Кератиновое окрашивание: Кератиновое выпрямление волос плюсы и минусы

Кератиновое выпрямление волос плюсы и минусы

Каждая девушка мечтает о волосах «как в рекламе». Однако новомодные шампуни, средства для укладки, краски, которые рекламируют, не помогут стать обладательницей идеально гладких и блестящих локонов. Зато добиться такого эффекта можно, сделав кератиновое выпрямление волос.

Что такое кератирование?

Кератин — белок, придающий прочность ногтям и волосам человека. Выпрямление волос с помощью кератина призвано не только разгладить кудри, но и восполнить потери этого белка, предотвратить вред, наносимый химическими веществами и окружающей средой. За счёт этого к локонам возвращаются здоровье и прекрасный внешний вид.

Мастер во время процедуры применяет специальные составы, в которые помимо самого кератина входят в небольшом количестве альдегиды, в том числе формальдегид. Под воздействием альдегидов волос распрямляется, а кератин во время нагревания проникает глубоко в его структуру, запаивает поврежденные участки, придает блеск.

Плюсы и минусы кератинового выпрямления

Процедура кератирования обладает уникальным эффектом, которого невозможно достичь другими салонными методами, а тем более в домашних условиях. Несмотря на то, что профессионально исполненное кератиновое выпрямление гарантирует обретение шикарных волос, оно имеет и преимущества, и недостатки.

Преимущества кератирования:

• каждый волосок становится крепче и толще;
• время сушки сокращается;
• волосы после кератинового выпрямления становятся идеально гладкими, не пушатся и не электризуются;
• расчесывание и укладка волос превращаются в сплошное удовольствие — никакого спутывания и максимальная послушность;
• эффект длится в среднем три месяца, иногда держится до полугода;
• весь период локоны защищены от вредных воздействий — пыли, ультрафиолета и загрязнения воздуха.

Недостатки выпрямления кератином:       

• кератирование – трудоемкая процедура, требующая использования дорогих препаратов, поэтому цена кератинового выпрямления кому-то может показаться высокой;
• процедура длится несколько часов;
• волосы теряют в объеме;
• на светлых волосах может появиться желтый оттенок;
• чтобы продлить эффект, необходимо использовать специальные средства для ухода, в том числе шампунь без содержания сульфатов.   

Основные этапы

На первом этапе необходимо выполнить глубокую очистку специальным шампунем, приподнимающим чешуйки волос и тщательно удаляющем загрязнения. Может показаться, что этот этап не так важен, однако если пренебречь им, результат процедуры может разочаровать — кератин просто не проникнет в структуру так глубоко, как это необходимо, и волосы после кератинового выпрямления останутся такими же, как были до процедуры.

На второй стадии мастер наносит средство для выпрямления и просушивает локоны. И то, и другое делается с особой тщательностью, чтобы не пропустить ни одного участка.

На заключительном этапе разделенные на небольшие пряди волосы выпрямляются прогретым до 230 градусов утюжком.

Если хоть на одном этапе технология будет нарушена, последствия кератинового выпрямления могут стать плачевными. И вместо того, чтобы обрести роскошную шевелюру, можно потерять даже ту, что была. Например, если приступить к работе утюжком на влажных прядях, частицы воды внутри волоса разрушат его структуру. Это не отразится на результате процедуры, однако даст о себе знать через несколько месяцев, когда эффект кератинового выпрямления волос закончится. В результате такого непрофессионального подхода и появляются негативные отзывы о кератиновом выпрямлении волос.

Подводные камни, или Чего нельзя делать после кератирования?

Чтобы длительная и дорогостоящая процедура не прошла впустую, в течение трех суток после кератирования нельзя мыть голову, убирать волосы за уши, использовать заколки и средства для укладки. Соблюдение этих простых рекомендаций позволит закрепить эффект и избежать появления заломов.  Если на волосах всё же образовался залом, нужно аккуратно разгладить его утюжком. Для других целей утюжок и плойку первые дни применять нельзя. Окрашивание тоже стоит отложить хотя бы на полмесяца, иначе волосы приобретут прежний вид.

Вам может быть интересно

Особенности мелирования волос

Не верьте, что мелирование уже неактуально. Его можно отнести к традиционной, отметившей многолетний юбилей, процедуре. Но косметологическая промышленность не стоит на месте, и современные технологии позволяют изменить женский облик, подобрав наиболее оптимальный вариант мелирования волос.

Читать дальше Лунный календарь окрашивания

Наверное, про влияние Луны на наш организм знает уже каждый. Но известно ли вам, что земной спутник способен воздействовать не только на здоровье и самочувствие, но и на состояние волос? А ведь об этом догадались еще наши предки, после чего стали проводить стрижки и окрашивание волос по лунному календарю. Ведь когда Луна во время очередных косметических экспериментов находится не в той фазе, то и цвет может смотреться тускло, блекло, и сама стрижка может оказаться неудачной, а волосы будут отрастать бесконечно долго.

Читать дальше Калифорнийское мелирование или эффект выгоревших волос

Мода на классическое мелирование давно прошла.

На смену ему пришло мелирование, которое придает эффект выгоревших волос, столь популярный в последнее время. Это новинка в области окрашивания волос, наиболее щадящая процедура для их структуры под названием калифорнийское мелирование волос.

Читать дальше

через сколько можно красить (отзывы)

На чтение 7 мин. Просмотров 94.7k. Опубликовано 12.09.2018 Обновлено 22.09.2020

Красивые, здоровые локоны – мечта многих девушек. Однако далеко не все готовы тратить уйму времени на уход за шевелюрой, еженедельно делать маски. Нужна эффективная процедура с длительным результатом. Оптимальный вариант, прибегнуть к кератиновому выпрямлению волос.

Этот метод восстановления ослабленных стержней является одним из самых популярных. Он делает локоны эластичными, гладкими, прочными и блестящими. Но можно ли красить волосы после кератинового выпрямления и если да, то, как проводят эту процедуру.

Кератирование

Прежде, чем решиться на кератирование, следует всё взвесить, хорошо подумать. После процедуры локоны сильно изменятся и не только визуально. Чтобы вернуть их к изначальной структуре потребуется время.

Чем тоньше волосяной стержень, тем результативнее станет выпрямление. Хорошо подходит кератинизация и обладательницам шевелюр со средней жёсткостью.

Первые двое суток после процедуры не рекомендуется:

• мыть голову;
• применять масла, кондиционеры, маски, скрабы;
• пользоваться лаками, гелями, восками, пенками;
• использовать заколки, резинки, ободки;
• делать завивку.

После кератинового выпрямления о курчавой шевелюре, об утюжках, можно забыть на длительный период. Эффект после такой техники исполнения держится от 2 до 5 месяцев, в зависимости от применённого метода и структуры волос.

Навредит ли волосам окрашивание

Кератиновое выпрямление и химическое окрашивание, две совершенно противоположные процедуры.

Краски содержат аммиак или перекись водорода и другие агрессивные вещества. Они помогают пигменту проникнуть в волосяной стержень. Во время окрашивания кератиновые чешуйки теряют плотность, становятся рыхлыми, безжизненными. Родной цвет вытесняется, появляется новый оттенок.

Последствия окрашивания:

• структура стержней теряет целостность, плотность;
• усиливается сечение и выпадение;
• происходит пересушивание локонов;
• возможно проявление аллергических реакций;
• возникает перхоть.

Некоторым женщинам использования краски не избежать, особенно тем, у которых есть потребность в маскировке седины.

Красить волосы после выпрямления можно. Только не сразу. В салоне красоты необходимо сообщить мастеру о том, когда и как было проведено кератирование.

До изменения цвета, важно выдержать паузу – 2-3 недели, а лучше месяц. Это позволит избежать неприятных последствий окрашивания насильно выпрямленных локонов.

Если не нарушать временной период между процедурами, то результат приятно удивит. Краска не сильно навредит шевелюре. При этом, на оздоровленных стержнях, свежий тон будет смотреться интенсивно и эффектно.

Браться за осветление прядей специалисты советуют через месяц после проведения лечебной процедуры.

Мнение эксперта

Катерина Великая

Врач-дерматовенеролог, трихолог и косметолог

Если было сделано японское кератирование, тогда от мелирования, обесцвечивания и других видов осветления, лучше отказаться, минимум на 3 месяца.

Повлияет ли кератин на результат окрашивания

Количество кератина после окрашивания может существенно уменьшиться, если не сделать полноценный перерыв между процедурами. Также пигмент ляжет неравномерно, поскольку не сможет в одинаковом количестве проникнуть в структуру волоса.

Причёска будет выглядеть не ухоженной, неопрятной. При этом практически полностью разрушится эффект кератинового воздействия. Деньги, отданные за оздоровление шевелюры, а позже за окрашивание, будут выброшены на ветер.

Если же возникла необходимость в кератиновом выпрямлении через пару недель после окрашивания, то новый оттенок не потеряет интенсивность на протяжении длительного времени. На тот момент, кератина в стержнях будет ещё достаточное количество, но чешуйки его уже станут податливыми, волос примет пигмент в нужном объёме, а вещество надёжно закрепит его в нём.

Выбирая между окрашиванием до выравнивания и после, следует остановиться на первом варианте. Он, по мнению экспертов, эффективнее и менее рисковый.

Подготовка волос к окрашиванию

Чтобы процесс окрашивания был комфортным, а результат качественным, следует грамотно подготовить локоны к процедуре.

Процесс одинаков для всех, не важно, делалось ли раньше выпрямление стержней или нет. Но при любом процессе необходимо соблюдать ряд правил. От этого зависит не только результат, но и здоровье волос, их внешний вид.

Правила, которые требуется соблюдать перед окрашиванием	Пояснение
Необходимо отказаться от мытья головы за 2 дня до запланированной смены цвета на шевелюре	На коже образуется тонкий слой кожного сала. Он значительно смягчит агрессивное воздействие краски на эпидермис. Процесс пройдёт комфортно и безопасно
Нужно тщательно расчесать локоны от корней до кончиков	Это позволит избавиться от пыли и прочих незаметных глазу частиц
За неделю до окрашивания, желательно отказаться от кондиционеров и других косметических средств	Они не позволяют пигменту полностью проникнуть в структуру стержня
За 3 дня до процедуры нельзя пользоваться лаками, пенками, гелями, восками, пудрами и любыми фиксационными средствами	Ограничится доступ пигмента к структуре волоса. Краска ляжет не равномерно
Если на коже головы присутствуют ранки, раздражения – окрашивание лучше отложить	Это вызовет дискомфорт в виде кожного зуда, боли, жжения. Замедлит процесс заживления

Мнение эксперта

Селютина Марина Валерьевна

Медицинский центр ЧудоМед, стаж 23 года

Если попадётся бракованная краска, то даже соблюдение всех правил не даст гарантии качественного результата.

Также следует подбирать составы с наиболее щадящими компонентами. Подойдут краски без аммиака или народные средства, изготовленные на основе хны, басмы. Эти средства, во время кератирования, закрепятся в волосе на несколько месяцев.

Мнение эксперта

Селютина Марина Валерьевна

Медицинский центр ЧудоМед, стаж 23 года

Выпрямление даёт эффект осветления, поэтому желательно покупать краску на тон выше.

Смотрите также: уход после процедуры кератинового выпрямления (видео)

Восстанавливающие средства

После окрашивания за локонами необходимо следить ещё основательнее, чем прежде. Грамотно выбранные продукты, способны быстро привести шевелюру в норму.

Начинать формировать личный набор по уходу за волосами, необходимо с шампуня. В приоритете средства, с натуральным составом и подходящие к определённому типу шевелюры. Правильно выбранное моющее средство для шевелюры за 2 недели способно сделать её блестящей и красивой.

Также необходимо внимательно выбирать, изучая состав, кондиционеры, маски, которые дают увлажнение и питание. А при приобретении масел, лучше опираться на мнение специалистов.

Капсулы дают самый быстрый эффект восстановления. Активные соединения, входящие в их состав, укрепляют пряди, делают их эластичными, плотными, блестящими.

Домашние рецепты для быстрого восстановления волос

Салонные процедуры позволят достичь нужного эффекта быстро, но сильно ударят по кошельку. Но восстановить локоны можно в домашних условиях. Существует множество рецептов действенных масок, при приготовлении которых важно точно соблюдать пропорции.

Состав восстанавливающей маски	Результат
Оливковое масло (9 ст. л.) смешать с натуральным мёдом (3 ст. л.) без добавок и ароматизаторов. Кашицу довести до кипения, охладить до комнатной температуры, нанести на волосы, выдержать 20 мин. Смыть	Усиление блеска, эластичности, увлажнение, ускорение роста
Соединить репейное, миндальное, оливковое масла, 1:1. Нанести на голову, надеть шапочку для душа, сверху утеплить полотенцем, выдержать 1,5 часа	Восстановление секущихся кончиков, сокращение выпадения стержней
Развести свежие дрожжи в тёплой воде. Во время брожения, ввести заранее взбитый, яичный белок. Распределив массу от корней до кончиков, оставить на 20 мин.	Укрепление волосяных фолликулов, придание локонам блеска
Соединить по 1 ст. ложке мёд, репейное масло, сок алоэ, репчатого лука. Выдержать на голове 30 мин.	Избавление от сухости
1 ст. л. желатина соединить с 5 ст. л. тёплой воды. После набухания состава, добавить яичный желток. Выдержать смесь на голове в течение 20 мин.	Возвращение силы, здорового блеска, увлажнения
В 100 г кефира добавить 2 ст. л. оливкового масла, столько же, касторового. Выдержать на волосах маску 1 час, затем тщательно смыть с использованием шампуня	Избавление от выпадения, сухости, придание локонам эластичности

Через месяц после начала использования средства, начнётся выздоровление шевелюры.

Мнение эксперта

Катерина Великая

Врач-дерматовенеролог, трихолог и косметолог

Маски, приготовленные из натуральных продуктов в домашних условиях, необходимо наносить сразу после смешивания ингредиентов.

Отзывы

Ольга Алексеева: «У меня от природы вьющиеся волосы. Устав от ежедневного использования утюжков, сделала кератиновое выпрямление. Не могу нарадоваться! Эффект держится второй месяц. Причёска выглядит ухоженно, красиво. Как только кератин потеряет свойства, буду повторять процедуру».

Людмила Шитовская: «Я несколько лет делаю в салоне красоты кератиновое выпрямление. Результата хватает на 4-5 месяцев. Волосы прямые, будто их укладываю утюжком. Единственная трудность с окрашиванием. Сразу после процедуры, менять цвет нельзя. Приходится выжидать недели 2-3».

Екатерина Семенчук: «Покрасила волосы через неделю после кератирования и пришла в ужас. Краска дала неожиданный оттенок, легла неравномерно, пятнами. Пришлось обращаться к профессиональным парикмахерам. Мастера долго исправляли ситуацию. Больше нет желания, делать выпрямление перед покраской».

Юлия Ковжунидзе: «Не представляю себя без кератирования. Делаю процедуру регулярно. Эффект великолепный – шевелюра, как в рекламе шампуней. Процедура лишила извечной проблемы – вьющихся локонов и ежедневных укладок. Рекомендую попробовать, только сначала нужно выбрать хорошего специалиста».

Наталья Крылович: «Я сделала кератиновое выпрямление по рекомендации подруги. Результат держится второй месяц. Волосы теперь у меня ровные, объёмные, стали легче расчёсываться, перестали путаться, выглядят здоровыми, блестят. Сплошной восторг!».

до или после кератинового выпрямления? Через какое время лучше делать покраску волос? За какое количество дней лучше красить голову до выпрямления?

Окрашивание волос

Современное общество диктует строгие правила к внешнему виду. Девушки поддаются этим тенденциям и постоянно меняют свой образ. Например, если рассмотреть моду на цвет волос, то 2015 год – это однотонный цвет, 2017 год показал такую технику, как балаяж, а вот в 2019 году модные критики рекомендуют возвращать естественный цвет волос. Все эти изменения плохо влияют на волосы. Процедура кератинового выпрямления помогает привести волосы в порядок и создать благородный вид. На вопрос, когда лучше делать процедуру: до покраски или после, ответим в данной статье.

Выполнение процедуры

Кератин, который содержится в составах для выполнения сеанса выпрямления, способствует разглаживанию волос. Помимо ровных прядей, клиентки приобретают ещё много преимуществ:

• блеск по всей длине;
• легкость расчёсывания и приятную структуру;
• закупоривание секущихся концов.

Биополимер кератина позволяет добиваться подобного эффекта, так как он является главным элементом в структуре волоса. Этот элемент создаёт целостность волоска, а с помощью термофиксации образует защитный слой.

Рассмотрим, как происходит процесс выпрямления.

1. Перед сеансом волосы моют с особым шампунем.
2. Обязательно делают 3 равномерных пучка, с которыми будут работать поэтапно. Это позволяет одинаково распределить препарат для выравнивания.
3. Распределение начинается от корней, с отступом ориентировочно в 2 см по тонким рядам.
4. После нанесения всего препарата волосы расчесывают для равномерного распределения.
5. С помощью фена и щётки для укладки сушат пряди.
6. Для образования защитного слоя производят термообработку выпрямителем.

На выполнение сеанса необходимо уделить ориентировочно 4 часа. В течение двух дней препарат ещё выполняет свою работу, поэтому в этот период волосы нельзя мыть и делать с ними причёски.

Как окрашивают?

