной 7 мкм, полученные из того же образца почки мыши после окрашивания на основе эозина и помещения в парафиновый блок. Показаны толстые восходящие ветви петли Генле с четкой визуализацией ядер клеток и ресничек (мерцательный эпителий). ( I и J ) Репрезентативные гистологические микроскопические слайды, полученные близко к слайдам, показанным в G и H , с приблизительной толщиной 7 мкм.Применяли контрастный краситель гематоксилин, выделяя ядра клеток фиолетовым цветом.

Чтобы обеспечить еще лучшее сравнение с гистологическими результатами и продемонстрировать совместимость разработанного протокола окрашивания на основе эозина со стандартными гистологическими методами, специфичное для ядер клеток окрашивание кислым гематоксилином Майера (далее именуемым гематоксилином) был нанесен на гистологические микроскопические препараты (рис. 3 I и J ). Как и ожидалось, ядра клеток имеют пурпурный цвет.Кроме того, окрашивание эозином не было нарушено, что привело к ожидаемому гистологическому микроскопическому препарату, обработанному стандартными процедурами окрашивания H&E.

Второй образец, область коры (I), был исследован (рис. S2) и данные наноКТ (рис. S2 A и B ) проанализированы в сравнении с репрезентативным гистологическим микроскопическим препаратом (рис. S2 C ). Значимые анатомические структуры, такие как почечное тельце, включая клубочки, капсулу Боумена и почечную кору с извитыми канальцами, можно было определить по изображениям наноКТ (рис.S2 A ). Проекционные изображения с минимальной интенсивностью (рис. S2 B ) снова позволили лучше сравнить данные наноКТ с репрезентативным гистологическим микроскопическим слайдом (рис. S2 C ). Было достигнуто очень хорошее соответствие между данными наноКТ и гистологическими данными, что еще раз подтвердило пригодность разработанного протокола окрашивания на основе эозина для дальнейших гистологических исследований (без дополнительных процедур гистолога), а также совместимость с гистологическим контрастным красителем гематоксилином.

Огромный потенциал технологии КТ заключается в трехмерной визуализации, которая была продемонстрирована на рис. 4. Отображаются данные микроКТ (рис. 4 A и B ) и наноКТ (рис. 4 C ). . Обзор всей почки мыши (рис. 4 A ) позволил идентифицировать область интереса (рис. 4 B ), которая была дополнительно исследована с помощью наноКТ, открыв очень подробный вид трехмерной структуры восходящих конечностей. петли Генле (рис.4 С ).

Рис. 4.

Объемные визуализации данных микроКТ и наноКТ одной и той же почки мыши после применения разработанного протокола окрашивания на основе эозина. ( A ) Виртуальный сагиттальный разрез всей почки мыши, полученный с размером вокселя 12 мкм. ( B ) Представляющие интерес области данные микроКТ, показывающие область мозгового вещества и виртуальный разрез сосуда. Была проведена локальная томография всей почки с размером вокселя 3,3 мкм. ( C ) Область интереса данные наноКТ, визуализирующие трехмерную структуру толстых восходящих конечностей петель Генле.Данные были получены с небольшого кусочка почки с размером вокселя ~ 400 нм.

Обсуждение

Образцы мягких тканей, приготовленные с использованием разработанного протокола на основе эозина, удовлетворяют всем требованиям для полного и гомогенного окрашивания, позволяющего повысить контрастность КТ всего органа мыши, такого как почка (рис. 2). Во всем образце мягких тканей морфология сохраняется достаточно хорошо, чтобы идентифицировать важные анатомические области и структуры, которые может назначить патолог.Более того, для получения изображений с помощью микроконтактной томографии подготовленные образцы мягких тканей подходят для дальнейших гистологических исследований, при этом гистологические микроскопические препараты получают из тех же окрашенных образцов мягких тканей (рис. 3). Метод окрашивания на основе эозина не препятствует дальнейшему гистологическому лечению патологами и позволяет патологу непосредственно оценивать ткань с помощью оптического микроскопа и контрастировать с окрашиванием H. Несмотря на то, что концентрация окрашивающего раствора намного выше по сравнению с гистологическим окрашивающим раствором, усиление контраста гистологических микроскопических препаратов очень хорошо подходит для гистологических исследований (рис.3 G и H ).

Окрашивающие свойства эозинового красителя остаются неизменными, что видно по визуализации ядер клеток в данных наноКТ как области без ослабления (рис. 3 C - F ) и подтверждено гистологией (рис. 3 ). G и H ). Здесь ядра клеток выглядят белыми, что отражает локализацию пятна эозина в цитоплазме клетки. Возможность контрастного окрашивания гистологических микроскопических препаратов патологом продемонстрирована путем нанесения гематоксилинового окрашивания, специфичного для ядер клеток, что привело к получению гистологического микроскопического препарата, окрашенного H & E (рис.3 I и J ), отображающие ожидаемую форму внешнего вида. Следует отметить, что стандартные гистологические препараты для микроскопии, приготовленные с помощью H & E, сначала окрашивают гематоксилином, а затем - эозином. Совместимость по-прежнему сохраняется, и качество результата окрашивания остается очень высоким, даже несмотря на то, что порядок окрашивания был изменен на противоположный, начиная с разработанного протокола окрашивания на основе эозина для КТ, с последующим контрастным окрашиванием этих гистологических микроскопических препаратов на основе эозина гематоксилином.

Разработанный протокол окрашивания на основе эозина позволяет проводить КТ-визуализацию мягких тканей с высоким разрешением вплоть до субмикронного диапазона. В сочетании с недавно разработанными устройствами nanoCT [такими как SkyScan 2211 (Bruker), Phoenix nanotom m (GE) и Xradia ZEISS 520 Versa и 810 Ultra (ZEISS)] (12, 13, 29), неразрушающее создание виртуальных гистологических срезов которые сопоставимы по контрасту и разрешению с обычными гистологическими данными. В будущем это позволит патологу напрямую идентифицировать анатомические структуры и интересующие области без трудоемкой подготовки отдельных срезов, необходимых для стандартной гистологии.

Кроме того, этот метод предоставляет реальную трехмерную информацию об объемном образце мягких тканей, которая помогает патологу получить дополнительную информацию об анатомических структурах, что может способствовать более точной диагностике. Здесь следует упомянуть, что разработанная установка nanoCT, используемая для этой работы, обеспечивает гораздо более быстрое время сканирования и предлагает большее поле зрения (FOV) (что позволяет изучать более крупные образцы) по сравнению с доступными в настоящее время лабораторными рентгеновскими приборами nanoCT, которые могут достигать сопоставимых разрешений (12).

Необходимые красители для разработанной процедуры окрашивания на основе эозина легко доступны. Протокол окрашивания прост в применении, нетоксичен и быстр для окрашивания КТ всего органа, что позволяет визуализировать образцы мягких тканей в 3D (рис. 4). Таким образом, просматривая патологические образцы мягких тканей, обзорное сканирование предоставит ценную информацию об измененных анатомических областях и структурах, что позволит определить ROI. Их можно изучить в 3D с помощью микроКТ или наноКТ и оценить в 2D с помощью гистологии.Здесь возможно нанесение дополнительного контрастного окрашивания. Эта работа демонстрирует потенциал трехмерной рентгеновской гистологии как инструмента для будущих гистологических и гистопатологических приложений.

Методы

Использованные животные.

Содержание животных было проведено в Klinikum rechts der Isar, Технический университет Мюнхена в соответствии с директивами Европейского Союза 2010/63. Удаление органов было одобрено внутренним комитетом по защите животных Центра доклинических исследований Klinikum rechts der Isar, Мюнхен, Германия (внутренний номер ссылки 4-005-09).Все процедуры выполнялись в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами. Все лаборатории проверяются на соответствие принципам надлежащей лабораторной практики Организации экономического сотрудничества и развития (ОЭСР). Мы подготовили целую почку мыши, используя окончательный вариант процедуры окрашивания эозином. Затем образец мягких тканей использовался для оценки структурной сохранности и качества окрашивания, определения морфологических структур, сравнения с обычными гистологическими методами и оценки для дальнейшего гистологического окрашивания.Остальные органы (в основном печень мыши для отбора образцов во время разработки и оптимизации метода окрашивания и почка мыши для окончательной оптимизации и окончательного сбора данных) были использованы для разработки протокола окрашивания и оптимизации параметров (другие органы, такие как сердце, легкие, селезенка и мозг будут использоваться для будущих исследований).