Перед тем как приступить к главному вопросу, стоит разобраться, что происходит со структурой волос в момент окрашивания. Основной состав краски – это перекись водорода и щелочные элементы. Первый компонент окисляет и проявляет пигмент. Второй помогает красящему пигменту попасть в волосяные чешуйки.

Во время окрашивания:

1. мастер распределяет красящую массу от корней до концов волос с помощью специальной кисти;
2. щелочные элементы способствуют попаданию краски в чешуйки;
3. перекись водорода позволяет волосам утратить природный цвет;
4. волосы приобретают ожидаемый оттенок.

Принцип окрашивания – это химическое проникновение в структуру волоса, что приводит к изменению цвета. Теперь можно начать разбираться с вопросом о времени окрашивания, если есть желание сделать кератиновое выпрямление.

Последовательность

Есть несколько вариантов того, как поступить с волосами, готовясь к кератиновому выпрямлению.

После

Первый вариант – это окрашивание волос после проведения процедуры. Конечно, в таком случае есть много нюансов, которые необходимо учесть.

Приступать к окрашиванию можно не раньше, чем через 2 суток.

Надо помнить, что сразу после сеанса волосы не должны подвергаться никаким физическим и химическим воздействиям. Голову нельзя мыть, нельзя делать причёски, особенно кудри. Если ослушаться этого правила, то не будет ожидаемого результата.

Процедура выравнивания действует на структуру волос таким образом, что чешуйки закрываются. Для изменения цвета волос волосяной фолликул необходимо как можно больше раскрыть, чему поспособствуют химические элементы в составе краски. Если этого не произойдёт, то волосы останутся прежнего цвета.

Поэтому идеальное время для окрашивания – не раньше, чем через 3 недели.

Спустя данное время кератин медленно уменьшает свою функцию, и защитный слой волоса сходит на нет. Чешуйки волоса будут снова готовы принять химические вещества краски. Соответственно, если сделать окрашивание ещё позже, то результат будет эффективнее.

До

Второй вариант – это окрашивание волос перед процедурой. Этот вариант считается более благоприятным. С помощью сеанса выпрямления, цвет запечатается внутри волоска и сохранит эффект надолго, также он будет насыщенным.

Но, как и в первом варианте, есть определенные нюансы, которые необходимо соблюсти. Предъявляется требование по времени окрашивания перед процедурой. Если окрас осуществляется в естественные и тёмные оттенки, то до сеанса должно пройти минимум 10 дней. Если необходимо добиться светлых оттенков, то процедуру кератинового выпрямления можно проводить не раньше, чем через 20 дней. Самое продолжительное восстановление после окрашивания (30 дней) нужно после выполнения техники мелирования.

Есть ещё один совет от профессионалов. Если локоны подвергаются окрашиванию, то к выбору краски стоит подходить со всей ответственностью.

Предпочтение надо отдавать краскам без содержания аммиака. Это позволит избежать глубокого повреждения волосяных фолликулов, так как кератин закрепляет все элементы под защитным слоем.

Каждый сам выбирает способ, который подходит именно ему. Стоит только знать, что возможен вариант окраса и до процедуры, и после. И тот и другой выполнит свои функции. Нельзя однозначно сказать, что первая альтернатива лучше второй, и наоборот.

Полезные советы

Для того чтобы после изменения цвета волос и процедуры выравнивания с кератином волосы имели насыщенный и блестящий цвет, нужно выполнять следующие правила.

• Для изменения цвета прядей используйте только краски без содержания аммиака.
• Можно приобретать басму и хну. Они состоят из натуральных элементов и не портят структуру волос.
• Если было принято решение кардинального смены имиджа (из чёрного в светлый цвет или наоборот), то процедуру кератинового выпрямления производят не ранее, чем через 3 месяца.
• Не передерживайте состав во время окрашивания, четко соблюдайте инструкцию.
• Если в обычной жизни используется оттеночный тоник, то за несколько недель до процедуры от него следует отказаться. Причиной такого правила является то, что при термообработке волоса оттенок тонирующего средства изменится. Какой цвет получится в итоге, предугадать невозможно.
• Если выбор пал на процедуру в японской технике, то хну и басму нельзя использовать для окрашивания в течение года перед сеансом.

Подводя итоги, можно сделать следующий вывод: сеанс кератином и окрас волос могут сосуществовать вместе, но не одновременно.

Если требуется окрашивание волос, то необходимо соблюдать вышеперечисленные правила. В таком случае получится максимальный эффект от двух процедур. Кратко говоря, если окрас производится до процедуры, то надо соблюсти срок в 2 недели, а если после, то не раньше чем через месяц.

Однако не стоит забывать, что качество краски имеет сильное влияние на сокращение и увеличение сроков. Именно поэтому, решившись на дорогостоящее выпрямление, не стоит экономить на краске.

Техника окрашивания и кератинового выпрямления в один день приведена далее.

Кератиновое выпрямление до или после окрашивания волос. Можно ли делать процедуру перед окрашиванием или сразу после него?

Кератиновое выпрямление до или после окрашивания волос. Можно ли делать процедуру перед окрашиванием или сразу после него?

Как было сказано ранее, делать окрашивание сразу же после этой процедуры строго не рекомендуется. Это связано с тем, что во время кератиновой обработки шевелюры создаётся защитная оболочка по всей длине . Из этого легко сделать вывод, что красящему пигменту краски попросту не будет возможности зацепиться. Он не сможет проникнуть в структуру прядей, что приводит к отсутствию нужного оттенка и яркости цвета.

Проводя процедуру окрашивания волос сразу после выпрямления кератином Вы рискуете полностью свести положительный эффект от процедуры! Специалисты считают, что проводить процедуру окрашивания шевелюры гораздо полезнее до кератирования.

Если вы решились провести смену имиджа до процедуры, то к выбору красящего состава требуется подойти максимально ответственно, так как кератин закрепляет пигмент и краска на волос держится дольше , чем при обычном окрашивании.

Это напрямую связано с принципом действия краски и кератина на человеческий волос. Разберёмся по порядку. Многие слышали про кератин, но мало кто знает, что он собой представляет и в чём заключаются его полезные свойства. Кератин представляет собой белок, из которого собственно и состоит весь волосяной покров человека.

ВНИМАНИЕ : При процедуре кератирования на волосы оказывают воздействие высокие температуры, которые запечатывают структуру каждого волоска снаружи и крепко прижимают чешуйки пряди друг к другу. Именно благодаря этому достигается эффект идеальной гладкости шевелюры.

Положительным аспектом данной процедуры является не только уникальность кератина, но и то, что в смеси на его основе также добавляют лечебные компоненты, которые улучшают состояние волос.

Цель красящего состава заключается в том, чтобы пигменты краски попали в каждую чешуйку волоска и могли закрепиться в ней под действием активных компонентов. Несложно сделать вывод, что процедуры кератирования и окрашивания являются обратными друг другу . Результатом спешки в этом деле окажется неровный цвет от окрашивания и разрушение ламинирующего покрытия.

Кератиновое выпрямление на мелированные волосы. Можно ли делать мелирование после кератина

Кератиновое выпрямление волос – одна из самых популярных техник восстановления волос на сегодняшний день. После кератина волосы приобретают здоровый и ухоженный вид, выглядят безупречно гладкими и позволяют хозяйке сэкономить кучу времени на укладке. Но есть нюанс, в виде дальнейшего окрашивания волос.

Вопрос окрашивания волос напрямую связан с химическим составом краски и с тем, содержится ли в ней аммиак. Принципы действия у кератинового выпрямления и химического окрашивания диаметрально противоположные: первый сглаживает чешуйки волоса, а второй, наоборот, взрыхляет их. Именно поэтому должен быть перерыв между процедурами, иначе вы не увидите результата ни от той, ни от другой .

Окрашивание можно делать до и после процедуры, соблюдая правила:

• Осветление и мелирование можно делать за 15-20 дней до кератина, прикорневое мелирование не менее чем за 30 дней.
• Стойкие красители до кератина можно применять за 3 дня, после – через 14 дней.
• Мелирование после кератина проводится через 2-3 недели.
• Натуральными красителями можно пользоваться до и после процедуры без ограничения во времени.

Если испытываете сильную необходимость в окрашивании, минимальный срок – 10 дней после каретина.

Окрашивать волосы после техники кератина можно, после него вы добьетесь больше видимого внешнего эффекта, цвет сохранится дольше, волосы станут более упругими и блестящими. Главное, выдержать нужный промежуток времени и используйте максимально щадящий состав краски. Если решите делать окрашивание после кератирования, обязательно предупредите парикмахера.

Чем красить волосы после кератинового выпрямления. Окрашивание, выпрямление, завивка после кератинового выпрямления

Что такое кератин?

Кератин является основой структуры человеческого волоса. От него зависит, какая шевелюра будет: вьющиеся локоны, волнистые или прямые пряди.

Почти в каждом современном косметическом препарате, предназначенном для ухода за волосами, кератин является одним из основных ингредиентов. Средства для очищения, восстановления, укладки прядей непременно содержат этот натуральный элемент. После их использования шевелюра становится послушной, мягкой, приобретает блеск и шелковистость.

На сегодняшний день большой популярностью пользуется кератиновое выпрямление локонов. Впрочем, основное предназначение этой процедуры — это   восстановить травмированные локоны, в том числе поврежденные в результате химической обработки, обеспечить им полноценное питание и увлажнение.

Покрытие кератином действует от десяти недель до полугода. Такой срок действия обусловлен строением волоса и дальнейшим уходом за ними.

После того, как процедура выполнена, необходимо определенное время для полного проникновения кератина в строение каждой волосинки.  Для процесса нужно не меньше трёх дней. Помимо этого, прядки после обработки их химическими средствами очень чувствительны, поэтому в первые семьдесят два часа не следует:

• их мочить;
• применять косметические продукты и инструменты для укладки;
• делать прически;
• допускать трения локонов о любую поверхность;
• постараться не использовать расческу и аккуратно расправлять локоны пальцами рук.

По прошествии времени прядки разрешено причесывать, делать укладку, подвергать окрашиванию и так далее.

Можно ли выпрямлять волосы после кератинового выпрямления

Тем, кто желает поменять наскучивший стиль, например, избавиться от кудрей и стать обладательницей прямых прядей, тоже прибегают к этому способу. Однако, специалисты предупреждают, что не каждый желающий получит безупречно прямые пряди. Обладательницам природных кудрей, являющихся особенностью структуры волоса, потребуется дополнительно выпрямить их утюжком. Прибегнуть к нему можно лишь через 3-4 суток после проведения техники кератирования. Делать это надо с особой осторожностью.

Можно ли завивать волосы после кератинового выпрямлении

Это правило актуально и для завивки. Когда пройдет 3 суток после покрытия кератином, можно делать укладки с использованием любых инструментов: щипцов, фена, бигуди.

Можно ли красить волосы перед кератиновым выпрямлением

Профессионалы советуют применять окрашивание волос до кератирования как минимум за семь дней. Так полученный цвет будет сохраняться более длительное время. Брюнетки и блондинки должны выбирать оттенок немного темнее, чем тот, которым они пользуются обычно. Разница может составлять тон или полтона. Все дело в том, что под воздействием выпрямления с помощью кератина, шевелюра становится немного светлее.

Это правило не коснётся тех, кому нужно окрасить только корни. Кератиновый состав не должен касаться кожи головы. Он наносится, отступив от начала роста волос, примерно на четыре сантиметра.

Когда можно красить волосы после кератинового выпрямления

Окрашивание волос после кератинового выпрямления нужно проводить через месяц, поскольку в иной ситуации можно повредить прядки и утратить полученный от кератизации результат. Процедуры выполняют с использованием бессульфатных косметических средств.

Процедура нанесения кератина безвредная, но от нее должны отказаться женщины

готовящиеся к родам, и кормящие мамы. Если имеются такие заболевания как себорея, астма, псориаз или склонность к аллергическим реакциям, кератиновое покрытие наносить нельзя.

Покраска волос до кератина. Принцип действия кератинового состава

Кератиновый состав нередко используют в домашних условиях, однако такой подход к уходу за волосами является неверным и не позволяет оценить все преимущества воздействия кератина

Кератины относятся к семейству фибриллярных белков, которые обладают высокими показателями прочности, уступая лишь хитину. Помимо большого содержания меж- и внутримолекулярных водородных связей, в кератине находятся  дисульфидные связи, образующиеся с участием аминокислоты — цистеина.

Благодаря цистеину наши волосы обретают упругость и силу. Специалисты сходятся на мнении, что кератин — это биополимер, отвечающий за «строительство» ногтей и волос. Будучи жидкой формой волос, он встраивается в структуру и возвращает здоровье поврежденным обесцвечиваниями, окрашиваниями, химическими завивками локонам.

В процессе кератинового выпрямления или, как часто его называют, восстановления кератин запечатывается в структуре волоса высокими температурами, поэтому чешуйки стержня плотно прилегают друг другу, а локоны обретают гладкость.

Инструкция к кератиновому выпрямлению предполагает использование высоких температур, что позволяет запечатать внутри волосяного стержня не только белок, но и пигмент

Из вышесказанного несложно сделать вывод, что окрашивание и кератиновое выпрямление действуют на волосы кардинально противоположным способом. Для окрашивания требуется поднятие волосяных чешуек, для получения блеска, который обещает кератиновое восстановление – их надежное прилегание к стержню.

Видео совмещение кератинового выпрямления волос с окрашиванием

SPA-уход, окрашивание, ботокс или кератиновое выпрямление волос, стрижка и легкая укладка в эксперт-студии «Луч Света»

---

Услуги в эксперт-студии «Луч Света»:

SPA-уход, стрижка, укладка:

— Cтрижка (модельную или контурную) и легкая укладка от топ-стилиста. Купон за 260р. и доплата на месте 400р. вместо 1300р.

— SPA-уход для интенсивного восстановления поврежденных и ослабленных волос от Estel, стрижка и легкая укладка от топ-стилиста. Купон за 410р. и доплата на месте 625р. вместо 2050р.

Luxe-окрашивание волос, SPA-уход, стрижка, укладка:

— luxe-окрашивание волос (в один тон или прикорневое окрашивание), стрижка  и легкая укладка от топ-стилиста. Купон за 530р. и доплата на месте 805р. вместо 4150р.

— SPA-уход для интенсивного восстановления поврежденных и ослабленных волос от Estel, luxe-окрашивание волос (в один тон или прикорневое окрашивание), стрижка и легкая укладка от топ-стилиста. Купон за 630р. и доплата на месте 950р. вместо 4900р.

— Сложное luxe-окрашивание волос (колорирование, балаяж, шатуш, амбре или калифорнийское мелирование), стрижка и легкая укладка от топ-стилиста. Купон за 630р. и доплата на месте 955р. вместо 6300р.

— SPA-уход для интенсивного восстановления поврежденных и ослабленных волос от Estel, сложное luxe-окрашивание волос (колорирование, балаяж, шатуш, амбре или калифорнийское мелирование), стрижка и легкая укладка от топ-стилиста. Купон за 735р. и доплата на месте 1110р. вместо 7050р.

Ботокс, биксипластия, кератиновое выпрямление и восстановление волос:

— Premium-ботокс для волос или premium-биксипластию для легкого выпрямления и реконструкции волос от Homna Tokyo (Бразилия), стрижка и легкая укладка от топ-стилиста. Купон за 715р. и доплата на месте 1080р. вместо 5100р.

— Premium-кератиновое выпрямление и восстановление волос от Homna Tokyo (Бразилия), стрижка и легкая укладка от топ-стилиста. Купон за 850р. и доплата на месте 1290р. вместо 7100р.

Окрашивание производится косметическими средствами марок Londa, Ollin и Estel.

Купон не распространяется на другие спецпредложения студии.

Дополнительно оплачивается на месте:

— окрашивание волос длиной более 40 см — 250р. за каждые дополнительные 10 см длины волос;

— SPA-уход для волос длиной более 40 см — 300р. за каждые дополнительные 10 см длины волос;

— premium-процедуры для волос длиной более 40 см — 500р. за каждые дополнительные 10 см длины волос;

— если необходимо усиленное тонирование, то оно оплачивается отдельно по прайсу;

— возможна доплата за густоту волос и дополнительные услуги, не входящие в стоимость купона (итоговая стоимость обсуждается с мастером индивидуально до оказания услуг).

Если участник акции не предупреждает об отмене своего визита за 24 часа до времени записи, купон считается использованным.

Купон действует на одного человека.

Вы можете приобрести неограниченное количество купонов для себя и в подарок.

Предварительная запись по телефону +7(985)159-01-08 с оповещением о наличии купона.

Обязательно предъявляйте распечатанный купон при посещении.      

Имеются противопоказания! Необходимо проконсультироваться с врачом-специалистом! 18+

Купон не суммируется с другими действующими акциями и предложениями компании.

Купон действует до 01.12.2021г.

---

                                    

Окрашивание волос после кератинового выпрямления

Кератинизация (или бразильское разглаживание) – довольно модная услуга. После ее проведения и соблюдения технологии на длительный период можно позабыть об обжигающих локоны утюжках и порадоваться глянцу, шелковистости. Но тем, кто сменил природный цвет прически, будет интересно, когда и чем можно проводить окрашивание волос после кератинового выпрямления, чтобы результат был длительным.

Кератирование и окрашивающие средства

Разглаженные пряди приносят эстетическое удовлетворение после выпрямления. Изначально цель процедуры заключалась в восстановлении травмированных чешуек, и именно это заставляло многих отправляться к мастеру. Ведь действительно здоровыми волосами сегодня может похвастаться далеко не каждая женщина. Под негативным действием из-за плохой экологической ситуации и несоблюдения здорового питания структура волоса страдает. Фолликулы не получают полезных веществ в требуемом количестве, и часть из них «отмирает». Это приводит к облысению, а оставшиеся пряди утрачивают блеск и истончаются.

Неблагоприятную лепту в волосяную структуру вносит термическая укладка и окраска стойкими красителями. Защищающий кератиновый слой становится рыхлым, нет плотного прилегания чешуек, остаются многочисленные ненаполненные ничем пустоты. Все это отрицательно влияет на состояние и здоровье. В период кератинизации пряди обрабатываются уникальным препаратом, в составе которого жидкий белок-кератин, заполняющий собой сформировавшиеся пустоты.

Чтобы результат был более долговечным, кератиновые элементы закрепляются в чешуйчатой структурной части волосяного стержня при нагревании утюжком. Это положительно влияет на густоту, но, к сожалению, снижает уровень гибкости. Краски при кератинизации влияют на результат.

Через сколько дней можно красить волосы после кератинового выпрямления, и какой краской, подскажет мастер на процедуре разглаживания. Процесс окраски стойкими красителями практически полностью противоположен кератированию. Для того чтобы краситель смог попасть внутрь и задержаться там, слой волосяных чешуйчатых частиц приходится рыхлить. Для этого используется аммиак и его производные (в наиболее безвредных составах). Они сушат и разрушают структуру.

Тонировка – процесс абсолютно иной. Краситель в такой ситуации остается сверху волоса, не попадая внутрь. Поэтому он и быстро смывается. Тонировка радикально поменять основной цвет не может. Но и вред в такой ситуации незначителен – разве что небольшая пересушка при частом применении тонирующих препаратов.

С тониками все понятно, актуальным остается вопрос, можно ли делать кератиновое выпрямление волос сразу после окрашивания или осветления волос, ведь остаться без красивых прядей никому не хочется.

Вредит ли окраска?

Разглаживание кератином и окрашивание волос для блондинок, это противоположные методики. Красящие препараты содержат агрессивные вещества. Последствия окраски головы следующие:

• структура утрачивает целостное состояние;
• начинается облысение;
• идет пересушка прядей;
• возможно развитие аллергии;
• развивается перхоть.

Многие не обходятся без окраски, особенно те, которым необходимо замаскировать седину. Осветление волос после кератинового выпрямления и покраска не запрещены. Красить разрешается, но не сразу.

В парикмахерской важно обязательно сказать о том, когда делалась кератинизация. Специалист расскажет, через какое время после кератина можно красить волосы, сколько подождать, чтобы не навредить.

До процедуры лкрашивания должно пройти 14-21 день, а лучше 30 суток после кератирования. Это даст возможность избежать неприятностей окраски «насильно» разглаженных прядей. Если соблюдать время, то результат поразит качеством. Краситель не опасен. При этом на выпрямленных локонах свежий цвет будет смотреться наиболее эффектно.

После кератинового выпрямления, когда можно краситься в белый? Осветлять рекомендуется только через 30 суток после кератинизации.

Влияет ли кератин на результат покраски?

Уровень кератиновых веществ после окраски может значительно сократиться, если не выдержать время между процессами. Также пигментация будет неравномерной, так как не сможет краситель в полноценном количестве попасть в волосяную структуру. Голова будет смотреться ужасно. При этом почти полностью нейтрализуется эффект кератина. Денежные средства, отданные за разглаживание, а позже за покраску, будут потрачены зря.

Никакой самодеятельности быть не должно, только мастер точно определит состояние шевелюры, расскажет, когда можно делать кератин после окрашивания, можно ли делать мелирование или красить по другой технологии. Если сделать кератинизацию за 14 дней до окраски, то обновленный оттенок не утратит яркость достаточно долго. На то время, кератиновых веществ в стержнях будет ещё много, а чешуйки будут восприимчивыми, пряди заберут пигмент в необходимом объеме, а вещество хорошо закрепит его. Тому, кто не знает, сначала окрашивание или кератиновое выпрямление, специалисты рекомендуют покрасить, а потом уже разглаживать.

Правила подготовки

Для того чтобы процесс был комфортным, а результат высококачественным, важно грамотно подготовиться. Эти меры одни и те же для каждого, не имеет значения, было ли ранее кератинирование. Правила соблюдаются однозначно, так как это скажется на результате, эстетичности. Рекомендации следующие:

1. Нельзя мыть голову за 2 дня до покраски. На кожных покровах будет присутствовать тончайший слой кожного сала. Он снизит агрессивное действие красителя на эпителий. Процедура пройдет без неприятных ощущений.
2. Необходимо очень хорошо расчесать пряди. Это даст возможность избавиться от загрязнений, которые зрительно не видно.
3.  За 7 дней до смены оттенка, правильно отказаться от бальзамов и прочей косметики. Они не дадут пигменту полноценно проникнуть в волос.
4. За трое суток до визита к мастеру нельзя пользоваться укладочной косметикой. Если это правило проигнорировать, пигмент проникнет неравномерно.
5. Если на кожных покровах ранки, раздражения – красить нельзя. Это спровоцирует неприятные ощущения, возможно воспаления.

Кроме того, подбирать необходимо наиболее щадящие красители. Можно применять красители безаммиачные или косметику на базе хны, басмы. Эти препараты при разглаживании зафиксируются на волосах надолго.

На форумах можно прочесть отзыв про кератиновое выпрямление волос, а последствия на осветленных волосах многие там же указывают. Но лучше проконсультироваться с профессионалом, ведь многие факторы не всегда можно определить визуально перед зеркалом.

Как перед сменой цвета, так и перед процедурой бразильского выравнивания нельзя проводить термоукладку (выпрямление или завивку). Стоит соблюдать вышеперечисленные правила и стараться сильно не заплетать пряди. Самостоятельно красить голову чревато проблемами, поэтому верным решением будет посетить салон или вызвать профи на дом.

Профессиональные препараты для восстановления

Кератинизация не входит в перечень процедур, которые серьезно вредят локонам. Многие делают коррекцию регулярно, не желая расставаться с блеском и шиком прически. Но, иногда может случиться «перегрузка» прядей кератиновыми веществами, в результате которого они станут более жесткими и не такими гладкими, как раньше.

Для оздоровления шевелюры профессионалы рекомендуют применять средства со сниженным содержанием силиконовых элементов, повышенным процентом кератинов или пептидов шёлка. Выбрать конкретное средство поможет мастер, который проводил процедуру бразильского разглаживания. Когда и через сколько можно делать кератиновое выпрямление после окрашивания волос, также подскажет специалист.

Народные рецепты для оздоровления

Оздоровление после процедур требуется часто, особенно, если подобные манипуляции с волосами проводятся систематически. Устранить последствия кератинизации или некачественного сочетания окрашивания и выравнивания можно народными методами.

Хорошо помогает водный раствор соли. Радикальный, но эффективный метод, который вымывает не только кератиновые элементы, но и естественную защиту волоса. Помимо этого, под удар попадает и результат окраски. Локоны после такой смывки становятся жесткими, ломкими, поэтому необходимо делать маски по два раза подряд, применять эмульсии для увлажнения.

Кокосовое, репейное, шиповниковое, оливковое, миндальное масло отлично показали себя в устранении сухости прядей. Помимо этого, масла хорошо освобождают пряди от искусственных кератиновых веществ. Спустя 30 дней после начала применения средства, начнется оздоровление. Чтобы не испортить прическу, важно точно выяснить, можно ли красить волосы после кератинового выпрямления волос, а отзывы изучать аккуратно. Главное условие — делать процедуры у профи с хорошей репутацией.

Нанопластика, кератиновое выпрямление и ботокс для волос

Роскошные, ухоженные волосы, вслед которым оглядываются не только мужчины, но и женщины — пожалуй, об этом мечтает любая девушка. К счастью, даже если от природы волосы выглядят не так, как хотелось бы, благодаря нашим новинкам желаемое можно с лёгкостью превратить в действительность. Одни из самых популярных процедур для волос в Саратове в последнее время это: ботокс, кератиновое выпрямление и нанопластика.

Нанопластика – это оздоравливающая уходовая процедура для волос, в основе которой лежит заполнение структуры волос кератином. Придает гладкость и блеск волос.

Нанопластика — аналог кератинового выпрямления, только с более безопасным, а зачастую и полностью натуральным составом. Главное действующее вещество — аминокислоты, которые встраиваются в структуру волоса и заполняют ее. Масла, экстракты, пантенол и протеин дарят волосам еще больше восстановления и питания.

Нанопластика укрощает кудрявые, спутанные, непослушные пряди. Особенно выручит обладательниц коротких стрижек каре или боб, сократив время укладки вдвое.
Принципиальное отличие от кератинового выпрямления заключается в том, что нанопластику рекомендуют делать на относительно здоровые, не слишком травмированные волосы. Не подходит для блондинок.

Как проходит процедура: на вымытые волосы наносят состав и выдерживают 30–60 минут. Смывают теплой водой, сушат волосы феном, вытягивают утюжком. Под воздействием горячей температуры ингредиенты препарата буквально запаиваются в глубину волос. Затем состав полностью смывают шампунем, наносят маску и сушат феном. В среднем процедура занимает от двух до трех часов. Стоит учесть, что из-за воздействия аминокислот цвет волос может осветлиться на один-три тона, поэтому окрашивание лучше делать через неделю после процедуры.
Эффект: волосы становятся прямыми, упругими, блестящими и ухоженными. Пряди не путаются, легко расчесываются и поддаются укладке. Кроме того, они надежно защищены от сечения и ломкости, термических и физических воздействий. Результат держится до полугода при правильном домашнем уходе.

Кератиновое выпрямление и восстановление волос – это специальная процедура для выпрямления и разглаживания волос. Эффект от неё – это прямые гладкие волосы, даже если до этого они отличались излишней пушистостью или завивались.

Кератин — это разновидность белка, который является строительным элементом волос. С его помощью можно восстановить поврежденные пряди и заодно сделать их гладкими. Под действием высокой температуры кератин заполняет микротрещины на волосах и служит своеобразным каркасом, который держит их в прямом состоянии. Подходит обладательницам непослушных, пористых волос и спасает после неудачной химической завивки.

Как проходит процедура: на вымытые волосы наносят состав, не затрагивая корни, и сушат феном. Затем каждую прядь расчесывают и тщательно выпрямляют утюжком.

Эффект: кератин разглаживает даже африканские кудряшки. Волосы становятся блестящими, тяжелыми и прочными. Посеченные концы буквально запаиваются. Волосы легко укладываются, не пушатся, а прическа сохраняет форму даже в непогоду. Результат держится до полугода, если использовать поддерживающий домашний уход.

Ботокс волос – это процедура для восстановления и улучшения качества волос. Благодаря ей волосы становятся более здоровыми и менее пористыми, также уходит пушистость.

В качестве главного ингредиента выступает молекула интра-силан: при взаимодействии с водой она проникает вглубь волосяного стержня и заполняет собой мельчайшие повреждения. Также в состав ботокса для волос входят витамины, гиалуроновая кислота, кератин, аминокислоты, натуральные масла и экстракты.

Препарат наносят не только на пряди, но и на кожу головы, чтобы укрепить корни волос. Процедура полезна при выпадении волос и особенно рекомендуется окрашенным в блонд, так как полностью нейтрализует желтизну.

Эффект: волосы сразу выглядят здоровыми, шелковистыми и блестящими, без секущихся концов и пушистости. Легко расчесываются, держат форму и объем даже без укладки. С каждой повторной процедурой длительность эффекта возрастает.

После салонной процедуры нельзя использовать глубоко очищающие шампуни. Используйте для мытья бессульфатные средства или те, что посоветует мастер.

Сильно поврежденные кончики волос лучше предварительно срезать. Тогда салонная процедура хорошо запаяет свежий срез, и волосы надолго останутся здоровыми.

Окрашивание лучше сделать заранее и выбрать цвет ярче, чем обычно, так как пигмент под утюжком может выцвести. После процедуры желательно красить волосы не раньше чем через две недели.

Если вы все еще ищите где сделать кератиновое выпрямление волос в Саратове, нанопластику или где сделать Ботокс волос в Саратове. Обращайтесь в салон красоты «Дива»
Ждём Вас на Чапаева, 56Е

Ежедневно с 8:00 до 22:00

границ | Интенсивность окрашивания панцитокератином и фрактальный вычислительный анализ паттернов злокачественного роста опухоли молочной железы прогнозируют возникновение отдаленных метастазов

Введение

Первичная опухоль молочной железы не опасна для жизни, пока болезнь не перейдет в системное состояние из-за отдаленной тканевой инвазии. Такие отдаленные рецидивы или метастазы имеют общую частоту до 50% в течение 20 лет после операции (1). Таким образом, помимо местного хирургического вмешательства и лучевой терапии пациенты также получают системную цитотоксическую терапию с целью устранения любого отдаленного микрометастатического злокачественного распространения.В совокупности цель достижения персонализированных терапевтических протоколов, основанных на надежно прогнозируемом индивидуальном риске, является основной клинической применимостью улучшения прогноза риска метастазов. Польза для пациента заключается в максимальном терапевтическом ответе и минимизации токсичности.

Текущий прогноз рака груди основан на клинико-патологической оценке (классификация TNM, гистологические особенности, возраст, менопауза), статусе рецепторов (рецепторы гормонов и HER2) (2) и молекулярных сигнатурах, таких как Mammaprint и OncotypeDX (3).К сожалению, упомянутые текущие прогностические классификации, включая дорогостоящие инструменты молекулярной подписи, все еще недостаточно надежны с точностью 65% и AUC 0,69 (4). По этой причине компьютерный гистоморфологический анализ опухолей развивается как еще один подход, направленный на улучшение прогнозов при раке молочной железы (5–8). Эта методология использует информацию из гистопатологических изображений, которая не может быть определена количественно с помощью обычного микроскопического исследования, такая как распределение, текстура и форма.Кроме того, к основным преимуществам этого подхода относятся его высокая скорость, экономичность и удобство, основанные на широкой доступности гистопатологических образцов в цифровой форме. Алгоритмы, используемые для анализа медицинских изображений, включают статистические (совпадение), геометрические / структурные (мозаика Вороного, фрактал), основанные на модели (марковские случайные поля) и спектральную / сигнальную обработку (фильтры Габора, вейвлет-преобразование и кривые).

Гистоморфологическое разнообразие опухолей используется в прогностических целях с середины девятнадцатого века (9).Позже было подтверждено, что первичная опухоль действительно является местом распространения метастатических клеток, что еще раз подтвердило ее важность как источника прогностической информации (10). Таким образом, данное исследование сосредоточено в первую очередь на анализе моделей роста злокачественных клеток первичных опухолей молочной железы. Такие структуры можно наблюдать на срезах опухолей, окрашенных гематоксилином и эозином (H&E), но их легче исследовать при иммуноокрашивании панцитокератином, поскольку опухоли молочной железы в основном возникают в результате неопластической трансформации эпителиальных клеток.Антитело к панцитокератину в основном использовалось в прогностических исследованиях циркулирующих и диссеминированных эпителиальных опухолевых клеток, особенно при оценке биопсии дозорных лимфатических узлов при раке молочной железы (11). Другие подходы включали прогностические исследования иммуноокрашивания опухолей с помощью панелей цитокератина (12) или отдельных кератинов (13).

Эпителиальные клетки опухолей молочной железы, иммуноокрашенные на панцитокератины, ранее были прогностически оценены с использованием GLCM и бинарных монофрактальных алгоритмов (14–16).Это исследование расширяет предыдущие отчеты, проводя гораздо более широкое исследование с использованием монофрактального, мультифрактального и анализа интенсивности бинарных и полутоновых изображений скоплений злокачественных клеток, окрашенных панцитокератином. Фрактальная геометрия хорошо подходит для количественной оценки распределения, формы, текстуры и сложности хаотического роста злокачественных клеток (17).

В совокупности мы решили провести первую оценку интенсивности иммуноокрашивания злокачественных эпителиальных клеток в сочетании с их исчерпывающим распределением, формой, текстурой и оценкой сложности.

Материалы и методы

Этот отчет был написан с целью включения всех соответствующих экспериментальных деталей в соответствии с рекомендациями по прогностическим исследованиям онкомаркеров (18).

Заявление об одобрении этических норм

Исследование было одобрено Наблюдательным советом учреждения (Белградский университет, Школа медицины, разрешение № 29 / VI-4) и соответствует Этическому кодексу Всемирной медицинской ассоциации (Хельсинкская декларация), опубликованному в British Medical Journal. (18 июля 1964 г.) и его седьмая редакция в 2013 г.