Отбор проб.

Мы закупили все реагенты у Sigma-Aldrich, если не указано иное. Целые органы мыши фиксировали и сохраняли в условиях, описанных ниже.Образцы кубовидных мягких тканей из печени мыши (длина края 2-3 мм) использовались для развития и оптимизации окрашивания. Небольшие образцы ткани кубовидной формы вырезали скальпелем (Aesculap). Температуру контролировали, помещая образцы в холодильник (4 ° C) или в условиях окружающей среды лаборатории. Инкубации проводили в держателях образцов с плоским дном, которые заменяли после каждого этапа, но не после этапов промывки или дегидратации. Для развития и оптимизации окрашивания были протестированы несколько параметров, таких как фиксатор, концентрация фиксатора или окрашивающего агента, время инкубации или pH фиксатора или окрашивающего агента.Окрашенные образцы мягких тканей исследовали на компьютерном томографе phoenix v | tome | x s 240 с типичными настройками: пиковое напряжение 50 кВ, 6,0 Вт и 1001 проекция, распределенная на 360 °. Данные КТ с низким разрешением были получены при времени экспозиции 1 с на каждую проекцию с эффективным размером пикселя ~ 30 мкм. Данные микроКТ были реконструированы с помощью интегрированного программного обеспечения Phoenix datos x CT и проанализированы на ( i ) полноту окрашивания, ( ii ) внешний вид диффузионных колец, ( iii ) усиление контраста, ( iv ) внешний вид КТ артефакты в виде полос и ( против ) однородности окрашивания.

Протокол окрашивания эозином.

Орган мыши был удален хирургическим путем и немедленно помещен в 50-миллилитровую центрифужную пробирку Falcon (neoLab), которая была заполнена фиксирующим раствором, содержащим 9,5 мл 4% (об. / Об.) Раствора формальдегида (FA, полученного из 37 % бескислотный раствор ЖК, стабилизированный ~ 10% метанолом от Carl Roth; дальнейшее разбавление фосфатно-солевым буфером Дульбекко (DPBS; Thermo Fisher Scientific) без кальция и магния) и 0,5 мл ледяной уксусной кислоты (Alfa Aesar).Образец охлаждали в течение 24-72 ч, а затем промывали фосфатно-солевым буферным раствором в течение 1 ч (DPBS без кальция и магния). Орган мыши помещали в окрашивающий раствор эозина y [30% (вес / объем) в дистиллированной воде; Sigma-Aldrich, номер продукта E4382, пятно сертифицировано Комиссией по биологическим пятнам]. Образец мягких тканей окрашивали 2 мл окрашивающего раствора в течение 24 ч (образец мягких тканей свободно перемещался в контейнере для образца). Во время инкубации образец мягких тканей держали на горизонтальной встряхиваемой пластине, обеспечивающей плавное качание со скоростью 60 об / мин.После окрашивания образец мягких тканей осторожно извлекали из контейнера для образца и доступ окрашивающего агента мягко промокали салфеткой из целлюлозы. Образец мягких тканей хранили в пробирке Эппендорфа над паровой фазой этанола [пробирка Эппендорфа содержала несколько капель 70% (об. / Об.) Этанола на дне пробирки].

X-Ray MicroCT Imaging.