Группа пациентов

Отбор пациентов с раком молочной железы был ретроспективным на основании отсутствия гормональных, цитотоксических или других системных методов лечения (естественное течение болезни) в соответствии с рекомендациями, действующими в 1993 году для первичной операбельной карциномы молочной железы с pT1 / 2, степень 1 / 2, без поражения лимфатических узлов или метастазов (N0M0). Все пациенты получали местное хирургическое и лучевое лечение. Данные пациентов были получены в обезличенной форме без прямых или косвенных идентификаторов, которые могли бы позволить повторную идентификацию (методология Safe-Harbor Закона о переносимости и подотчетности медицинского страхования 2012 г.).Все пациенты были женщинами европеоидной расы из Республики Сербия, леченными в одном и том же году (1993 г.) и в одном учреждении (Институт онкологии и радиологии Сербии). Исходя из соответствующих пороговых значений 10 фмоль / мг и 20 фмоль / мг, 76% пациентов были положительными на рецептор эстрогена (ER, медиана 32 фмоль / мл) и 24% были положительны на рецептор прогестерона со средним значением 6 фмоль / мл. Метод с использованием древесного угля, покрытого декстраном, был использован для анализа рецепторов эстрогена и прогестерона, как подробно описано ранее (19).Статус HER2 был доступен у 52 из 73 пациентов, участвовавших в этом исследовании, и был положительным у 21% пациентов. Предполагаемый размер выборки был рассчитан с учетом частоты событий, среднего стандартного отклонения между группами высокого и низкого риска и размера эффекта (отношения рисков). Эти параметры были оценены путем пилотного исследования 35 образцов перед полным экспериментом. Для целевой мощности 0,8 расстояние между средними значениями характеристик для групп высокого и низкого риска составляет 0,52 стандартных отклонения, минимальная величина эффекта 0.14> ЧСС> 7,0, альфа 0,05 и частота событий 25%, необходимое количество составляло 31 пациент с 10 событиями (пакет Stata / MP 13, StataCorp, College Station, TX). Окончательный размер выборки составил 73 пациента с 17 событиями. Размер выборки отражает редкость систематически нелеченных пациентов с раком молочной железы и строгое недопущение пропуска данных. Фактическая частота событий составила 23%, среднее стандартное отклонение переменных текстуры — 0,54, а средний размер эффекта — 25,4. Анализ мощности post-hoc показал фактическую мощность 1.0. Средний возраст на момент постановки диагноза составлял 57 лет (диапазон 41–80). Среднее время наблюдения за метастазами составляло 38 месяцев, в диапазоне от 16 до 145 месяцев, в то время как среднее время наблюдения за пациентами без метастазов составляло 147 месяцев по обратному методу Каплана-Мейера, в диапазоне от 77 до 165 месяцев. Адъювант! Онлайн-счет (группа адъювантов, Inc., Нью-Джерси, США) для рака груди (версия 8.0) был рассчитан в адъюванте! Интернет-сайт о 10-летнем риске рецидива без дополнительной терапии в зависимости от возраста, степени опухоли, статуса рецепторов эстрогена и размера опухоли (20).

Рабочий процесс анализа изображений

Методологический процесс включал иммуноокрашивание, выбор срезов тканей, получение изображений, разложение пятен, анализ изображений, категоризацию данных и прогностическую оценку с подтверждением. Эти шаги соответственно описаны в подзаголовках ниже.

Иммуноокрашивание

Ткань инвазивных первичных опухолей молочной железы была получена во время операции. Ткань фиксировали формалином, заливали парафином и разрезали для получения целых срезов 4 мкм, которые прикрепляли к чистым предметным стеклам.Свежесрезанные цельные срезы ткани иммуноокрашивали без контрастного окрашивания, чтобы выделить только эпителиальные клетки. Стадия опосредованного нагреванием антигена была проведена в буфере EDTA pH 8 с водяной баней, установленной на 95 ° C в течение 40 минут. Эндогенную пероксидазу гасили 3% H ₂ O ₂ в метаноле в течение 30 мин. Пятипроцентная козья сыворотка использовалась на этапе предварительной инкубации в течение 1 часа. Срезы целых тканей инкубировали с кроличьим моноклональным первичным антителом CD8 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA; # RM-9116-S1), а затем с моноклональными мышиными клонами первичного антитела против панцитокератина человека mAE1 / AE3 (Dako, Glostrup , Дания, № M3515) в 5% козьей сыворотке в течение 60 мин.Срезы промывали PBS и инкубировали со вторичным конъюгатом козьих антител против кроличьих IgG и HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA; # 111-035-144), а затем с поликлональным конъюгатом козьих антител против IgG мыши и щелочной фосфатазы (Southern Biotech, Бирмингем, США). AL; # 1030-04) в 5% козьей сыворотке. После промывок в PBS в качестве хромогенов использовали DAB с повышенным содержанием никеля (Vector Laboratories, Burlingame, CA), а затем Fast Blue RR (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури). Комбинация антител AE1 / AE3 в основном окрашивает эпителиальные клетки путем обнаружения цитокератинов 1-8, 10, 14-16 и 19.

Выбор срезов тканей

Для максимальной воспроизводимости и достоверности патолог (KK) отобрал срезы, содержащие наиболее характерные образцы роста для каждой отдельной опухоли, с самым высоким содержанием злокачественных клеток, окрашенных панцитокератином, и без каких-либо артефактов или нормальных структур. Нормальные и злокачественные клеточные структуры, окрашенные панцитокератином, были идентифицированы морфологически.

Получение изображения

Цветные изображения иммуноокрашенных гистопатологических слайдов опухоли были получены с использованием цифрового сканера слайдов высокого разрешения NanoZoomer Hamamatsu-XRC12000 (город Хамамацу, Япония).

Разложение пятен

В связи с тем, что срезы тканей были дважды окрашены на панцитокератин (синий) и CD8 (коричневый), было необходимо разложить изображения на одноокрашенные каналы, каждый из которых содержит только один химический краситель, как подробно описано ранее (21) . В частности, алгоритм разложения красителей разделяет изображения иммуноокрашивания на каналы CD8 и панцитокератиновые каналы. Весь последующий анализ изображений в этом исследовании проводился в полученных панцитокератиновых каналах.

Анализ изображений

Цветные изображения были преобразованы в формат оттенков серого с помощью команды run («8-bit») программы Fiji / ImageJ версии 1.52b, открытой платформы для анализа биомедицинских изображений (22). Далее изображения были преобразованы в двоичный формат с помощью команды run («Сделать двоичный») Fiji / ImageJ. Полученные полутоновые и бинарные форматы изображений анализировали на интенсивность окрашивания. Кроме того, были применены монофрактальные и мультифрактальные алгоритмы для извлечения числовых показателей (признаков) для каждого изображения на основе анализа информации о пикселях.

Характеристики интенсивности окрашивания легко вычислить. Средняя интенсивность пикселей — это среднее значение яркости пикселей в градациях серого в диапазоне от 0 до 255 для 8-битных изображений, вычисленное функцией ImageJ « measure ». Общая площадь , иммуноокрашивания была рассчитана с использованием автоматически определяемых пороговых значений бинарных изображений и функции ImageJ « анализировать частицы ».

Вычисление и интерпретация фрактальных характеристик более сложны.Фрактальная размерность — основная характеристика монофрактала. В первую очередь это показатель сложности, но в зависимости от типа анализа он также может быть чувствительным к форме, текстуре и распределению объекта. В фрактальном анализе сложность относится к изменению деталей (пикселей переднего плана) с изменением масштаба (увеличения). Теорию мультифракталов можно рассматривать как расширение монофрактального подхода, особенно если изображение содержит неравномерное распределение сложности с фрактальной размерностью, изменяющейся по изображению (23).Мультифрактальный анализ предоставляет спектры фрактальных измерений, таких как D _Q относительно α и f ( α ) против Q , таким образом предоставляя больше информации об изображении по сравнению с одним монофрактальным измерением. .

Монофрактальный и мультифрактальный анализ бинарных изображений проводился с использованием обычного метода подсчета неперекрывающихся боксов (версия плагина FracLac 2015Sep0^a9330 для Fiji / ImageJ ) по формулам, подробно описанным ранее (24).Метод подсчета ящиков включает наложение двоичного изображения с ячеистой решеткой квадратных ящиков с уменьшающимся размером (масштабом) ε, выраженным как размер ящика относительно размера изображения. Свойства заполнения пространства изображения путем подсчета ящиков вычисляются с учетом взаимосвязи между количеством ящиков, содержащих по меньшей мере один прямой пиксель (непустые ячейки), и размерами ящиков.

Монофрактальный и мультифрактальный анализ изображений в градациях серого был выполнен с использованием метода подсчета прямоугольников, скорректированного для изображений в градациях серого (дифференциальный подсчет прямоугольников, плагин FracLac для ImageJ).В то время как обычный подсчет прямоугольников для двоичных изображений учитывает только наличие или отсутствие пикселей переднего плана внутри прямоугольника, дифференциальный подсчет прямоугольников для изображений в градациях серого вычисляет разницу в интенсивности пикселей в прямоугольнике для каждого размера (ε), как подробно объяснялось ранее ( 24).

Монофрактальные характеристики, рассчитанные для двоичных изображений и изображений в градациях серого, включали FD, FD , _{, контур} и Λ. Мультифрактальные характеристики, предоставленные программным обеспечением FracLac: α, f ( α ) и D _Q , для диапазона 200 Q значений от −10 до +10 в 0.1 шаг. С помощью формул Excel были рассчитаны десять дополнительных мультифрактальных характеристик: D _Qmax , f ( α ) _min , f ( α ) _max , α соответствует f ( α ) _мин. , α соответствует f ( α ) _макс. , наклон D _Q (Q), наклон α (Q), наклон f ( α ) (Q), наклон DQ (Q) ( — от 1 до 3), f ( α ) суммированы для Q > 0 .Вместе взятые, были рассчитаны 3 монофрактальных и 13 мультифрактальных характеристик, каждая для полутоновых и бинарных изображений, всего 32 фрактальных характеристики.

Категоризация данных и прогнозная оценка

Регрессионный анализ ROC и Кокса использовался в качестве инструментов прогностической оценки клинико-патологических, интенсивных и фрактальных характеристик. Дискриминация — это способность прогностических классификаторов стратифицировать пациентов с метастазами и без них. Площадь под кривой скорости изменения (AUC) использовалась в качестве количественной меры эффективности распознавания, рассчитанной с использованием непрерывных значений признаков.Точность вероятности AUC определена на уровне 0,5, а абсолютная точность равна 0,0 или 1,0. Эффективность дискриминации увеличивается от 0,5, при этом 0,4 или 0,6 считаются удовлетворительными характеристиками дискриминации, 0,3 или 0,7 — хорошими, 0,2 или 0,8 — отличными и 0,1 или 0,9 — почти идеальными.

Категоризация данных с использованием точки отсечения разделяла пациентов на подгруппы с низким и высоким риском и была необходима для регрессионного теста пропорциональных рисков Кокса. Оптимальный выбор точки отсечки был выполнен X-tile 3.6.1 Программное обеспечение (Йельский университет, Нью-Хейвен, Коннектикут). Поскольку этап категоризации данных может внести систематическую ошибку, ROC-анализ и регрессия Кокса часто расходятся во мнениях в их прогностической оценке. Регрессионный тест пропорциональных рисков Кокса сравнивает прогнозируемые и фактические результаты метастазирования. Предположение о пропорциональной опасности было выполнено для каждой характеристики на основе остатков Шенфельда с помощью phtest (пакет Stata / MP 13, StataCorp, College Station, TX). Отношение рисков (HR) — это величина эффекта регрессии Кокса, отражающая частоту метастазирования в группах высокого и низкого риска пациентов.Это указывает на случайную производительность при ЧСС = 1.0. Многофакторный регрессионный анализ пропорциональных рисков Кокса проверял независимость каждого прогностического фактора. Переменные, классифицированные по исходу, были добавлены к полной модели с использованием критерия входа прямого выбора P <0,20 в одномерном анализе и удалены с использованием обратного исключения в соответствии с критерием оставления отбора P <0,05. IBM SPSS Statistics 23 (IBM Corp. Armonk, NY) использовался для анализа Кокса с поправкой на загрузку.Коэффициенты корреляции Спирмена рассчитывались с помощью программы Statistica 12 (Tibco Software Inc., Паоло Альто, Калифорния).

Анализ выживаемости по Каплану-Мейеру за период от постановки диагноза до проявления метастазов (IBM SPSS). Тест ранговой корреляции Спирмена использовался для оценки силы ассоциации между парами переменных (Statistica 12).

Проверка

Чрезмерный оптимизм анализа ROC (Stata / MP 13) и Cox (IBM SPSS) был исправлен внутренней проверкой начальной загрузки с 1000 повторными выборками данных (25).

Результаты

Это исследование обеспечивает прогностическое сравнение интенсивности простого иммуноокрашивания с более сложным фрактальным анализом, оценивающим распределение окрашивания, формы, сложность и текстуру. Для анализа кластеров злокачественных клеток опухоли молочной железы, иммуноокрашенных панцитокератином, использовали форматы изображений в градациях серого и двоичные изображения.

Расчеты интенсивности окрашивания, фрактальных и мультифрактальных характеристик описаны в разделе «Методы». ROC-анализ и одномерный регрессионный тест пропорциональных рисков Кокса были статистическими тестами, используемыми для прогностической оценки рассчитанных характеристик (таблица 1).Кроме того, прогностическая эффективность была проиллюстрирована графиками Каплана-Мейера (Рисунок 1) и охарактеризована многомерным анализом (Таблица 2). Корреляции рассчитанных признаков представлены в таблице 3. Примеры проанализированных бинарных изображений представлены на рисунке 2.

Таблица 1 . Прогностическое значение клинико-патологических, интенсивности окрашивания, монофрактальных и мультифрактальных характеристик.

Рисунок 1 . Анализ Каплана-Мейера наиболее эффективных характеристик из каждой группы: (A) клинико-патологические (размер опухоли, pT ), (B) интенсивность иммуноокрашивания ( средняя интенсивность пикселей), (C) фрактальная ( ^бин FD ).Графики показывают прогностическую эффективность различения значений признаков, классифицированных по указанным значениям точки отсечения. Пунктирными линиями показана подгруппа пациентов с более низкими значениями характеристик (ниже точки отсечения, характеристика ^{, низкая} ). Подгруппа значений признака ^high показана сплошными линиями. (а) Распределение пациентов по возрастающим непрерывным значениям каждой характеристики. Пациенты с метастазами обозначены черными плитками, а пациенты без метастазов — белыми. Таким образом, дорожка а иллюстрирует прогностическую эффективность каждой функции для разделения пациентов (а) на группы высокого и низкого риска по их непрерывным значениям, в то время как графики Каплана-Мейера показывают прогностическую эффективность после категоризации значений характеристик.(b) Для сравнения показана идеальная стратификация фактического возникновения метастазов. Время относится к интервалу от операции по первичной опухоли молочной железы до появления первых отдаленных метастазов или окончания наблюдения. P -значения были рассчитаны с помощью регрессии пропорциональных рисков Кокса.

Таблица 2 . Многомерный регрессионный анализ пропорциональных рисков Кокса.

Таблица 3 . Корреляции между прогностически значимыми клинико-патологическими, интенсивными и фрактальными признаками.

Рисунок 2 . Примеры проанализированных бинарных гистологических изображений. (A – H) Пациенты группы высокого риска с наиболее быстрым появлением метастазов. (I – P) Пациенты с наименьшим риском, без метастазов и с самым длительным периодом наблюдения. Время до метастазирования (A – H) или конец периода наблюдения (I – P) , средняя интенсивность пикселей ( среднее значение ) и фрактальная размерность Значения ( ^{интервал} FD ) равны указано для каждого изображения.Важно отметить, что более низкие значения интенсивности пикселей фактически указывают на более темные уровни серого. Кроме того, указанные средние значения интенсивности пикселей относятся к изображениям уровня серого, а не к представленным двоичным изображениям. Все проанализированные изображения представляют области опухолевой ткани, которые преимущественно населены злокачественными клетками. Увеличение × 400. Размер пикселя: 145 нм. Пруток 50 мкм, обозначен на (A) .

Согласно критериям анализа ROC, ^bin FD обеспечил наилучшие общие прогностические характеристики с AUC, равным 0.29, за которым следует Средняя интенсивность пикселей и ^бинов FD _контур (Таблица 1). Другими прогностически значимыми характеристиками по этому критерию были адъювант! Онлайн-оценка, размер опухоли и общая площадь . Только те особенности, которые показали прогностическую значимость по критериям регрессии ROC или Кокса, представлены в таблице 1, в то время как 32 рассчитанные фрактальные характеристики перечислены в разделе Методы .Поразительно, что ни одна из фрактальных характеристик, полученных на изображениях в градациях серого, не могла обеспечить значительных прогностических характеристик.

Прогностические оценки эффективности регрессионных статистических тестов ROC и Кокса часто расходились. Например, несколько характеристик, которые не были прогностически значимыми по критериям анализа ROC, оказались значимыми с помощью регрессии пропорциональных рисков Кокса (таблица 1). Это можно отнести к более строгой прогностической оценке с помощью ROC-анализа.Кроме того, категоризация данных на основе результатов для анализа с помощью регрессии Кокса часто вносит прогностическую ошибку (26). Также следует отметить, что регрессия Кокса учитывает время до события, а анализ ROC — нет.

Среди групп признаков наиболее отчетливые AUC были достигнуты с помощью бинарных монофрактальных (AUC в диапазоне от 0,29 до 0,31) и групп интенсивности иммуноокрашивания (0,35–0,70) (таблица 1). Наиболее выраженные прогностические HR и самые узкие доверительные интервалы (95% CI) были отмечены для бинарного монофрактала (HR в диапазоне от 0 до 0%).03 и 8.8) и бинарных мультифрактальных групп (0,02–24,1, табл. 1).