Окрашенную почку мыши переносили в держатель образца, который позволяет закрепить в органе мыши более 70% (об. / Об.) Паров этанола.Рентгеновские измерения microCT были выполнены с помощью ZEISS Xradia Versa 500. Все показанные изображения были получены при пиковом напряжении 50 кВ, 3,5 Вт и с 1601 проекцией, распределенной на 360 °. Данные КТ низкого разрешения были получены с объективом 0,39 × и временем экспозиции 2 с на каждую проекцию с эффективным размером пикселя 12 мкм. Эти обзорные данные компьютерной томографии использовались для определения области интереса для компьютерной томографии с высоким разрешением, которая была выбрана с помощью встроенного программного обеспечения для разведки и сканирования ZEISS Xradia Versa 500.Данные КТ высокого разрешения были получены с объективом 4x и временем экспозиции 15 с на каждую проекцию с эффективным размером пикселя 3,3 мкм. Данные КТ были восстановлены с помощью встроенного программного обеспечения.

Объемные визуализации данных микроКТ, показанные на рис. 4, были созданы с помощью Avizo Fire 8.1 (FEI Visualization Sciences Group).

Подготовка проб для NanoCT.

Окрашенную почку мыши обезвоживали и подвергали CPD перед визуализацией наноКТ. Перед первым этапом окрашенную почку мыши разрезали на две половины по самой длинной оси.Одна из половинок была дополнительно разрезана для анализа изображений наноКТ. Две анатомические области почечной коры и мозгового вещества почек были отделены друг от друга и разрезаны на очень маленькие кусочки ткани (скальпель из Aesculap) с длиной края около 0,5 мм. Инкубации с дегидратацией проводили по 1 ч каждая. Перед первым этапом дегидратации мелкие кусочки переносили в новую чашку Петри, где они оставались для всех последующих этапов. Используемые концентрации (все объем / объем) для серии дегидратации были в%: 50, 60, 70, 80, 90, 96 и 100 этанола, уравновешенного дистиллированной водой.Кусочки обезвоженной ткани мыши затем подвергали CPD с использованием Bal-TEC CPD 030 с CO 2 в качестве осушающего агента. Кусочки ткани мыши хранили в силиконовой корзине, которую помещали в вакуумную камеру, предварительно наполовину заполненную 100% этанолом. После охлаждения до 6-8 ° C камера заполнялась жидким CO 2 . При перемешивании выдерживали 3 мин для смешивания двух компонентов перед тем, как опорожнить камеру, пока держатель образца все еще не был закрыт. Эту процедуру повторяли 10 раз, чтобы обеспечить полную замену этанола на CO 2 в образце.После окончательного заполнения камеры CO 2 машина была нагрета до критической точки CO 2 (31 ° C и 73,8 бар) с последующим очень медленным выделением газообразного CO 2 за время 30 минут. Кусочки ткани мыши CPD перед дальнейшим использованием хранили в чашке Петри в эксикаторе.

X-Ray NanoCT Imaging.

Рентгеновские измерения nanoCT проводились с помощью системы nanoCT собственной разработки, которая состоит из нанофокусного источника рентгеновского излучения (прототип Nano Tube; Excillum) (30) и детектора счета однофотонов (PILATUS 300K-W). 20 Гц; Dectris) (31, 32).Устройство без линз основано на простом геометрическом увеличении и может генерировать 3D-данные с разрешением до 100 нм (24). Представленные данные были получены при пиковом напряжении 60 кВ с 1599 проекциями, распределенными на 360 °, и размером вокселя ∼400 нм. Для этого размера вокселя поле обзора одного измерения CT составляет ~ 560 мкм в направлении, перпендикулярном оси вращения (горизонтальное), и 75 мкм в направлении оси вращения (вертикальное). Однако поле зрения можно расширить вдоль оси вращения путем объединения нескольких сканирований в разных вертикальных положениях в больший объем.Кроме того, возможность проведения локальных томографических измерений позволяет использовать образцы большего диаметра, перпендикулярного оси вращения, чем дает поле обзора глобального КТ-измерения. Время экспозиции на изображение составляло 4 с, а общее время сбора данных на набор данных составляло ~ 3,5 часа. После нормализации полученных проекций изображениями с плоским полем резкость проекций была дополнительно увеличена с помощью алгоритма деконволюции Ричардсона-Люси (33, 34). Ядром для деконволюции была вращательно-симметричная функция Гаусса с SD, равным 1 пикселю.Для увеличения контрастности мягких тканей алгоритм Паганина с фазовым восстановлением был применен к резким изображениям (35). Подводимая энергия составляла 20 кэВ, что соответствует средней энергии установки nanoCT при 60 кВ пик. Соотношение между затуханием и фазовым коэффициентом было оптимизировано для наилучшего качества изображения.

Предварительно обработанные проекции были восстановлены с помощью современного алгоритма фильтрованного обратного проецирования. Срезы проекции минимальной интенсивности, показанные на фиг. 4 и фиг. S2, были сгенерированы путем вычисления минимального значения для каждого пикселя в 18 смежных срезах, что соответствует толщине виртуального среза ~ 7 мкм.

Объемные визуализации данных nanoCT, показанные на рис. 4, были созданы с помощью Avizo Fire 8.1 (FEI Visualization Sciences Group).

Гистологический анализ.

Окрашенную почку мыши обезвоживали и заливали парафином в соответствии со стандартными процедурами перед гистологическим срезом и последующим гистохимическим контрастным окрашиванием. Перед первым этапом окрашенную почку мыши разрезали на две половины по сагиттальной оси. Одна из половинок была дополнительно исследована гистологически.Перед первым этапом дегидратации почку мыши переносили в новую центрифужную пробирку Falcon объемом 50 мл (neoLab), где она оставалась для всех последующих этапов. Для дегидратации образцы дважды обезвоживали в 70% и 96% этаноле в течение 1 ч и очищали в ксилоле дважды в течение 1 ч. После этого образец инкубировали в течение ночи в парафиновом воске при 50 ° C для пропитывания всего образца воском, залитого в парафин, и с помощью микротома (Leica) вырезали срезы толщиной 7 мкм. Срезы регидратировали и либо непосредственно заливали (Eukitt; Merck), либо контрастировали в течение 6 минут кислым гематоксилином Майера (Morphisto) в соответствии с протоколом производителя.Гистологический анализ выполняли с использованием микроскопа Axio Imager 2 и программного обеспечения AxioVision (ZEISS).

Дополнительная информация сопровождает эту статью.

Благодарности

Мы благодарим доктора Энкена Дреколла за гистологические обсуждения и чрезвычайно полезную команду из Excillum AB, Швеция. Мы признательны за финансовую поддержку в рамках программы DFG Gottfried Wilhelm Leibniz. Этот исследовательский проект получил финансирование от Программы исследований и инноваций Европейского Союза Horizon 2020 в рамках Соглашения о гранте Марии Склодовской-Кюри h3020-MSCA-IF-2015-703745-CONSALT.

Сноски

  • Вклад авторов: M.B., M.M., J.H., and F.P. спланированное исследование; М.Б., М.М. и М.А.К. проведенное исследование; М.Б., М.М., С.Ф., С.А. и К.А. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; М.Б., М.М., М.А.К., С.Ф., С.А. и К.А. проанализированные данные; и М.Б., М.М. и М.А.К. написал газету.

  • Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

  • Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

  • Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1720862115/-/DCSupplemental.

Окрашивание и визуализация с высоким разрешением трехмерных моделей органоидов и сфероидов

Культура клеток - незаменимый инструмент для раскрытия фундаментальных биологических механизмов, участвующих в развитии, функционировании, регенерации и разрушении тканей и органов, а также заболеваниях. Хотя преобладала однослойная 2D клеточная культура, недавние исследования сместились в сторону культур, генерирующих 3D-структуры, более отражающие клеточные ответы in vivo, в частности, из-за дополнительной пространственной организации и межклеточных контактов, которые влияют на экспрессию генов и клеточное поведение и, таким образом, могут предоставить более предсказуемые данные. 7 .Тем не менее, многие проблемы остаются, включая потребность в удобных для пользователя методах окрашивания и визуализации для детальной микроскопической визуализации и оценки сложных трехмерных структур на клеточном и субклеточном уровнях. В этом контексте были предоставлены подробные, надежные и дополнительные протоколы для выполнения окрашивания и визуализации с клеточным и субклеточным разрешением фиксированных трехмерных моделей культур клеток in vitro размером от 100 мкм до нескольких миллиметров.