Значения

AUC и HR не только указывают на силу связи с исходом метастазирования, но и на его направление. Таким образом, AUC <0,5 или HR <1,0 указывают на связь с низким риском, тогда как AUC> 0,5 или HR> 1,0 указывают на связь с высоким риском возникновения метастазов. ^bin Λ и ^bin f ( α ) max , таким образом, связаны с высоким риском метастазирования (Таблица 1).Это просто означает, что пациенты с более высокими значениями признаков более склонны к метастазированию, чем пациенты с более низкими значениями. С другой стороны, средняя интенсивность пикселей , ^бин FD _контур , ^бин FD , ^бин α f ( α ) _макс , ^{интервал} наклон f α (Q) , ^{интервал} f ( α ) и ^{интервал} сумма Q > 0 , все связанные с низким риском метастазирования (таблица 1).

В группе из 55 пациентов с положительными рецепторами эстрогена (ER +), исходя из стандартной точки отсечения 10 фмоль / мг, прогностическая оценка была очень похожа для каждой характеристики (не показана) на ту, которая указана для всей группы пациентов в таблице 1. Этот результат указали, что прогностическая характеристика исследуемой интенсивности окрашивания и фрактальных характеристик не зависела от ЭР. Прогностическая оценка не могла быть выполнена в подгруппе ER-отрицательной группы из-за ее небольшого размера, составляющего 18 пациентов, что ниже расчетного минимального размера выборки в 31 пациент.

Многомерный анализ, представленный в таблице 2, был проведен с использованием всех характеристик, которые показали прогностическую значимость. ^bin FD , таким образом, возникла как наиболее важная с точки зрения прогноза переменная, основанная на ее коэффициенте, значении P , HR и самом узком CI 95% (Таблица 2).

Несколько прогностически значимых индивидуальных особенностей сильно коррелировали (Таблица 3). Наивысшие корреляции неожиданно наблюдались между общей иммуноокрашенной площадью как простой характеристикой, зависящей от количества черных пикселей и сложными фрактальными параметрами, такими как ^bin FD , ^bin f ( α ) Q > 0 и ^bin Λ (с коэффициентами Спирмена до 0.89; Таблица 3). Этот результат показал, что некоторые фрактальные особенности в значительной степени отражают простой подсчет черных пикселей в изображении. Среди групп признаков клинико-патологические параметры почти не коррелировали с другими группами, в то время как интенсивность иммуноокрашивания, монофрактальные и мультифрактальные группы признаков демонстрировали ряд ярко выраженных взаимных корреляций (таблица 3). Коэффициенты Спирмена для корреляции признаков между интенсивностью иммуноокрашивания и монофрактальными группами признаков находились в диапазоне от 0.От 43 до 0,80 и от 0,24 до 0,89 для интенсивности иммуноокрашивания и мультифрактальных групп (таблица 3). Высокие корреляции также наблюдались внутри групп признаков, например: размер опухоли и адъювант ! Онлайн-счет (0.90), ^bin FD и ^bin FD _контур (0,93), ^bin FD и ^bin Λ (−0,81) , ^{интервал} наклон f ( α ) (Q) и ^{интервал} f ( α ) Q > 0 (0.95, таблица 3). В целом, общая окрашенная область была признаком, который в основном коррелировал с другими признаками, так как его общая сумма значимых абсолютных значений коэффициента Спирмена составляла 5,5, за которым следовали ^{интервал} FD с суммой 5,37, ^{интервал} Λ (5,24) и средняя интенсивность пикселей (4,26).

Графики Каплана-Мейера

иллюстрируют эффективность распознавания наиболее эффективных признаков из каждой группы: pT для клинико-патологической группы (Рисунок 1A), Средняя интенсивность пикселей для группы интенсивности иммуноокрашивания (Рисунок 1B) и ^бин FD для фрактальной группы (рис. 1С).Эти графики иллюстрируют прогностическую эффективность по категоризованным значениям характеристик. Категоризация была выполнена с использованием точки отсечения для разделения измеренных значений непрерывных характеристик на подгруппы пациентов с высоким и низким риском. На рисунке 1 также показаны прогностические характеристики непрерывных значений до их категоризации (рисунок 1, полоса а). Черные плитки указывают на пациентов с метастазами, а белые плитки без метастазов. При сортировке в возрастающем порядке эти значения имеют тенденцию упорядочивать пациентов в соответствии с их зарегистрированным фактическим возникновением метастазов, причем черные плитки преобладают с одной стороны, а белые плитки — с противоположной (рис. 1, дорожка а).Идеальное разделение фактического риска метастазирования показано для сравнения на рисунке 1, дорожка b. Исследование Рисунка 1 показывает, что высокие значения ^bin FD определяют однородную группу низкого риска из 21 пациента, с полностью плоской верхней кривой низкого риска (Рисунок 1C) и полностью белой плиткой на диапазон высоких значений (рис. 1С, дорожка а). Это указывает на лучшую стратификацию пациентов с низким риском для ^бина FD и, в некоторой степени, также для функции средней интенсивности пикселей (рис. 1, полоса а).Пациенты из группы высокого риска четко стратифицируются на противоположном конце, но эта стратификация не приближается к однородности.

Примеры окрашенных панцитокератином срезов опухоли для пациентов с фактическими крайностями риска метастазирования представлены на рис. 2. Восемь пациентов с наиболее ранним (16–38 месяцев) возникновением метастазов считались группой наивысшего риска (рис. 2A – H). Пациенты с наименьшим риском включали пациентов, у которых не было метастазов даже в течение самых длительных периодов наблюдения (Рисунки 2I – P).Фрактальная размерность (или сложность) линии равна 1, а заполненного квадрата 2. Это означает, что значения фрактальной размерности для двумерного изображения должны находиться в диапазоне от 1 до 2. Фактический диапазон ^бинов FD. в исследуемой группе из 73 пациентов составили 1,54–1,87 (рис. 2). Средние значения интенсивности пикселей варьировались (рисунок 2) от 219,5 (самый темный) до 248,3 (самый светлый). Соответствующие средние значения для групп высокого и низкого риска составили 244,5 ± 3,1, 234,4 ± 9.1 для средней интенсивности и 1,640 ± 0,1, 1,722 ± 0,09 для ^бина FD . Важно отметить, что более низкие значения интенсивности пикселей фактически указывают на более темные уровни серого. Таким образом, представленные изображения показывают, что более темное иммуноокрашивание и более высокие значения ^bin FD указывают на более низкий риск метастазирования.

Обсуждение

Мы сообщаем о первой прогностической оценке иммуноокрашивания путем исчерпывающей оценки его интенсивности, распределения, формы и текстуры.Это исследование было направлено на улучшение прогноза течения рака груди.

Хотя прогностическая ценность распределения злокачественных клеток в опухолях молочной железы была установлена ​​ранее (14–16), это первое исследование интенсивности их иммуноокрашивания на панцитокератин. Мы обнаружили, что средняя интенсивность иммуноокрашивания значимо связана с низким риском. Интересно, что на основании этого результата можно сделать вывод, что опухоли с высоким риском метастатической диссеминации обычно имеют более низкую интенсивность окрашивания панцитокератина по сравнению с опухолями с низким риском.Такое снижение можно объяснить подавлением цитокератинов. Это исследование было разработано, чтобы компенсировать возможные вариации в экспрессии отдельных цитокератинов путем выбора препарата антитела AE1 / AE3 с широким диапазоном связывания с 13 цитокератинами. Наблюдаемая более низкая интенсивность окрашивания панцитокератина в опухолях высокого риска согласуется с предыдущим отчетом о полной потере такого окрашивания для злокачественных клеток, диссеминированных в лимфатические узлы, вероятно, связанных с дедифференцировкой клеток (27).Преимущество настоящего исследования заключалась в оценке интенсивности окрашивания панцитокератина, однако злокачественные клетки, не окрашенные панцитокератином, не могли быть определены количественно. Злокачественные клетки могли быть морфологически идентифицированы на срезах, окрашенных гематоксилин-эозином, даже если они не были окрашены панцитокератиновым антителом. Однако гистологические срезы, использованные в этом исследовании, не подвергались контрастному окрашиванию, чтобы избежать какого-либо вмешательства в анализируемое иммуноокрашивание панцитокератина.

Еще одним параметром интенсивности иммуноокрашивания, измеренным в этом исследовании, была общая площадь иммуноокрашивания , которая отражала количество эпителиальных клеток.Важно отметить, что ни одна из опухолей в исследуемой группе пациентов не показала массивных инфильтраций иммунных клеток, которые могли бы помешать измерению иммуноокрашенных участков путем разбавления окрашивания панцитокератином. Поскольку средняя интенсивность иммуноокрашивания не имела прогностического значения, можно сделать вывод, что прогностическая ценность была обеспечена количеством панцитокератина (показатель средней интенсивности иммуноокрашивания), а не количеством / количеством злокачественных клеток (общая площадь иммуноокрашивания). .

Характеристики фрактального и интенсивного иммуноокрашивания показали аналогичную прогностическую эффективность. Это было поразительно с учетом того факта, что количественная оценка интенсивности является стандартным подходом к оценке иммуноокрашивания, в то время как фрактальный анализ в основном рассматривается как метод выбора для окрашивания пан-ткани. Ранее мы провели фрактальный анализ образцов гистопатологии опухолей, окрашенных H&E всей ткани, для прогностической цели (24, 28). Таким образом, фрактальный анализ намного лучше выполнялся на оттенках серого, чем на бинарных изображениях (28), что прямо противоречило результатам, полученным в этом исследовании.Достигнутое здесь прогностическое превосходство бинарного фрактального анализа было неожиданным, потому что бинаризация изображения в градациях серого приводит к массовой потере информации. Наблюдаемое расхождение может быть связано с различием в методах окрашивания, поскольку в нашем предыдущем исследовании изучалась окрашенная ткань, в то время как в нашем текущем исследовании изучались гистологические образцы опухолей, окрашенные иммуноокрашенными. Следовательно, прогностически благоприятный эффект бинаризации может происходить из более четкого разделения между иммуноокрашенными и неокрашенными областями в бинарных изображениях.Основываясь на обоих исследованиях, мы пришли к выводу, что информация в оттенках серого имеет ключевое значение для окрашенных пан-тканями, в то время как двоичная информация является оптимальным источником прогностической информации для срезов опухолевой ткани, окрашенных иммуноокератином.

Еще одним неожиданным результатом стало то, что монофрактальный анализ с точки зрения прогноза превзошел его мультифрактальный анализ. Этот результат не ожидался ввиду того факта, что мультифрактальный анализ был специально разработан для улучшенного анализа нерегулярных природных форм с их обычно неравномерным распределением сложности.Наше предыдущее исследование показало сравнимую прогностическую ценность монофрактального и мультифрактального анализов срезов ткани опухоли молочной железы, окрашенных пан-тканью (28).

Наблюдаемая ассоциация ^bin FD с более низким риском метастазирования противоречила предыдущим исследованиям фрактального анализа срезов ткани опухоли молочной железы, окрашенных панцитокератином (14, 15). Это несоответствие можно объяснить различиями между использованными группами пациентов с раком груди.Например, в текущем исследовании использовалась группа пациентов без химиотерапии или других системных методов лечения, тогда как в упомянутых предыдущих исследованиях лечение пациентов не было указано. Кроме того, в то время как в этом исследовании анализировались репрезентативные поля зрения, выбранные экспертом-патологом из целых срезов тканей, в предыдущих исследованиях выбор был случайным.

В то время как ^бин FD в основном рассматривается как мера распределения и форм объектов, ^бин FD _контур чувствителен в основном к формам, поскольку он был получен с использованием контурных изображений, показывающих только границы / контуры иммуноокрашенных структур.Поскольку эти два фрактальных измерения показали сходные прогностические характеристики, оказывается, что формы контуров, оцененные с помощью ^{бункеров} FD _{контура} , предлагали столько же прогностической информации, сколько и формы вместе с распределением, полученным с помощью ^бинов FD. . Кроме того, дифференциальный мультифрактальный анализ вычисляет различия в оттенках серого внутри прямоугольников, что обеспечивает чувствительность к текстуре иммуноокрашивания. Тем не менее, из-за упомянутой прогностической неудачи мультифрактального анализа изображений в градациях серого очевидно, что этот тип текстурного анализа не дал никаких прогностически полезных ключей.Взятые вместе, можно сделать вывод, что формы контуров скоплений злокачественных клеток предоставили лучшие прогностические подсказки.

Таким образом, наблюдаемые значимые прогностические характеристики фрактальных особенностей могут быть просто объяснены их высокой корреляцией со стандартными параметрами интенсивности. Однако это объяснение не является правдоподобным ввиду результатов многомерного анализа, которые указали на прогностическую независимость фрактальных характеристик, но не характеристик интенсивности.

Преимущества этого исследования включают первую исчерпывающую прогностическую оценку интенсивности иммуноокрашивания злокачественных клеток опухоли груди и анализ распределения, формы и текстуры иммуноокрашивания.Другим важным преимуществом была высокогомогенная группа пациентов без системной терапии, распространения лимфатических узлов и с меньшим размером опухоли (pT1 / 2). Чтобы собрать такую ​​группу, нам нужно было обратиться к архивам на 25 лет назад, поскольку более поздние протоколы лечения предписывают большинству пациентов системные цитотоксические и / или гормональные препараты. Более того, статистическая надежность была повышена за счет использования бутстрапа в качестве метода коррекции смещения. Преимущества дизайна исследования также включают двукратную оценку прогностической значимости с помощью регрессионного анализа ROC и Кокса с последующим многомерным анализом для оценки потенциальной клинической полезности.Преимущество ROC-анализа заключается в использовании непрерывных значений, что делает его независимым от категоризации значений, вносящих систематическую ошибку. Ограничение ROC-анализа связано с его неспособностью учитывать время до метастазирования. Поэтому мы также использовали регрессию Кокса для прогностической оценки. Ограничения этого исследования заключались в относительно небольшом размере выборки из 73 пациентов. Однако это число намного превышало требования, оцененные с помощью проспективного анализа размера выборки, а высокая однородность группы пациентов дополнительно подтверждала надежность полученных результатов.Ограничение монофрактального анализа, позволяющее получить представление о региональных вариациях распределения пикселей, было преодолено за счет включения мультифрактального анализа. Кроме того, методы компьютерного анализа для оценки иммуноокрашивания, используемые в этом исследовании, полностью объективны. Это выгодно по сравнению с традиционной субъективной оценкой интенсивности окрашивания патологом. Однако общий рабочий процесс, использованный в этом исследовании, по-прежнему включал ограничение остаточной субъективности на уровне выбора репрезентативных областей гистопатологии опухоли для анализа.Другим заметным ограничением было то, что смесь антител панцитокератина AE1 / AE3 иммуноокрашивала как нормальные, так и злокачественные эпителиальные клетки молочной железы. Это ограничение было в значительной степени преодолено путем отбора областей преимущественно злокачественной опухоли на основе морфологических критериев. Таким образом, окрашивание панцитокератина в текущем исследовании в основном указывало на характер роста злокачественных клеток.

В заключение мы сообщаем о нескольких новых и неожиданных открытиях, подчеркивающих неизбыточную прогностическую ценность форм и распределения кластеров злокачественных клеток в опухолях молочной железы, оцененных с помощью фрактального анализа.Прогностическое улучшение клинически очень актуально на основе потенциальной выгоды для выживания надежно идентифицированных пациентов с высоким риском. Дальнейшие исследования продолжаются в направлении дополнительного совершенствования анализа злокачественного роста опухоли молочной железы.

Авторские взносы

NR провел фрактальный анализ изображений в градациях серого и предоставил его интерпретацию. KP и XL разработали алгоритм разложения пятен и участвовали в интерпретации данных анализа изображений. KK выбрал репрезентативные гистопатологические слайды и поле зрения, а также предоставил клиническую интерпретацию результатов.MR разработал исследование и выполнил большую часть написания и статистики. NM выполнил фрактальный анализ бинарных изображений, предоставил его интерпретацию и окончательную редакцию рукописи.

Финансирование

Работа поддержана Министерством образования, науки и технологического развития Республики Сербия, гранты: 175068 и III41031.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Сокращения

TNM, размер опухоли, лимфатический узел и статус метастазов; FD , фрактальная размерность; ^бин FD , бинарная фрактальная размерность; ^серый FD , фрактальная размерность в градациях серого; Λ — лакунарность; AUC — площадь под кривой скорости изменения; ЧСС, степень опасности; H&E, гематоксилин и эозин.

Список литературы

1. Пан Х., Грей Р., Брейбрук Дж., Дэвис С., Тейлор С., МакГейл П. и др.Риск рецидива рака груди в течение 20 лет после прекращения эндокринной терапии через 5 лет. N Engl J Med. (2017) 377: 1836–46. DOI: 10.1056 / NEJMoa1701830

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

3. Тест Carlson B. Oncotype DX предлагает руководство для женщин, обсуждающих химиотерапию. Biotechnol Healthc. (2006) 3: 12–4.

PubMed Аннотация | Google Scholar

4. Буйзе М., Лой С., Ван’т Вир Л., Виале Г., Делоренси М., Глас А.М. и др.Подтверждение и клиническая полезность прогностической сигнатуры из 70 генов для женщин с раком молочной железы без лимфоузлов. J Natl Cancer Inst. (2006) 98: 1183–92. DOI: 10.1093 / jnci / djj329

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

5. Данн Дж. М., Хвим Т., Преториус М., Оукриф Д., Нильсен Б., Альбрегтсен Ф. и др. Сравнение анализа ядерной текстуры и цитометрического анализа ДНК для оценки дисплазии пищевода Барретта. Br J Cancer (2011) 105: 1218–23.DOI: 10.1038 / bjc.2011.353

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Лауринавичюс А., Лауринавичене А., Дасявичюс Д., Эли Н., Планкулен Б., Бор С. и др. Анализ цифровых изображений в патологии: преимущества и обязанности. Anal Cell Pathol. (2012) 35: 75–8. DOI: 10.1155 / 2012/243416

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Энджелл Х. К., Грей Н., Вомак С., Притчард Д. И., Уилкинсон Р. У., Камбербэтч М. Анализ изображений на основе цифрового распознавания образов позволяет количественно оценить иммунные инфильтраты в различных тканевых областях колоректального рака и определить метастатический фенотип. Br J Cancer (2013) 109: 1618–24. DOI: 10.1038 / bjc.2013.487

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8. Лауринавичюс А., Планкулен Б., Лауринавичене А., Херлин П., Мескаускас Р., Балтрусайтите I и др. Методология для обеспечения и повышения точности оценки индекса маркировки Ki67 с помощью автоматического анализа цифровых изображений в ткани рака молочной железы. Breast Cancer Res. (2014) 16: R35. DOI: 10.1186 / bcr3639

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9.Блум HJ, Ричардсон WW. Гистологическая оценка и прогноз рака груди; исследование 1409 случаев, из которых 359 наблюдались в течение 15 лет. Br J Cancer (1957) 11: 359–77. DOI: 10.1038 / bjc.1957.43

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Адамчик А., Немец Дж., Амбицка А., Муха-Малецка А., Рыс Дж., Митус Дж. И др. Выживаемость пациентов с раком молочной железы в соответствии с изменениями экспрессии выбранных маркеров между первичной опухолью и метастазами в лимфатические узлы. Biomark Med. (2016) 10: 219–28. DOI: 10.2217 / bmm.15.123

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

11. Казимир-Бауэр С., Райтер К., Актас Б., Биттнер А. К., Вебер С., Келлер Т. и др. Различная прогностическая ценность циркулирующих и диссеминированных опухолевых клеток при первичном раке молочной железы: влияние приема бисфосфонатов? Научный доклад (2016) 6: 26355. DOI: 10.1038 / srep26355

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

14.Tambasco M, Magliocco AM. Связь между степенью опухоли и вычисленной архитектурной сложностью в образцах рака груди. Hum Pathol. (2008) 39: 740–6. DOI: 10.1016 / j.humpath.2007.10.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15. Tambasco M, Eliasziw M, Magliocco AM. Морфологическая сложность эпителиальной архитектуры для прогнозирования выживаемости при инвазивном раке молочной железы. J Transl Med. (2010) 8: 140. DOI: 10.1186 / 1479-5876-8-140

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16.Вуясинович Т., Прибич Дж., Канджер К., Милошевич Н.Т., Томашевич З., Милованович З. и др. Анализ текстуры матриц совместной встречаемости на уровне серого на изображениях опухолей молочной железы в прогнозировании риска отдаленных метастазов. Microsc Microanal. (2015) 21: 646–54. DOI: 10.1017 / S1431927615000379

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

17. Меррилл А.Л., Бакли Дж., Тан Р., Брахтел Э, Рай У, Майклсон Дж. И др. Изучение моделей роста карциномы груди с использованием 3D-реконструкции: пилотное исследование. Breast J. (2017) 23: 83–9. DOI: 10.1111 / tbj.12688

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Rykala J, Przybylowska K, Majsterek I, Pasz-Walczak G, Sygut A, Dziki A, et al. Количественная оценка маркеров ангиогенеза при раке груди и их корреляция с клинико-патологическими прогностическими переменными. Pathol Oncol Res. (2011) 17: 809–17. DOI: 10.1007 / s12253-011-9387-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19.Бранкович-Мэджик М.В., Николич-Вукосавлевич Д.Б., Нескович-Константинович З.Б., Каньер К.С., Спузич IV. Вариации содержания стероидных рецепторов при раке груди. Сравнение первичных опухолей и метастатических поражений Acta Oncol. (1992) 31: 629–33. DOI: 10.3109 / 0284186920

44

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Ламбертини М., Пинто А.С., Амей Л., Йонген Л., Дель Мастро Л., Пуглиси Ф. и др. Прогностическая эффективность адъюванта! онлайн и ноттингемский прогностический индекс у молодых пациентов с раком груди. Br J Cancer (2016) 115: 1471–8. DOI: 10.1038 / bjc.2016.359

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

21. Li X, Plataniotis KN. Моделирование распределения цветов по круговой смеси для слепого разделения пятен на изображениях патологии. IEEE J Biomed Health Inform. (2017) 21: 150–61. DOI: 10.1109 / JBHI.2015.2503720

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Шинделин Дж., Арганда-Каррерас И., Фризе Э., Кайниг В., Лонгаир М., Пицш Т. и др.Фиджи: платформа с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений. Nat Methods (2012) 9: 676–82. DOI: 10.1038 / nmeth.2019

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Смит Т. Дж. Мл., Ланге Г. Д., Маркс В. Б.. Фрактальные методы и результаты в клеточной морфологии — размерности, лакунарность и мультифракталы. J Neurosci Methods (1996) 69: 123–36. DOI: 10.1016 / S0165-0270 (96) 00080-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24.Райкович Н., Коларевич Д., Каньер К., Милошевич Н.Т., Николич-Вукосавлевич Д., Радулович М. Сравнение алгоритмов монофрактальной, мультифрактальной и серой матрицы совпадения при анализе микроскопических изображений опухоли молочной железы для прогнозирования риска отдаленных метастазов. Биомедицинские микроустройства (2016) 18:83. DOI: 10.1007 / s10544-016-0103-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

25. Эфрон Б. Методы начальной загрузки: еще один взгляд на складной нож. Ann Stat. (1979) 7: 1–26. DOI: 10.1214 / aos / 1176344552

CrossRef Полный текст

26. Cox DR. Регрессионные модели и таблицы дожития. J. R Stat Soc Ser B (1972) 34: 187–220.

27. Цзэн Дж., Александр М.А., Нимех Д., Дарвишян Ф. Предупреждение: вариабельное окрашивание цитокератином при метастазах в сторожевые узлы. Int J Surg Pathol. (2015) 23: 549–52. DOI: 10.1177 / 10668966811

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

28.Райкович Н., Вуясинович Т., Канжер К., Милошевич Н.Т., Николич-Вукосавлевич Д., Радулович М. Прогностическое значение биомаркера бинарных и полутоновых изображений гистопатологии опухоли молочной железы. Biomark Med. (2016) 10: 1049–59. DOI: 10.2217 / bmm-2016-0165

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

(PDF) Сравнение специальных красителей для кератина с обычным окрашиванием гематоксилином и эозином

1

Журнал международного гигиены полости рта, 2015 г .; 7 (3): 1-5 Специальные пятна для кератина… Rao RS et al.

Исходное исследование

Получено: 12 мая 2014 г. Принято: 13 августа 2014 г. Конфликт интересов: «Нет

Источник» Поддержка: Nil

Сравнение специальных красителей на кератин с обычным гематоксилином и пятнами эозина

Рупа С. Рао1, Шанкаргуда Патил2, Барнали Маджумдар3, Ракеш Госвал4

Сотрудник отдела патологии и патологии

Сотрудник отдела патологии

,

Факультет стоматологических наук, Университет прикладных наук М.С. Рамая

наук, Бангалор, Карнатака, Индия; 2 Доцент,

Кафедра патологии полости рта и микробиологии стоматологического факультета

Науки, Университет прикладных наук М.С. Рамая, Бангалор,

Карнатака, Индия; 3Аспирант, отделение стоматологии

Патология и микробиология, факультет стоматологических наук, MS Ramaiah

Университет прикладных наук, Бангалор, Карнатака, Индия; 4Reader,

Отделение челюстно-лицевой хирургии, Массачусетс Рангунвала

Стоматологический колледж и больница, Пуна, Махараштра, Индия.

Для корреспонденции:

Доктор Патил С. Кафедра оральной патологии и микробиологии, факультет

стоматологических наук, Университет прикладных наук М.С. Рамая,

MS Ramaiah Institute of Technology Post, MS Ramaiah Nagar,

Bengaluru — 560 054, Карнатака, Индия. Электронная почта: sbpatil1612 @ gmail.

com

Как цитировать статью:

Рао Р.С., Патил С., Маджумдар Б., Осваль Р.Г. Сравнение специальных красителей

на кератин с обычными красителями гематоксилином и эозином.J Int

Здоровье полости рта 2015; 7 (3): 1-5.

Резюме:

Предпосылки: Кератины являются наиболее распространенными белками и являются

характерными признаками многих эпителиальных патологий, что делает его

диагностически важным маркером как гистопатологически, так и иммуногистохимически

. Поскольку иммуногистохимия — это дорогостоящий диагностический инструмент

, специальные пятна для определения степени ороговения

могут служить более быстрым и экономичным вариантом.Целью

настоящего исследования было сравнение эффективности специальных красителей

для кератина со стандартными красителями гематоксилином и эозином (H и E).

Цели включают: (i) Обработать диагностированные случаи кератиновых

расстройств выбранными специальными пятнами: метод Аюб-шкала,

метод Дейна-Германа, Альциановый синий –периодическая кислота Шиша (PAS),

быстрое окрашивание по Папаниколау (PAP) и по Граму. (ii) Сравнить специфичность окрашивания

и интенсивность окрашивания специальных красителей с

относительно стандартного окрашивания гематоксилином и эозином (H и E).(iii) Для

сравнить эффективность специальных красителей с обычными окрашиваниями H и E в

идентификации типа кератина, присутствующего в выбранных случаях.

Материалы и методы: Из архива отделения было извлечено в общей сложности 80 случаев известной патологии для

кератина, включая

10 случаев нормальной десны, гиперкератоза, плоскоклеточной папилломы,

бородавчатой ​​гиперплазии, бородавчатой ​​карциномы, здоровых тканей. дифференцированная

плоскоклеточная карцинома, ортокератинизированная одонтогенная киста и

керато-кистозные одонтогенные опухоли.Было сделано шесть срезов по 4 мкм из

парановых блоков, окрашенных H и E и специальными красителями

, и они были оценены двумя патологами на основе модифицированных критериев оценки

от Rahma Al-Maaini. и Филип Брайант 2008.

Результаты: Результаты были сведены в таблицу с использованием статистики хи-квадрат и статистики

каппа. Статистические значения для идентификации типа кератинизации

были незначительными, показывая, что орто- и паракератинизированный эпителий

можно было правильно идентифицировать как по H

, так и по E, а также по всем специальным красителям.Кроме того, все специальные красители

показали положительный результат и статистическую значимость (P <

0,001) в отношении окрашивания кератина.

Заключение: В заключение, хотя особые пятна

явно окрашивали кератин с большей интенсивностью, H и E оказались в целом более качественными пятнами

Ключевые слова: Кератины, Аюб-Шклар, Dane-Herman, alcian blue —

периодическая кислота, PAP, грамм

Введение

Кератины являются одним из основных и ключевых структурных белков,

обнаружены в наиболее высокой концентрации и разнообразии в

кератиноцитах кожи, как а также оральный эпителий, и на

приходится почти 80% общего содержания белка в

дифференцированных клетках стратифицированного эпителия.В 1900-х годах кератины

считались белками, которые можно было экстрагировать

из различных эпидермальных модификаций животных, таких как

шерсть, рога, когти и т. Д. 1,2 Впоследствии с развитием

в исследованиях и появлении технологий 21 века кератины

(цитокератины) теперь рассматриваются как промежуточные белки

со специфическими физико-химическими свойствами, обнаруженные в

эпителиях любых позвоночных.2 Они являются частью мультигенного семейства белков

, встречающихся в основных и кислых парах белков

с различным паттерном экспрессии в разных типах эпителия,

, а также в разных слоях одного слоя. ред эпителий.

Основная функция цитокератинов, наряду с микротрубочками

и микротрубочками, заключается в обеспечении структурной целостности и

механической устойчивости всех эукариотических клеток.3

Ротовой эпителий можно разделить на ороговевшие

многослойные эпителии (ортопедические и паракератинизированный) и не ороговевший эпителий

на основании наличия или отсутствия ороговения

.Кератинизация или роговица включает

процесс цитодификации кератиноцитов, начиная с

от их постформационного состояния, т. Е. Базального слоя, до конечного дифференцированного состояния

укрепленных роговых клеток, заполненных

.

с кератиновыми слоями, обнаруженными в поверхностном слое, то есть в слое

рогового 4

Широкий спектр наследственных, предраковых и злокачественных

заболеваний возникает из-за дефектов в процессе кератинизации

делает кератиновые белки важным диагностическим инструментом .4

Следовательно, одна из важных областей применения кератинов

— это диагностика эпителиальных патологий. Хотя иммуногистохимия

известна своей специфичностью при диагностике

, она не является предпочтительным выбором из-за ее стоимости и затрат времени

. Гематоксилин и эозин (H и E), стандартные

Что такое гистология: Руководство по гистологии

Гистологические пятна, кроме H&E

Основные красители
метиловый зеленый	Зеленый
Метиленовый синий	Синий
Пиронин G	Красный
Толуидиновый синий	Синий

Кислотные красители
Фушин кислотный	Красный
Анилиново-синий	Синий
Эозин	Красный
Оранжевый G	Оранжевый

Кислотные и основные красители

В этой таблице приведены некоторые примеры основных и кислотных красителей, используемых при окрашивании.

Для основных красителей реакция анионных групп клеток (к ним относятся фосфатные группы нуклеиновых кислот, сульфатные группы гликозоаминогликанов и карбоксильные группы белков) зависит от pH, при котором они используются.

Для кислотных красителей рассматриваемый краситель часто может дополнительно быть селективным в отношении определенных ацидофильных компонентов. Т.е. Метод, называемый методом окрашивания Мэллори, использует три кислотных красителя: анилиновый синий, кислый фушин и оранжевый G, которые выборочно окрашивают коллаген, цитоплазму и красные кровяные тельца соответственно.

Реакция периодической кислоты-Шиффа (PAS)

Реагент Шиффа представляет собой обесцвеченный основной фушин, который реагирует с альдегидными группами. Эта реакция приводит к окрашиванию среза в темно-красный цвет. Это основа пятен PAS.

PAS окрашивает углеводы и богатые углеводами макромолекулы в темно-красный цвет (пурпурный).

Таким образом,

PAS будет окрашивать:
гликоген — внутриклеточная форма хранения углеводов в клетках
Слизь в клетках и тканях, базальных мембранах и Очистите границы почечных канальцев, тонкого и толстого кишечника. Ретикулярные волокна (т.е. коллаген) в соединительной ткани и хрящах.

В примере, показанном выше, муцин, продуцируемый бокаловидными клетками, окрашен этим красителем в пурпурный цвет.

Трихром Массона.

Часто используется для окрашивания соединительной ткани. Трехцветный — означает, что техника позволяет получить три цвета. Ядра и другие базофильные (основные) структуры окрашиваются в синий цвет, цитоплазма, мышцы, эритроциты и кератин окрашиваются в ярко-красный цвет. Коллаген окрашивается в зеленый или синий цвет, в зависимости от того, какой вариант техники используется.

Синий Альциан

Альциановый синий — это окраска муцина, окрашивающая определенные типы муцинового синего. Хрящ тоже окрашен в синий цвет. Его можно использовать с H&E и красителями по Ван Гизону.

ван Гизон

Окрашивает коллаген в красный цвет, ядра — в синий цвет, а эритроциты и цитоплазму — в желтый цвет. Его можно комбинировать с пятном на эластин, которое окрашивает эластин в синий / черный цвет. Его часто используют для лечения кровеносных сосудов и кожи.

Пятно ретикулина

Окрашивает волокна ретикулина в синий / черный цвет.Используется с H&E

Азан

Ядра окрашены в ярко-красный цвет, коллаген, базальная мембрана и муцин окрашены в синий цвет, мышечные и эритроциты окрашены в оранжевый или красный цвет. Хорошо окрашивает соединительную ткань и эпителий.

Giemsa.

Обычно используется для окрашивания крови и мазков костного мозга. Ядра окрашены от темно-синего до фиолетового цвета, цитоплазма бледно-голубая, эритроциты бледно-розовые.

Толуидиновый синий.

Основное пятно, окрашивающее кислотные компоненты в различные оттенки синего.Обычно используется для тонких акриловых или эпоксидных профилей.

Серебряный и золотой методы.

Иногда используется для демонстрации тонких структур, таких как клеточные процессы в нейронах. Образует черное, коричневое или золотистое пятно.

Хромовые квасцы / гемотоксилин.

Редко — окрашивает ядра в синий цвет, а цитоплазму в красный цвет. Что касается поджелудочной железы, секретирующие глюкагон клетки окрашиваются в розовый цвет, а секретирующие инсулин клетки окрашиваются в синий цвет.

Исамин синий / эозин

Как H&E, но более интенсивный синий.

Ниссль и метиленовый синий

Базовый краситель, используемый для окрашивания грубого ER в нейронах.

Судан Черный и осмий.

Эти красители окрашивают липидсодержащие структуры, такие как миелин, в коричневато-черный цвет.

Иммуногистохимические методы.

Это специфический тип красителя, в котором используются первичные антитела, которые специфически маркируют белок, а затем флуоресцентно меченное вторичное антитело используется для связывания с первичным антителом, чтобы выявить место связывания первого (первичного) антитела.Световой микроскоп с флюоресценцией используется для визуализации окрашивания. Флуоресцентные антитела возбуждаются на одной длине волны света, а затем они излучают свет на другой длине волны. Используя правильную комбинацию фильтров, можно наблюдать картину окрашивания, создаваемую излучаемым флуоресцентным светом. Например, на этой фотографии показаны некоторые клетки, иммунофлуоресцентно окрашенные на белок актин.

Различные кератиновые антитела вызывают иммуногистохимическое окрашивание миокарда и миометрия человека

Altmannsberger M, Osborn M, Schauer A, Weber K (1981) Антитела к различным промежуточным белкам филаментов.Типоспецифические маркеры клеток на залитых парафином тканях человека. Lab Invest 45: 427–434

Google Scholar

Brandtzaeg P (1974) Распределение компонентов иммуноглобулина в слизистой и железах. Иммуногистохимия с холодной фиксацией этанолом. Иммунология 26: 1101–1114

Google Scholar

Brandtzaeg P (1985) Совместная экспрессия антигенов кератина, виментина и HLA-DR в карциномах носоглотки.Патол Рес Прак 180: 258 (Тезисы)

Google Scholar

Brandtzaeg P, Rognum TO (1983) Оценка методов подготовки тканей и парного иммунофлуоресцентного окрашивания для иммуноцитохимии лимфом. Histochem J 15: 655–689

Google Scholar

Chase DR, Weiss SW, Enzinger FM, Langloss JM (1984) Кератин в эпителиоидной саркоме. Иммуногистохимическое исследование.Am J Surg Pathol 8: 435–441

Google Scholar

Fagraeus A, Orvell, C, Norberg R, Norrby E (1983) Моноклональные антитела к эпитопам, общим для актина и виментина, полученные иммунизацией парамиксовирусом. Exp Cell Res 145: 425–432

Google Scholar

Fawcett DW, Selby CC (1958) Наблюдения за тонкой структурой атриума черепахи. J Biophys Biochem Cytol 4: 63–71

Google Scholar

Fawcett DW, McNutt NS (1969) Ультраструктура миокарда кошки.I. Сосочковая мышца желудочка. J Cell Biol 42: 1–45

Google Scholar

Franke WW, Schmid E, Osborn M, Weber K (1978) Различные филаменты среднего размера, различимые с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Proc Natl Acad Sci USA 75: 5034–5038

Google Scholar

Franke WW, Schmid E, Freudenstein C, Appelhans B, Osborn M, Weber K, Keenan TW (1980) Нити промежуточного размера прекератинового типа в миоэпителиальных клетках.J Cell Biol 84: 633–653

Google Scholar

Franke WW, Moll R, Sciller DL, Schmid E, Kartenbeck J, Mueller H (1982) Десмоплакины эпителиальных и миокардиальных десмосом связаны иммунологически и биохимически. Дифференциация 23: 115–127

Google Scholar

Gabbiani G, Kapanci Y, Barazzone P, Franke WW (1981) Иммунохимическая идентификация филаментов среднего размера в неопластических клетках человека.Диагностическое пособие для хирургического патологоанатома. Am J Pathol 104: 206–216

Google Scholar

Гейгер Б., Даттон А.Х., Токуясу К.Т., Сингер С.Дж. (1981) Иммуноэлектронные микроскопические исследования взаимодействий мембрана-микрофиламент: распределение α-актинина, тропомиозина и винкулина в щеточной кайме кишечного эпителия и гладкомышечных клетках желудка курицы. J Cell Biol 91: 614–628

Google Scholar

Geiger B, Schmid E, Franke WW (1983) Пространственное распределение белков, специфичных для десмосом и соединений adhaerens в эпителиальных клетках, продемонстрированное двойной иммунофлуоресцентной микроскопией.Дифференциация 23: 189–205

Google Scholar

Geisler N, Weber K (1982) Аминокислотная последовательность десмина куриных мышц обеспечивает общую структурную модель для белков промежуточных филаментов. EMBO J 1: 1649–1656

Google Scholar

Gigi I, Geiger B, Eshhar Z, Moll R, Schmid E, Winter S, Schiller DL, Franke WW (1982) Обнаружение детерминанты цитокератина, общей для различных эпителиальных клеток, с помощью широко перекрестно реагирующих моноклональных антител.EMBO J 1: 1429–1437

Google Scholar

Gown AM, Vogel AM (1982) Моноклональные антитела к белкам промежуточных филаментов клеток человека: уникальные и перекрестно реагирующие антитела. J Cell Biol 95: 414–424

Google Scholar

Hanukoglu I, Fuchs E (1982) Последовательность кДНК эпидермального кератина человека: дивергенция последовательности, но сохранение структуры среди белков промежуточных филаментов.Ячейка 31: 243–252

Google Scholar

Holthöfer H, Miettinen A, Paasivuo R, Lehto V-P, Linder E, Alfthan O, Virtanen I (1983) Клеточное происхождение и дифференциация почечных карцином. Флуоресцентное микроскопическое исследование с использованием специфических для почек антител, антител к промежуточным филаментам и лектинов. Lab Invest 49: 317–326

Google Scholar

Holthöfer H, Miettinen A, Lehto V-P, Lehtonen E, Virtanen I (1984) Экспрессия виментиновых и цитокератиновых типов белков промежуточных филаментов в развивающихся и взрослых почках.Lab Invest 50: 552–559

Google Scholar

Huitfeldt HS, Brandtzaeg P (1984) Сердечная мышца человека содержит кератиноподобный материал в интеркалированных дисках. Acta Pathol Microbiol Scand Sect A 92: 481–482

Google Scholar

Kartenbeck J, Franke WW, Moser JG, Stoffels U (1983) Специфическое прикрепление десминовых нитей к десмосомным бляшкам в сердечных миоцитах. EMBO J 2: 735–742

Google Scholar

Kjörell U, Thornell LE (1983) Иммунологическая взаимосвязь между различными типами бычьих опосредованных волокон.Eur J Cell Biol 29: 193–199

Google Scholar

Кочер О., Скалли О., Блум В.С., Габбиани Г. (1984) Цитоскелет гладкомышечных клеток аорты крысы: нормальные условия и экспериментальное утолщение интимы. J Submicrosc Cytol 16: 147–148

Google Scholar

Krepler R, Denk H, Artlieb U, Fichtinger E, Davidovits A (1982) Антитела к белкам промежуточных филаментов как молекулярные маркеры в клинической патологии опухолей.Дифференциация карцином по их реакции с различными антителами к цитоккратину. Патол Рес Практ 175: 212–226

Google Scholar

Miettinen M, Franssila K, Lehto V-P, Paasivuo R, Virtanen I (1984) Экспрессия промежуточных нитей в щитовидной железе и опухолях щитовидной железы. Lab Invest 50: 262–270

Google Scholar

Moll R, Franke WW, Schiller DL (1982) Каталог цитокератинов человека: паттерны экспрессии в нормальном эпителии, опухолях и культивируемых клетках.Ячейка 31: 11–24

Google Scholar

Osborn M (1983) Промежуточные волокна как гистологические маркеры: обзор. J Invest Dermatol 81 (Suppl): 104s-107s

Google Scholar

Осборн М., Вебер К. (1983) Биология болезней. Диагностика опухолей с помощью типирования промежуточных филаментов: новый инструмент хирургической патологии. Lab Invest 48: 372–394

Google Scholar

Pruss RM, Mirsky R, Raff MC, Thorpe R, Dowding AJ, Anderton BH (1982) Все классы промежуточных филаментов имеют общую антигенную детерминанту, определяемую моноклональным антителом.Ячейка 27: 419–428

Google Scholar

Ramaekers FCS, Haag D, Kant A, Moesker O, Jap PHK, Vooijs GP (1983) Коэкспрессия промежуточных филаментов кератинового и виментинового типов в метастатических клетках карциномы человека. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2618–2622

Google Scholar

Ramaekers F, Puts J, Kant A, Moesker O, Huysmans A, Jap P, Herman C, Vooijs P (1984) Использование поли- и моноклональных антител к белкам промежуточных филаментов в диагностике опухолей.J Submicrosc Cytol 16: 151–153

Google Scholar

Said JW (1983) Иммуногистохимическая локализация кератиновых белков при диагностике опухолей. Хум Патол 14: 1017–1019

Google Scholar

Шлегель Р., Бэнкс-Шлегель С., Пинкус Г.С. (1980) Иммуногистохимическая локализация кератина в нормальных тканях человека. Lab Invest 42: 91–96

Google Scholar

Schmid F, Osborn M, Rungger-Brändle E, Gabbiani G, Weber K, Franke WW (1982) Распределение филаментов виментина и десмина в гладкомышечных тканях аорты млекопитающих и птиц.Exp Cell Res 137: 329–340

Google Scholar

Schmid E, Franke WW, Grund C, Schiller DL, Kolb H, Pawelets N (1983) Линия эпителиальных клеток с удлиненной миоидной морфологией, полученная из молочной железы крупного рогатого скота. Экспрессия цитокератина и белков десмосомных бляшек в необычных массивах. Exp Cell Res 146: 309–328

Google Scholar

Staehelin LA, Hull BE (1978) Соединения между живыми клетками.Sci Am 238: 140–152

Google Scholar

Sun T-T, Green H (1978) Кератиновые нити культивируемых эпидермальных клеток человека. Образование межмолекулярных дисульфидных связей при терминальной дифференцировке. J Biol Chem 253: 2053–2060

Google Scholar

Sun T-T, Eichner R, Nelson WG, Tseng SCG, Weiss RA, Jarvinen M, Woodcock-Mitchell J (1983) Классы кератина: молекулярные маркеры для различных типов дифференцировки эпителия.J Invest Dermatol 81 (Suppl): 109s-115s

Google Scholar

Валнес К., Брандтзаег П. (1981) Метод немеченых антител пероксидаза-антипероксидаза в сочетании с прямой иммунофлуоресценцией. J Histochem Cytochem 29: 703–711

Google Scholar

Van Muijen GNP, Ruiter DJ, Ponec M, Huiskens-Van der Mey C, Warmaar SO (1984) Моноклональные антитела с различной специфичностью против цитокератинов.Иммуногистохимическое исследование нормальных тканей и опухолей. Am J Pathol 114: 9–17

Google Scholar

Zackroff RV, Goldman AE, Jones JCR, Steinert PM, Goldman RD (1984) Выделение и характеристика кератин-подобных белков из культивируемых клеток с фибробластной морфологией. Cell Biol 98: 1231–1237

Google Scholar

Конфокальная микроскопия — окрашивание цитокератином

Подготовка образцов с использованием синтетических флуорофоров и иммунофлуоресценции

Окрашивание адгезивных клеток с помощью

Первичные антитела к цитокератину и синтетические флуорофоры

Большинство обычных линий эпителиальных клеток, полученных от людей и лабораторных животных, дают ярко окрашенные флуоресцентные образцы, детализирующие сеть промежуточных нитей цитокератина, при окрашивании смесью, которая включает антитела к кератину, конъюгированные с обычными синтетическими низкомолекулярными веществами. флуоресцентные зонды.Среди полезных флуоресцентных маркеров для визуализации тубулина (а также актина) являются родамин, флуоресцеин, серия Alexa Fluor и цианиновые красители. Контрастное окрашивание ядер с использованием различных популярных ДНК-связывающих красителей следует за обработкой антителами и нитевидными актиновыми зондами. В этом протоколе подробно описана общая процедура окрашивания прилипших клеток. В общем, лучшими кандидатами на иммунофлуоресценцию цитокератина являются эпителиальные клетки, например, полученные из почек.Фибробласты обычно плохо реагируют на пробы цитокератина.

На рисунке 1 представлено широкополосное флуоресцентное изображение, показывающее сеть промежуточных филаментов цитокератина, присутствующую в прикрепленных эпителиальных клетках почек кенгуру крысы (линия PtK2 ). Клетки иммунофлуоресцентно метили мышиными первичными антителами против цитокератина, а затем козьими вторичными антителами против мышиных, конъюгированными с цианиновым красителем Cy2. Кроме того, образец был подвергнут контрастному окрашиванию MitoTracker Red CMXRos и DAPI, нацеленным на митохондриальную сеть и ядра, соответственно.Изображения были записаны в оттенках серого с помощью системы камеры QImaging Retiga Fast-EXi, соединенной с микроскопом Olympus BX-51, оснащенным оптическими блоками полосно-эмиссионного флуоресцентного фильтра, предоставленными Omega Optical. На этапе обработки отдельные каналы изображения были псевдоцветны со значениями RGB, соответствующими каждому из спектральных профилей излучения флуорофора.

Широкий спектр первичных антител, нацеленных на другие антигены, можно использовать в комбинации с антикератиновыми антителами.Кроме того, синтетические флуорофоры, такие как MitoTrackers, также можно использовать в качестве контрастных красителей. Однако, поскольку фиксатор метанола осаждает актиновые филаменты, фаллоидины и антиактиновые антитела не используются в комбинации с цитокератином. Перед планированием экспериментов для зондов, которые будут использоваться с фиксаторами метанола, рекомендуется протестировать только первичные антитела, чтобы определить, скрыты ли их участки связывания фиксатором.

Реагенты

• Забуференный фосфатом физиологический раствор с кальцием и магнием (PBS) — Растворение 0.2 грамма хлорида калия, 0,2 грамма одноосновного фосфата калия, 8,0 грамма хлорида натрия и 1,74 грамма двухосновного фосфата натрия (гептагидрата) в одном литре бидистиллированной воды. После растворения этих реагентов добавьте 0,132 г дигидрата хлорида кальция и 0,10 г гексагидрата хлорида магния. Довести pH до 7,2 концентрированным гидроксидом натрия. Добавление двухвалентных щелочноземельных металлов в буферный раствор помогает гарантировать, что неконденсированный хроматин остается неповрежденным и содержится в ядре во время процедуры окрашивания, резко снижая уровни фоновой флуоресценции при использовании ДНК-зондов, возбуждаемых ультрафиолетовым излучением (DAPI и Hoechst).
• Fixative — Метанол реактивной степени чистоты помещают в морозильную камеру с температурой -20 градусов Цельсия по крайней мере за 2 часа до процедуры окрашивания.
• Блокирующий буфер — 10% нормальной козьей сыворотки ( NGS ) в PBS, содержащем 0,05% Triton X-100 (добавьте 2-3 миллиграмма азида натрия на 100 миллилитров блокирующего буфера, чтобы исключить рост микроорганизмов). Если используются вторичные антитела к хозяину, отличному от козьего, приготовьте блокирующий буфер с нормальной сывороткой этого вида.
• Промывочный буфер PBS — Используйте PBS для промывки покровных стекол перед обработкой метанолом и перед окрашиванием ядер.
• PBS-Triton Wash Buffer — Для последовательностей отмывки сразу после фиксации и еще раз перед окрашиванием ядерными красителями используйте PBS, содержащий 0,05% Triton X-100.
• Промывочный буфер PBS-Triton с блокирующей сывороткой — Для последовательностей промывки между инкубацией первичного и вторичного антитела и сразу после обработки вторичным антителом используйте PBS, содержащий 0.05 процентов Triton X-100 и 1 процент нормальной сыворотки хозяина (козы).
• Коктейль первичных антител — Добавьте соответствующий объем концентрированного исходного раствора первичных антител (против кератина) в блокирующий буфер, разбавленный на 50 процентов промывочным буфером PBS-Triton (для получения конечной концентрации 5-процентной нормальной козьей сыворотки). В коктейль можно смешать несколько первичных антител от разных хозяев. Прилипшие клетки на покровном стекле следует обработать 100 микролитрами коктейля первичных антител.
• Коктейль вторичных антител / фаллоидина — Добавьте соответствующий объем вторичных антител, конъюгированных с выбранным флуорофором (например, 8 микролитров вторичных IgG козьих антимышиных тяжелых и легких цепей с Alexa Fluor 350 в концентрации 2 миллиграмма на миллилитр) к 1 миллилитр блокирующего буфера, разбавленный на 50% промывочным буфером PBS-Triton (для получения конечной концентрации 5% нормальной козьей или другой сыворотки крови хозяина). Как и в случае смеси первичных антител, прилипшие клетки на покровных стеклах следует обработать 100 мкл смеси первичных антител.
• Nuclear Dye — Подготовьте свежие разведения ядерного красителя непосредственно перед окрашиванием. При использовании красителей SYTOX, DRAQ5 и цианиновых ядер фоновая флуоресценция может быть значительно снижена (особенно в цитоплазме) путем добавления 10 миллиграммов РНКазы в блокирующий буфер. В этом случае блокируйте клетки или ткани при 37 градусах Цельсия, а не при комнатной температуре, чтобы активировать фермент.
• Буфер для промывки ядерных красителей — красители Hoechst и SYTOX требуют сбалансированного солевого раствора Хэнкса ( Hanks BSS ), в то время как DAPI, а также мономерные и димерные цианиновые ядерные красители можно использовать с PBS.

Растворы ядерных контрастных красителей

• Hoechst (33342 и 33258) — Разведите 5 микролитров исходного раствора 10 миллиграмм / миллилитр в 150 миллилитрах Hanks BSS (обработка в течение 30 минут).
• SYTOX Green and Orange — Разбавьте 10 микролитров концентрированного исходного раствора (5 миллимолей в диметилсульфоксиде) в 250 миллилитрах Hanks BSS (обрабатывайте в течение 30 минут).
• DAPI — Разбавьте 5 микролитров исходного раствора 10 миллиграмм / миллилитр в 150 миллилитрах PBS, разбавленного на 50 процентов бидистиллированной водой (обрабатывайте в течение 5 минут).
• Мономерные и димерные цианиновые красители — Разбавьте концентрированный исходный раствор (например, TO-PRO-3; обычно 1 миллимолярный) в соответствии с рекомендациями производителя (от 1:20 до 1: 1000) в PBS (обработайте от 5 до 30 минут).
• DRAQ5 — Разбавьте концентрированный основной раствор (обычно 1 миллимолярный) в соответствии с рекомендациями производителя (от 1:20 до 1: 1000) в PBS (обрабатывайте в течение 5–30 минут).

Процедура

Аспирируйте среду для роста из чашки Петри, содержащей здоровые клетки, прилипшие к покровным стеклам, и замените предварительно нагретым (37 градусов Цельсия) буфером PBS для удаления белков среды и сыворотки (используйте 3 миллилитра буфера для 60%). миллиметровые чашки Петри).Дважды промойте клетки предварительно нагретым буфером PBS и инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия во время циклов промывки. Каждая чашка Петри должна быть индивидуально помечена первичными антителами и другими красителями, используемыми для покровных стекол в этой чашке. Покровные стекла должны оставаться с оригинальной чашкой Петри на каждом этапе всей процедуры. При последней промывке PBS убедитесь, что все следы буфера удалены из чашки Петри, но не позволяйте покровным стеклам сохнуть.

Зафиксируйте клетки, добавив соответствующий объем предварительно охлажденного (-20 градусов Цельсия) метанола в каждую чашку Петри, и быстро перенесите чашки в морозильную камеру.Зафиксируйте от 5 до 10 минут. Одним из наиболее важных аспектов этой процедуры является обеспечение того, чтобы клетки строго поддерживались на уровне, близком к -20 градусам Цельсия, насколько это возможно во время этапа фиксации.

Извлеките чашки Петри из морозильника и трижды промойте промывочным буфером PBS-Triton в течение 5 минут (каждая промывка) перед блокировкой. Обратите внимание, что клетки обезвожены, а покровные стекла имеют тенденцию быстро высыхать, поэтому аспирируйте и освежите белье как можно быстрее.

Удалите промывочный буфер PBS-Triton и заблокируйте сайты связывания неспецифических вторичных антител с помощью 10% нормального блокирующего буфера сыворотки хозяина.Обработайте прикрепленные клетки блокирующим буфером в течение 60 минут при комнатной температуре и медленно вращайте чашки Петри, пока клетки блокируются на орбитальном шейкере со скоростью 5-10 оборотов в минуту.

На этапе блокировки подготовьте подложки для обработки антител, накрыв предметные стекла размером 2 × 3 дюйма парафильмом, как показано на рис. 2. Закрепите парафильм так, чтобы он плотно прилегал и равномерно распределялся по поверхности стекла (без пузырей). После блокировки осторожно снимите покровные стекла с чашек Петри и поместите их клеточной стороной вниз на 100-микролитровую каплю разбавленного коктейля первичных антител в 50-процентном блокирующем буфере, нанесенного на предметное стекло, покрытое парафильмом.На одном слайде можно разместить от 3 до 6 покровных стекол (в зависимости от размера). Затем поместите слайды в камеру влажности (см. Рисунок 3) и инкубируйте покровные стекла в камере влажности в течение 1,5 часов при 37 градусах Цельсия. Если первичные антитела не конъюгированы с флуорофорами, на этом этапе нет необходимости защищать покровные стекла от света.

После обработки первичными антителами верните покровные стекла в исходные чашки Петри и трижды промойте при комнатной температуре (от 5 до 10 минут для каждой промывки) промывочным буфером PBS-Triton с блокирующей сывороткой для удаления несвязанных первичных антител.Медленно вращайте чашки Петри, пока клетки промывают на орбитальном шейкере со скоростью 5-10 оборотов в минуту.

После промывки осторожно снимите покровные стекла с чашек Петри и поместите их клеточной стороной вниз на 100-микролитровую каплю разбавленного коктейля вторичных антител в 50-процентном блокирующем буфере, нанесенного на предметное стекло, покрытое парафильмом. Еще раз поместите слайды в камеру влажности (см. Рисунок 3) и инкубируйте покровные стекла в камере влажности в течение 1 часа при 37 градусах Цельсия, если используются меньшие вторичные фрагменты антител, или 1.5 часов для целых молекул антител. На этом этапе важно накрыть камеру влажности алюминиевой фольгой, чтобы защитить флуорофоры от света.

После обработки вторичными антителами верните покровные стекла в исходные чашки Петри и трижды промойте при комнатной температуре (от 5 до 10 минут для каждой промывки) промывочным буфером PBS-Triton с блокирующей сывороткой для удаления несвязанных вторичных антител. Медленно вращайте чашки Петри, пока клетки промывают на орбитальном шейкере со скоростью 5-10 оборотов в минуту.

При подготовке к окрашиванию ядер дважды промойте клетки промывочным буфером PBS-Triton в течение 5 минут (каждая промывка). Медленно вращайте чашки Петри, пока клетки промывают на орбитальном шейкере со скоростью 5-10 оборотов в минуту.

Для DAPI и цианиновых ядерных контрастных красителей добавьте разбавленный краситель в PBS (50 процентов PBS для DAPI) в чашку Петри и обработайте покровные стекла в течение рекомендованного времени: 5–10 минут для DAPI; 15-30 минут для цианиновых красителей (защищать от света алюминиевой фольгой).При использовании красителей Hoechst или SYTOX (30-минутная инкубация) сначала промойте предметные стекла сбалансированным солевым раствором Хэнкса для двух замен буфера перед контрастным окрашиванием.

Промойте контрастные покровные стекла PBS или сбалансированным солевым раствором Хенкса (в зависимости от ядерного красителя) трижды по 5 минут для каждой промывки. Защищать от света алюминиевой фольгой.

Чтобы удалить лишнюю соль, промойте клетки трижды по 2–3 минуты (каждую промывку) в дистиллированной воде.Обратите внимание, что этот шаг необходим только в том случае, если покровные стекла должны быть просушены на воздухе в течение ночи перед установкой.

После последней промывки дистиллированной водой осторожно удалите покровные стекла с чашки Петри с помощью пинцета и вытрите излишки воды с тыльной стороны и краев. Прислоните покровные стекла боками к крышке чашки Петри с этикеткой и дайте им высохнуть в течение ночи. Защищайте засыхающие покровные стекла от света алюминиевым противнем для выпечки. После высыхания установите покровные стекла (ячейкой вниз) на чистые предметные стекла микроскопа, используя соответствующую монтажную среду.

Соавторы

Натан С. Клэкстон , Грегори К. Оттенберг , Скотт Г. Оленич , Джон Д. Гриффин и Майкл Дэвидсон — Национальная лаборатория сильного магнитного поля, 1800 Восток Пол Дирак Доктор, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

Цитокератин, пан-антитело (AE-1 / AE-3) (NBP2-29429): Novus Biologicals

Цитокератины представляют собой семейство промежуточных нитчатых белков, которые являются экспрессируется эпителиальными клетками (1,2).Размер цитокератинов варьируется с теоретической молекулярной массой от примерно 40 кДа до 68 кДа (2,3). Семейство цитокератинов состоит из 20 полипептидов, которые далее делятся на две основные группы в зависимости от изоэлектрической точки и молекулярной массы (1-3). Группа типа I — это более мелкие кислые полипептиды, обозначаемые от цитокератина 9 до цитокератина 20 (CK9 — CK20) (1-4). Напротив, CK1 — CK8 принадлежат к группе типа II, классифицируемой как более крупные, основные или нейтральные полипептиды (1-4). Структурно цитокератины имеют гомологичную базовую структуру с другими промежуточными филаментами; они обладают центральной спиральной областью из 300–315 аминокислот (а.о.), которая состоит из четырех консервативных доменов (1A, 2A, 1B и 2B), разделенных линкерными доменами (L1, L12 и L2) (1,5).Кроме того, фланкируя эту центральную область, как амино-, так и карбоксильные концы имеют гомологичный субдомен (H), вариабельный домен (V) и заряженные концевые субдомены (E) (1). Кроме того, центральный стержень одного мономера цитокератина связывается с другим мономером с образованием димера со спиральной спиралью, который впоследствии связывает другой димер с образованием тертрамера (3). Наконец, многие тетрамеры соединяются вместе, образуя промежуточную нить диаметром примерно 10 нм (1-3, 5). Цитокератины представлены парами, обычно с членами типа I и типа II; например, CK10 соединяется с CK1 (1,3).

Эпителиальные клетки экспрессируют несколько подтипов цитокератинов, которые можно использовать для классификации типа эпителиальных клеток или статуса дифференцировки, а также прогрессирования опухоли или диагностики (2). Цитокератины важны как для стабильности, так и для целостности эпителиальных клеток, а также для функции внутриклеточной передачи сигналов, от заживления ран до апоптоза (1). Цитокератины являются полезными опухолевыми маркерами иммуногистохимии, а антитела к цитокератинам являются обычным патологическим инструментом (1,3,6). Пан-антитело к цитокератину представляет собой смесь антител, которая может обнаруживать несколько цитокератинов и реагировать на несколько эпителиальных тканей (1,3,6).Например, AE-1 / AE-3 представляет собой обычно используемый специфический пан-цитокератин, который обнаруживает цитокератины 1-8, 10, 14-16 и 19 (1,3,6).

Учитывая роль цитокератинов в структурной целостности эпителиальных клеток, мутации в цитокератинах, как было показано, играют роль в различных заболеваниях человека, включая простой буллезный эпидермолиз (EBS) (4,5). EBS — аутосомно-доминантное заболевание, вызванное миссенс-мутациями в CK5 или CK14 (5). Другие известные нарушения, связанные с цитокератином, включают буллезный ихтиоз, кожное заболевание, характеризующееся покраснением, образованием пузырей и гиперкератозом, а также эпидермолитическую ладонно-подошвенную кератодермию (EPPK), которая приводит к гиперкератозу ладоней и подошв (7).

Ссылки

1. Авасти П., Тахриани А., Бхаттачарья А., Авасти П. и Кератинс Б. А. (2016). Кератины или цитокератины: обзорная статья. Журнал перспективных медицинских и стоматологических исследований. https: //10.21276/jamdsr.2016.4.4.30

2. Саутгейт Дж., Харнден П. и Трейдосевич Л. К. (1999). Паттерны экспрессии цитокератина в нормальном и злокачественном уротелии: обзор биологических и диагностических значений. Гистология и гистопатология.https://doi.org/10.14670/HH-14.657

3. Белалдавар, К., Мане, Д. Р., Халликеримат, С., Кале, А. Д. (2016). Цитокератины: его роль и профиль экспрессии в здоровье и заболеваниях полости рта. Журнал оральной и челюстно-лицевой хирургии, медицины и патологии. https://doi.org/10.1016/j.ajoms.2015.08.001.

4. Линдер С. (2007). Маркеры цитокератина достигли совершеннолетия. Биология опухолей: журнал Международного общества биологии и медицины онкологического развития. https://doi.org/10.1159/000107582

5.Джейкоб, Дж. Т., Куломб, П. А., Кван, Р., и Омари, М. Б. (2018). Кератиновые промежуточные волокна типов I и II. Перспективы Колд-Спринг-Харбор в биологии. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a018275

6. Ордоньес Н. Г. (2013). Иммуногистохимические эпителиальные маркеры широкого спектра действия: обзор. Патология человека. https://doi.org/10.1016/j.humpath.2012.11.016

7. Маклин, У. Х., Мур, К. Б. (2011). Кератиновые нарушения: от гена к терапии. Молекулярная генетика человека. https: // doi.org / 10.1093 / hmg / ddr379

Цитокератинов при обнаружении опухолей | www.antibodies-online.com

Цитокератины (СК, или, согласно более современной номенклатуре, также называемые просто кератинами) представляют собой промежуточные филаменты, образующие белки, которые обеспечивают механическую поддержку и выполняют множество дополнительных функций в эпителиальных клетках. Они являются частью цитоскелета и самого большого семейства белков промежуточных филаментов.

Различают два типа цитокератинов, образующих гетеродимеры, а именно кислотный тип I (цитокератины 9-23) и основной тип II (цитокератины 1-8).

Специфическая природа этих гетеродимеров служит для различения различных эпителиальных клеток, в которых они экспрессируются, а также стала важной при классификации опухолевых клеток, помимо других белковых опухолевых маркеров.

Мутации в большинстве из них теперь связаны со специфическими нарушениями хрупкости тканей, а антитела к цитокератинам являются важными маркерами дифференцировки тканей.

Кератин — маркер тканевой дифференциации

Кератины — инструменты диагностики патологии, особенно при обнаружении опухолей.Первичные опухоли и метастазы данной карциномы имеют один и тот же образец цитокератинов, который отличает их от других типов карцином, тем самым позволяя дифференцировать разные опухоли ( Ref. 1-4 ).

Например, мезотелиомы (защитная оболочка, покрывающая большую часть внутренних органов тела) и аденокарциномы (происходящие из железистой ткани) можно отличить по кератину 5. Дефекты кератина 5 приводят к наследственным кожным заболеваниям, таким как простой буллезный эпидермолиз ( EBS) или болезнь Даулинга-Деогса (DDD) ( Ref.5-7 ).

Кератин 7 может использоваться как инструмент для различения карцином яичников и желудочно-кишечного тракта, или переходно-клеточные карциномы и рак простаты. В гепатоцитах атипичная экспрессия кератина 7 является маркером первичного билиарного цирроза ( Ref. 8-10 ).

Кератин 8 и Кератин 18 играют структурную роль в простом эпителии. Кроме того, они играют роль в передаче сигналов, которая модулирует прикрепление клеток, синтез белка, фазовый переход G1 / S и адаптацию к стрессу.Кроме того, кератин 18 можно применять для обнаружения апоптоза и некроза опухолей, вызванных терапией ( Ref. 11-14 ).

Плоскоклеточная карцинома (которая имеет защитные функции для обмена питательными веществами) может быть диагностирована с использованием кератина 10, кератина 13 и кератина 17 в качестве биомаркеров.

Поскольку предполагается, что кератин 19 связан с сохранением недифференцированного клеточного характера, он может быть полезен при обнаружении множества опухолей ( Ref 18-22 ).

Ниже мы составили список, который поможет вам найти то, что вам нужно в вашем исследовании.

Карцинома и соответствующий кератиновый маркер

18956 Adenocphaarus

Карцинома	Цитокератины	Избранные антитела
Гепатоцеллюлярная карцинома	8, 18	Цитокератин 8
Цитокератин 8
Аденокарцинома ободочной кишки 1 909, тип 1963 909, тип 1	Аденокарцинома толстой кишки, тип 2	8, 17, 18, 19	Цитокератин 17
Аденокарцинома желудка	7, 8, 18, 19	Цитокератин 7, 17
8, 18, 19	Цитокератин 19
Аденокарцинома поджелудочной железы	7, 8, 17, 18, 19	Цитокератин 18
Протоковая (адено-) карцинома 1 763 909 типа груди, тип 64 , 8, 18, 19	Цитокератин 19
Базальноклеточная эпителиома	5, 6, 8, 14, 15, 17	Цитокератин 5 , 18
Плоскоклеточный рак кожи	5, 6, 11, 14, 16, 17	Цитокератиновый пан
Плоскоклеточный рак языка	5, 6, 14, 16, 17	Цитокератин 14
Протоковая карцинома груди 2 типа	6, 7, 8, 11, 14, 16, 17, 18, 19	Цитокератин 18
Недифференцированный рак бронхов (крупноклеточный)	6, 7, 8, 17, 18, 19	Цитокератин 18
Солидная карцинома верхнечелюстной пазухи	5, 8, 17, 18, 19	Цитокератин 17
	Адамантинома 909, 5, 8, 14, 15, 16, 17, 19	Цитокератин 19
Плоскоклеточный рак надгортанника	4, 5, 6, 8, 14, 15, 16, 17, 18, 19	Цитокератин 18
Плоскоклеточный рак пищевода	4, 5 , 8, 14, 15, 16, 17, 19	Цитокератин 14
Плоскоклеточный рак ректально-анальной области	4, 5, 6, 8, 10, 11, 14, 15, 16, 17, 18, 19	Цитокератин 10
Клоакогенная карцинома	1, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 19	Цитокератин 10, 13

Цитокератин-мишени

Список литературы

• Молл Р.и другие; Cell 1982; 31: 11-24
• Варадхачари Г.Р. и другие.; Cancer 2004; 100: 1776-1785
• Гастерсон Б.А. и другие.; Рак молочной железы Res. 2005; 7: 143-148
• Kanaji N. et al .; Рак легких 2007; 55: 295-302
• Moll R. et al .; Арка Вирхова. B Cell Pathol. Вкл. Мол. Патол. 1989; 58: 129-145
• Rugg E.L. и другие.; J. Invest. Дерматол. 2007; 127: 574-580
• Betz R.C. и другие.; Являюсь. J. Human Genet. 2006; 78: 510-519
• Рамаекерс Ф.и другие.; Являюсь. J. Pathol. 1990; 136: 641-655
• Yabushita K. et al .; Liver 2001; 21: 50-55
• Chatzipantelis P. et al .; Гепатол. Res. 2006; 36: 182-187
• Galarneau L. et al .; Exp. Cell Res. 2007; 313: 179-194
• Ку Н.-О. и Омари М.Б .; J. Cell Biol. 2006; 174: 115-125
• Lau A.T. и Chiu J.F .; Cancer Res. 2007; 67: 2107-2113
• Linder S. et al; Cancer Lett. 2004; 214: 1-9
• ван Дорст Э.Б.Л. и другие.; J. Clin.