Эта процедура представляет две различные стратегии для работы с большим разнообразием размеров и типов трехмерных моделей культур клеток in vitro.Выбор одного из них (трехмерный анализ всего крепления) или другого (двухмерный анализ разрезов) будет зависеть от используемой модели и исследуемой проблемы. Трехмерный полный анализ с помощью конфокальной микроскопии позволяет визуализировать клетки с полем глубины до 200 мкм, независимо от общего размера трехмерной структуры, тогда как двухмерное сечение применимо к образцам любого размера, но визуализация остается двухмерной. . Ниже приведены некоторые предложения по устранению неполадок и технические соображения.

Потеря трехмерных структур во время рабочего процесса - наиболее частый недостаток.Они могут оставаться прилипшими к наконечникам и пробиркам, поэтому предварительное покрытие наконечников и пробирок 0,1% раствором PBS-BSA является ключевым фактором. Более того, очень важно, чтобы трехмерные структуры оседали между сменами реагентов, и выполнять пипетирование очень осторожно. Как упоминалось в процедуре, для всех этапов, если осаждение трехмерной структуры слишком длительное, клетки можно осторожно вращать при 50 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. В зависимости от цели исследования следует учитывать преимущества / недостатки такого этапа прядения, поскольку центрифугирование может нарушить форму трехмерных структур.Более того, следует позаботиться о сохранении этой морфологии на этапе фиксации, поскольку кистозные органоиды имеют тенденцию разрушаться. Крепление конструкций размером менее 400 мкм должно предотвратить структурные изменения.

Для оптимальной иммунной метки важнейшим шагом является извлечение органоидов из их трехмерных матриц. 3D-матрица может препятствовать адекватному проникновению антител или приводить к сильному фоновому окрашиванию из-за неспецифического связывания с матрицей. Удаление ECM может изменить морфологию внешних сегментов органоидов (особенно в случае небольших клеточных выступов, выходящих из исследуемых трехмерных структур) и частично затруднить анализ.Для таких трехмерных структур матрица может сохраняться на протяжении всей процедуры; однако условия культивирования должны быть тщательно адаптированы для выращивания клеток в минимальном количестве матрикса, чтобы предотвратить недостаточное проникновение растворов и антител и избежать последовательных этапов промывки, направленных на снижение чрезмерного фонового шума. 6 , 8 .

Этап оптической очистки, описанный в этом протоколе в разделе 3D-окрашивания всего крепления, подходит для визуализации трехмерных структур глубиной до 150-200 мкм вместо 50-80 мкм без очистки.По сравнению с другими методологиями очистки, которые часто требуют нескольких недель и используют токсичные очищающие агенты, в этом протоколе использовался ранее опубликованный этап быстрой и безопасной очистки 4 , 9 . Кроме того, этот этап очистки является обратимым, и новые антитела могут быть добавлены к первоначальному окрашиванию без потери разрешения или яркости 4 . Тем не менее, в зависимости от изучаемой модели трехмерной культуры клеток, глубины 150-200 мкм может быть недостаточно для информативного изображения трехмерной структуры, и этот протокол очистки может вызвать изменения в общей морфологии сферических монослойных органоидов с большими размерами. люмен 4 .Пользователи должны тщательно спланировать свой эксперимент и, при необходимости, оптимизировать время этапа пермеабилизации / блокирования (чтобы обеспечить проникновение антител и раствора), этапа очистки (чтобы проникнуть глубже 200 мкм, образцы должны быть полностью очищены) и изображения. получение. Двумя наиболее распространенными технологиями, доступными на основных объектах, являются световая микроскопия и конфокальная микроскопия. Пользователи должны будут тщательно выбирать технологию в зависимости от размера их трехмерных структур и своего биологического вопроса 10 .Однако по сравнению с конфокальной микроскопией разрешение световой микроскопии, полученное для таких глубоких структур, остается субоптимальным для получения субклеточного разрешения.

Здесь описан подробный и надежный процесс, посвященный заливке в парафин отдельных образцов. Интересно, что Габриэль и др. недавно разработали протокол, заключающийся в встраивании трехмерных клеточных культур в парафин с повышенной производительностью. Они использовали форму из полидиметилсилоксана (PDMS), чтобы ограничить 96 трехмерных структур в шаблоне микроматрицы в одном блоке, что открыло новые перспективы для исследований трехмерных моделей опухолей, охватывающих большее количество групп, временных точек, условий лечения и повторений 11 .Однако этот метод требует обширных навыков и оборудования, особенно для изготовления предварительных форм, используемых для создания форм из PDMS.

Таким образом, в этой статье описываются два различных, дополняющих и адаптируемых подхода, позволяющих получать точную и количественную информацию об архитектурном и ячеистом составе трехмерных сотовых моделей. Оба параметра имеют решающее значение для изучения биологических процессов, таких как внутриопухолевая клеточная неоднородность и ее роль в устойчивости к лечению.

Требуется подписка. Пожалуйста, порекомендуйте JoVE своему библиотекарю.

Протоколы | Лаборатория Брюгге

бромидом этидия
Трехмерный рост MCF10A в матригеле 10A Morphogenesis_EL.pdf
Анализ коллагена DQ в матригеле DQ Matrigel.doc.pdf
Посев MCF10A для трехмерного морфогенеза Seeding_of_MCF10A_for_3D.doc.pdf
Генерация коллагена: смешанный гель Matrigel Generation_of_Collagen.doc.pdf
Анализ ЛДГ (для количественного определения 3D лизатов) LDH.doc.pdf
Окрашивание MCF 10A acini Окрашивание EtBr_EL.doc.pdf
Смешанные культуры коллаген / матригель для клеток MCF-10A Collagen_EHS morphogenesis.pdf
Уход за клетками MCF-10A и их перенос в однослойной культуре Care_Passage_MCF_Matrigel.doc.pdf
Acrobat Immunofluorescence of Mammary Epithelial Acini Протокол 3D IF_EL.doc.pdf
Морозильные камеры Freezing_Cells.doc.pdf
Наложение трехмерной культуры клеток MCF-10A на MatrigelTM 3DimensionalCulture_of_MCF-10A.doc.pdf
Протокол внедрения для замороженных секций MCF-10A Встраивание ProtocoMCF_frozen.pdf
Протокол окрашивания для замороженных срезов MCF-10A StainingProtocol_MCF_Frozen.pdf
Сбор белковых лизатов из трехмерных ацинарных культур (для количественной оценки нефосфорилированных внутриклеточных стабильных белков) HarvestingProteinLysates_Stable.doc.pdf
Acrobat Harvesting Protein Lysates из 3-D ацинарных культур (для количественного определения фосфо-белков, внеклеточных белков или быстро разлагаемых белков) Сбор лизатов протеина быстро разлагается.doc.pdf
Сбор РНК из 3-D ацинарных культур HarvestingRNA_3D_AcinarCultures.doc.pdf
Окрашивание бромидом этидия Acrobat для анализа гибели клеток во время трехмерного культивирования EthidiumBromideSptingAnalysisCellDeath.doc.pdf
Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание ацини MCF-10A, культивируемых в матригеле (упрощенное) Иммунофлуоресцентный, содержащий MCF-10A_Acini_Simplified.doc.pdf
Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание ацини MCF-10A, культивированных в матригеле (подробно) Иммунофлуоресцентное содержание MCF-10A_Acini_Detailed.doc.pdf
Рецепт промывочного буфера для иммунофлуоресценции BUFFER_RECIPES.doc.pdf
Рецепты СМИ MCF-10A MediaRecipesForMCF10ACells.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *