Классический каскад: Стрижка каскад на длинные волосы 2021. Как стричь на разные типы волос и лица — «Семья и Школа»

Организация субъединиц C1 и активация классического пути. ( A ) Доменная структура C1q и C1r. В C1q «Nt» обозначает короткую N-концевую область во всех трех субъединицах C1q, участвующих в дисульфидных мостиках. В C1r ромб обозначает сайт связывания C1q, звездочкой — сайт активации и треугольником — активный сайт. В C1s отсутствует сайт связывания C1q в домене CUB2, но в остальном он имеет ту же структуру домена, что и C1r. ( B ) Неактивированный C1 (слева) с C1r и C1s в состоянии зимогена (серый цвет) присутствует в жидкой фазе и рекрутируется на поверхность активатора, где C1r автоматически активирует и впоследствии активирует C1s.Ниже показаны последующие события, происходящие после активации C1s, начиная с расщепления C4, затем расщепления C2 и заканчивая сборкой конвертазы CP C3.

При связывании C1 с активирующей поверхностью каждая молекула C1r расщепляется другой молекулой C1r, вызывая аутоактивацию. Затем активный C1r расщепляет C1s, после чего C1s может расщеплять свои субстраты C4 с образованием C4b и C4b-связанного C2, что приводит к сборке C3 конвертазы, C4b2a (Fig. 1 B ). Отсутствует подробное понимание активации C1 на основе структуры.ЭМ-изображения с негативным окрашиванием неактивированного C1 были интерпретированы как предполагающие, что центральная часть C1r ₂ s ₂ была расположена внутри конуса, ограниченного коллагеновыми стеблями C1q, тогда как остальные части C1r ₂ s ₂ были расположены внутри конуса. обернуты вокруг коллагеновых стеблей (8). Более поздние модели, учитывающие частичные кристаллические структуры C1r и C1s, предположили, что домены CCP1-CCP2-SP как C1r, так и C1s заправлены в пустоту, ограниченную доменами CUB1-EGF C1r и C1s, стержнями коллагена C1q и gC1q. домены (5, 7).Преобладающие модели активации C1 утверждают, что связывание активатора приводит к конформационной перестройке в стеблях коллагена C1q, которая вызывает структурную реорганизацию ассоциированного C1r ₂ s ₂ , приближая два домена SP C1r достаточно близко, чтобы активировать друг друга (9 , 10). Предполагается, что после активации C1r и последующей активации C1s в том же тетрамере, SP домены C1s становятся доступными для субстратов, C4 и C4b2.

До недавнего времени считалось, что подобный механизм внутримолекулярной активации управляет активацией внутри LP.Однако биохимические данные показали, что активация LP происходит посредством межмолекулярного протеолитического расщепления между доменами SP из димеров сериновой протеазы (MASP), связанных с маннан-связывающим лектином (MBL), расположенных на разных PRM. Роль активирующего гликанового паттерна, следовательно, заключается в создании локальной высокой концентрации комплексов PRM-MASP и в правильной ориентации MASPs относительно друг друга (11). Поддержка этой модели была получена с помощью малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (SAXS) и электромагнитных исследований MBL в комплексе с неактивированным димером MASP-1 (12).Мы намеревались исследовать, способствует ли структура комплекса C1 межкомплексной протеолитической активации или действительно совместима с внутрикомплексной активацией C1, как предполагает преобладающая модель.

Результаты

C1r

Чтобы получить структурное представление о состоянии раствора C1r ₂ с ₂ , мы собрали данные синхротронного МУРР для тщательно очищенного рекомбинантного C1r ₂ с ₂ (рис.2 A ) с мутацией S / A в обеих протеазах, делающей тетрамер неактивным ферментом. Анализ Гинье показал линейный график для C1r ₂ с ₂ в диапазоне концентраций 1,0–6,8 мг / мл, но со слегка устойчивым увеличением значений R _г . Мы экстраполировали данные до 0 мг / мл и создали объединенный набор данных из экстраполированных данных и данных, зарегистрированных при 6,8 мг / мл (рис. 2 E и F и рис. S1 A ). Для последующих шагов мы использовали объединенные данные с q <2.5 нм ^-1 [ q = (4 × π × sin θ) ÷ λ, где 2θ — угол рассеяния]. График Кратки данных показал, что C1r ₂ s ₂ хорошо сложен и имеет ограниченную гибкость (рис. S1 B ). Функция распределения парных расстояний (P (r)) показала, что D _max для частицы чуть ниже 45 нм (рис. 2 F ), что является непосредственным свидетельством против компактной конформации тетрамера. Для получения структуры решения тетрамера C1r ₂ s ₂ на основе МУРР мы использовали твердотельное моделирование, исходя из моделей тетрамера на основе известных подструктур C1r и C1s (рис.S1 C ). Ядро моделей тетрамера образовано доменом CUB1-EGF из двух молекул C1s, связанных двойной осью вращения, каждая из которых окружена доменами CUB1-EGF из C1r (рис. 3 A и B ). Наилучшие результаты с точки зрения соответствия экспериментальным данным и внутренней согласованности между результирующими моделями были получены при разделении как C1r, так и C1s на четыре твердых тела, состоящих из CUB1-EGF, CUB2, CCP1-CCP2 и области SP. Модели из 50 уточнений твердого тела были разделены на две группы в соответствии со значениями χ ² их соответствия данным.Основная группа из 43 моделей соответствовала данным МУРР с χ ² = 1,78 ± 0,05, тогда как остальные семь моделей имели χ ² 2,60 ± 0,15. Выходные модели в основной группе были довольно похожи с доменами CCP1-CCP2-SP, изогнутыми в обе стороны от плоскости, по сравнению с довольно плоской начальной моделью (рис. 3 B и C ). Удаление гликанов из входной модели привело к 10 моделям с χ ² = 3,56 ± 0,45, показывая, что гликаны внесли значительный вклад в сопоставление моделей с данными, хотя 12 Asn-связанных гликанов составляют менее 10% от общего количества гликанов. общая молекулярная масса тетрамера.Важно отметить, что модели, полученные в отсутствие гликана, были аналогичны моделям, полученным с включенными гликанами. Модель с наименьшим χ ² = 1,68, которая является репрезентативной, показана на рис. 3 D и соответствует данным на рис. 2 E . Домены SP как от C1r, так и от C1s выступают из центрального тетрамерного интерфейса CUB1-EGF. Каталитические центры двух SP-доменов C1r разделены на 39 нм, тогда как центры C1s находятся на расстоянии 28 нм друг от друга.Сайт активации в одной молекуле C1r находится на расстоянии 37 нм от активного центра во второй молекуле C1r.

Очистка и сбор данных SAXS для C1r ₂ s ₂ и C1. Окрашенные серебром гели SDS / PAGE фракций от препаративной очистки С1 и его компонентов в градиенте плотности сахарозы. ( A ) Комплекс C1r ₂ s ₂ был рекомбинантным, а активный сайт S / A мутировал для предотвращения аутоактивации. C1r имеет примерно 80 кДа, а C1s чуть ниже примерно 77 кДа.( B ) C1q, очищенный из сыворотки крови человека, обратите внимание, что C1qA и C1qB объединяются в верхней полосе, тогда как C1qC мигрируют с более низкой молекулярной массой. ( C ) Выделение восстановленного C1, образованного смешиванием C1q с избытком C1r ₂ с ₂ . Образцы из A, — C были восстановлены перед SDS / PAGE. Фракции, используемые для экспериментов SAXS и EM, обозначены пунктирными линиями. ( D ) SEC на Superose 6 10/300 GL очищенных градиентом сахарозы C1q, C1r ₂ s ₂ и комплекса C1.( E ) Экспериментальная кривая рассеяния (черная) в сравнении с кривой, рассчитанной (серая) для модели C1r ₂ s ₂ , показанной на рис. 3 D . ( F ) Распределение парных расстояний предполагает, что C1r ₂ s ₂ имеет протяженность 45 нм. ( G ) Экспериментальная кривая рассеяния (черная) в сравнении с кривой, рассчитанной (серая) по модели C1, показанной на рис. 4 C . ( H ) Распределение парных расстояний предполагает, что длина C1 составляет 37 нм.

SAXS и отрицательная окраска EM предполагают сильно вытянутую структуру C1r ₂ s ₂ . ( A ) Схематическое изображение доменов внутри C1r ₂ s ₂ . ( B ) Стартовая модель тетрамера C1r ₂ s ₂ для доработки твердого тела. ( C ) Все 43 конструкции, полученные из твердого тела, изогнуты, но имеют примерно равную вероятность изгиба в противоположных направлениях относительно центральной плоскости.( D ) Жесткая конструкция с наилучшим соответствием данным. ( E ) Отрицательная окраска ЭМ C1r ₂ с ₂ тетрамера. Верхний показывает восемь выбранных средних значений класса C1r ₂ с ₂ . Комплекс имеет удлиненную форму с центральным расширением и небольшими глобулярными доменами, выступающими на периферии комплекса. Нижний показывает расчетные изображения проекции модели SAXS из D с использованием того же масштабирования, что и для средних значений класса.Для каждого среднего класса вручную назначалось аналогичное проекционное изображение. (Масштаб: D , 5 нм; E , 50 нм.)

SAXS-анализ C1r ₂ с ₂ . ( A ) График Гинье объединенных данных C1r ₂ s ₂ . Остаточный график показан на Справа . ( B ) График Кратки данных предполагает, что C1r ₂ s ₂ является жесткой и сильно свернутой молекулой. ( C ) Схематическое изображение в том же стиле, что и на рис.3 A , описывающий процесс создания начальной модели C1r ₂ s ₂ . Указываются записи PDB, используемые для различных шагов, как описано в SI методы . ( D ) Альтернативная входная модель, в которой молекула C1r транслируется на 27 Å по горизонтали по сравнению с входной моделью, показанной на рис. 3 B . Внизу наложены выходные модели из 10 доработок твердого тела. ( E ) То же, что и C , но с переводом 54 Å.

Мы не знаем, как тандем C1r-доменов CUB1-EGF взаимодействует с их эквивалентом C1s в ядре тетрамера, и C1r ₂ с ₂ может иметь другую структуру в растворе, чем в качестве компонента комплекса C1. . Поэтому мы также исследовали две альтернативные модели тетрамера, в которых C1r транслировался на 27 Å и 54 Å (рис. S1 D и E ) в плоскости, определяемой димером C1s CUB1-EGF, по сравнению с первой исходной моделью, где Схема C1r-C1s CUB1-EGF была основана на тетрамере C1s CUB1-EGF, образованном кристаллической упаковкой (3).Уточнения с твердым телом дали средние значения χ ² 1,68 ± 0,04 и 1,34 ± 0,16 для 27 и 54 Å трансляции C1r соответственно для 10 прогонов CORAL в каждом случае. Следовательно, с точки зрения подгонки экспериментальных данных обе модели с трансляцией C1r были лучше, чем модели, полученные из нетранслированной исходной модели. Однако полученные ансамбли моделей были структурно более разнообразными, что, возможно, отражает то, что точки шарнира C1r располагались дальше от центра молекулы и часто приводили к скрученным тетрамерам (рис.S1 D и E ). Расположение сайтов связывания коллагена в доменах CUB также оказалось плохо совместимым со связыванием C1q. Тем не менее, широкое разделение областей SP было аналогично выходным моделям, полученным из нетранслируемой исходной модели. В целом, исследования раствора C1r ₂ s ₂ показывают, что SP-домены двух молекул C1r широко разделены в тетрамере.

Чтобы подтвердить наш анализ SAXS, мы выполнили одночастичную электронную микроскопию на C1r ₂ s ₂ .Мы записали негативные изображения пятен комплекса C1r ₂ s ₂ в условиях низкого напряжения (60 кВ) для достижения оптимального контраста. Кроме того, мы выбрали области образца с типичным внешним видом одного углеродного слоя, чтобы избежать эффекта сплющивания от дополнительных углеродных пленок, покрывающих частицы, которые могут повлиять на кажущийся размер. Мы вычислили средние по классам набора данных о частицах в среднем по 34 изображениям на класс, используя методы несмещенной кластеризации, независимо от какой-либо модели на основе SAXS (рис.3 E , Верхний ). Кластеризация увеличивает отношение сигнал / шум и служит статистическим инструментом, который позволяет отображать повторяющиеся представления частиц. Все средние значения класса показывают частицы с удлиненной формой и средним максимальным размером приблизительно 43 нм в соответствии с D _max 45 нм, наблюдаемым методом SAXS. Частицы демонстрируют центральное расширение и небольшие периферические домены, выступающие из комплекса.

Чтобы сравнить данные EM с моделью SAXS, мы сгенерировали карту плотности из репрезентативной атомарной модели, полученной из SAXS, используя ту же выборку, что и для изображений EM, и вычислили проекционные изображения из этой карты, чтобы проиллюстрировать, как структура SAXS будет появляются в ЭМ под разными углами зрения.Для сравнения между EM и SAXS мы вручную присвоили рассчитанный прогноз для каждого среднего класса (рис. 3 E , Lower ). Сравнение показывает, что полученная методом МУРР модель имеет ту же форму и габаритные размеры, что и частицы, полученные с помощью ЭМ. В целом, модели SAXS и EM соответствуют друг другу до наложенной двойной симметрии в модели SAXS, то есть некоторые средние значения класса EM предполагают отклонение от идеальной двойной симметрии, в частности, во внешних выступах.

C1 — полая частица с SP-доменами, направленными от ядра.

Затем мы исследовали структуру раствора неактивированного C1 с помощью SAXS. C1 был собран путем смешивания C1q, очищенного из плазмы, с очищенным рекомбинантным C1r ₂ (S / A) s ₂ (S / A) тетрамером (рис. 2 A и B ), в котором как C1r, так и C1s были неактивен, потому что серин в каталитической триаде мутировал в аланин. Мы использовали центрифугирование в градиенте сахарозы для отделения восстановленного C1 от несвязанного C1r ₂ с ₂ (рис.2 С ). Данные SAXS регистрировали в режиме реального времени сразу после элюирования C1 из колонки для эксклюзионной хроматографии (SEC). Такой подход позволил нам отделить небольшое количество олигомерного C1 от мономерного C1. Мы выбрали кривые рассеяния от центра пика элюирования для объединения, чтобы оптимизировать отношение сигнал-шум и минимизировать возможный вклад от несвязанных C1q и C1r ₂ (S / A) s ₂ (S / A), элюируемых после комплекс С1. Кроме того, стабильное значение радиуса инерции R _g (рис.S2 A ) выступал против значительной диссоциации C1 в части пика с поздним элюированием, и, что интересно, значение C1 R _g было меньше, чем наблюдаемое для C1rs и C1q (рис. S2 A и S3 и таблица S1). График Гинье для данных C1 был линейным (рис. S2 B ), и для последующего анализа данных мы использовали данные с q <2,5 нм ^-1 . График Кратки данных свидетельствует о том, что C1 — это многодоменный белок с несколькими хорошо сложенными доменами с некоторой гибкостью (рис.S2 C ). Моделирование Ab initio дало модель, имеющую полую форму, похожую на седло, которая несовместима с плотно упакованным ядром, в котором домены протеаз C1r и C1s плотно упакованы в центре C1 (рис. S2 D ).

SAXS-анализ комплекса C1. ( A ) Прямое рассеяние и R _g встроенных данных SAXS для C1 нанесены на график в зависимости от объема элюирования. Серая область отмечает объем, соответствующий кадрам, используемым для дальнейшей обработки.( B ) Линейный график Гинье, рассчитанный на основе встроенных данных SAXS, не показывает никаких признаков агрегации C1 или межмолекулярного отталкивания. Остаточный график показан на Справа . ( C ) График Кратки данных предполагает, что C1 в основном жесткий, но с некоторой внутренней гибкостью. ( D ) Усредненная модель C1 на основе 100 ab initio моделей, рассчитанных с помощью DAMMIN. ( E ) Пример выходной модели твердого тела, в которой фрагменты CCP1-CCP2-SP направлены вверх по сравнению с центральной плоскостью комплекса.

SAXS-анализ C1q. ( A ) Данные рассеяния C1q представлены как I ( q ) в логарифмическом масштабе в зависимости от q . ( B ) График Гинье, рассчитанный по данным SAXS. Остаточный график показан на Справа . ( C ) Функция распределения парных расстояний для C1q, указывающая на частицу с D _max , приближающуюся к 45 нм. ( D ) График Кратки для C1q предполагает, что C1q в основном жесткий, но с некоторой гибкостью внутри молекулы.

Ключевые статистические данные и программное обеспечение, используемое для сбора, обработки, анализа и уточнения данных SAXS

Для выяснения структурного расположения доменов в пределах C1 мы выполнили моделирование твердого тела, предполагая, что центральная двойная ось проходит параллельно оси N. -концевой сегмент коллагеновой ножки C1q. Мы начали с той же модели тетрамера, что и для C1r ₂ s ₂ , за исключением того, что домен SP сформировал единое твердое тело вместе с доменами CCP как для C1r, так и для C1s, а гликаны были опущены для уменьшения вычислительной сложности.Коллагеновые стержни C1q были ограничены доменами CUB C1r ₂ s ₂ (рис. 4 A ). Общим для всех результирующих моделей, полученных с помощью уточнения твердого тела, было полое ядро, которое также наблюдалось при реконструкции ab-initio, с протеазными доменами C1r и C1s, выступающими от ядра. Пятьдесят моделей были разделены на две группы в соответствии с их соответствием экспериментальным данным. В первую группу вошли 44 модели с χ ² = 2,38 ± 0,050, тогда как остальные 6 моделей имели χ ² = 2.6 ± 0,082. В основной группе наблюдался явный поворот тетрамера по сравнению с плоской стартовой моделью тетрамера C1r ₂ s ₂ (рис. 4 B и C ). Как правило, домены протеазы вытягиваются, образуя более длинные и тонкие частицы, перпендикулярные оси симметрии второго порядка по сравнению с исходной моделью. В некоторых моделях протеазные домены C1s и C1r направлены вверх по направлению к N-концевому коллагеновому стержню C1q (Fig. S2 E ).В 4 из 44 моделей протеазные домены занимают ту же общую площадь, что и глобулярные головки C1q. В этих моделях наблюдается сдвиг вверх двух или более глобулярных головок, чтобы компенсировать SP домены C1r ₂ s ₂ , так что массовое распределение между gC1q и SP доменами примерно сохраняется.

SP-домены в неактивированном C1 расположены на периферии молекулы. ( A ) Схематическое изображение доменной структуры молекулы C1 и ограничений, налагаемых во время уточнения твердого тела по данным МУРР.( B ) Входная модель для уточнения. ( C ) Типичная выходная модель со всеми четырьмя доменами SP, расположенными на периферии C1r ₂ s ₂ , расположенных в центральной плоскости C1. ( D ) Средние по классу комплекса С1, полученного при отрицательном окрашивании ЕМ. Типичные средние значения классов показывают 8–10 выступающих глобулярных доменов, расположенных вокруг сети центральных плотностей. Предварительно назначенные глобулярные головки C1q помечены буквой «g», а ориентировочные центры C1q — буквой «h».”( E ) Крио-ЭМ комплекса С1. Столбцы 1 и 3 показывают средние значения криогенного класса для образца, а столбцы 2 и 4 — вычисленные проекционные изображения модели SAXS. Каждому среднему классу вручную назначается проекционное изображение с аналогичным контуром. Несмотря на более сильное размытие, вызванное дефокусом, все еще можно различить от шести до девяти выступающих глобулярных доменов, и имеется хорошее общее согласие модели SAXS с данными крио-ЭМ. (Масштабные линейки: C, , 5 нм; E , 50 нм.)

Небольшая группа моделей выпуска гораздо более разнородна, но в целом наблюдаются одни и те же особенности. Мы наблюдаем ту же ориентацию SP-доменов, где они могут быть либо в центральной плоскости, направленными вверх, но никогда не упаковываться внутри центральной пустоты, ограниченной коллагеновыми стержнями, глобулярными головками C1q и доменами CUB1-EGF C1r. ₂ с ₂ . Чтобы подтвердить, что входная модель не повлияла на наши результаты, мы провели еще 50 уточнений твердого тела, в которых домены CCP C1r и домен SP были свернуты в ядро ​​C1, аналогично преобладающей модели зимогена C1r (10), с незначительными изменениями. регулировки из-за геометрических ограничений (рис.S4 A ). Во всех результирующих выходных моделях с твердым телом домены C1r CCP1-CCP2-SP отклонялись от ядра, чтобы указывать от ядра, как это видно с первой входной моделью (рис. S4 B ).

Уточнение твердого тела C1, начиная с фрагмента C1r CCP1-CCP2-SP, помещенного внутри центральной полости. ( A ) Входная модель для уточнения с фрагментами C1r CCP1-CCP2-SP, помещенными внутри центральной полости. ( B ) Типичная выходная модель со всеми четырьмя доменами SP, расположенными на периферии C1r ₂ s ₂ , расположенных в центральной плоскости C1, показывая, что конформация C1r во входной модели не оказывала существенного смещения на выходные модели. при доработке твердого тела.

Мы также записали негативные изображения пятен молекул C1 в тех же условиях, что и для C1r ₂ s ₂ . И снова мы выбрали области образца с типичным внешним видом одного углеродного слоя, чтобы избежать эффекта сглаживания. Мы сгруппировали результирующий набор данных в среднем по 28 изображений на класс, используя методы беспристрастной кластеризации, независимо от какой-либо модели SAXS. Полученные средние значения по классам показывают максимальные размеры 32–36 нм (рис. 4 D ), что немного ниже, чем у D _max , полученного с помощью SAXS.Согласно преобладающим представлениям, 8–10 глобулярных доменов расположены вокруг центральной сети плотностей. Центральные части отрицательно окрашенных средних значений класса выглядят довольно темными, что может быть объяснено накоплением пятен ионов тяжелых металлов в этой области. Это конкретное поведение окрашивания, таким образом, согласуется с довольно полой структурой частицы, как предполагают как моделирование методом SAXS ab-initio, так и моделирование твердого тела.

При сравнении средних значений класса EM с репрезентативной моделью SAXS комплекса C1, модель SAXS предсказывает до 10 глобулярных доменов, которые выступают из ножки C1 на видах сверху / снизу C1.Кроме того, модель SAXS предсказывает виды сбоку, где ступица C1q рассматривается как одна из выступающих областей (сравните Рис. 4 C , Левый , например, с верхним выступом, обозначенным «h» на Рис. 4 D ). Среднее значение класса ЭМ с 10 отдельными шаровидными выступами показано в строке 3, вид 3 на рис. 4 D . Тем не менее, большинство средних значений по классам показывает от восьми до девяти различимых периферийных областей. Для интерпретации видов с менее чем 10 выступающими доменами важно отметить, что в некоторых проекционных видах некоторые домены могут накладываться друг на друга и, таким образом, маскироваться в средних значениях класса.

Мы интерпретировали средние по классам, где все выступающие домены выглядели как небольшие округлые плотности на виде сверху / снизу (Рис.4 D ), что означает, что центральные плотности могут представлять собой перекрытия концентратора C1q с центральными частями C1r ₂ с ₂ . Частое появление видов сверху / снизу можно объяснить предпочтительным связыванием глобулярных доменов C1q с углеродной пленкой. Расстояния между глобулярными доменами, по-видимому, несколько изменчивы, что указывает на определенную степень конформационной изменчивости.Такая изменчивость не отражена в моделях SAXS, где была наложена двойная симметрия, чтобы минимизировать количество твердых тел, чтобы уменьшить переобучение и вычислительную сложность.

Хотя уровень детализации не позволяет различать головные домены C1q и домены C1r ₂ s ₂ SP, средние значения классов, полученные нами для C1 в отрицательной окраске, сильно противоречат компактной конформации C1r ₂ s ₂ в комплексе. Такая компактная конформация C1 приведет к появлению проекционных видов, показывающих до шести выступающих доменов, в зависимости от угла обзора и степени наложения (2).Более того, противоположные глобулярные домены обычно были разделены прогнозируемым расстоянием по крайней мере 29 нм, что также свидетельствует в пользу довольно большого расстояния между C1r ₂ s ₂ SP доменами в комплексе C1.

Для дальнейшего исследования указанной модели C1 мы также выполнили естественную крио-ЭМ (рис. 4 E , столбцы 1 и 3). Особая проблема заключалась в низком контрасте комплекса C1 в криогенных условиях, что можно объяснить крайне разреженной плотностью белка в этом комплексе, поскольку масса всего 774 кДа распределена в сфере диаметром 38 нм.Для сравнения, комплекс C1 более чем на 50% больше прокариотической рибосомы по размеру, но содержит только ∼1 / 3 ее массы. Мы использовали сильно разбавленные образцы C1, чтобы свести к минимуму агрегацию, в результате чего на одну экспозицию приходилось примерно 1–10 частиц. Средние значения крио-класса (рис. 4 E ) составляют 65 изображений на класс. Поскольку криоизображения получают при более высокой расфокусировке по сравнению с отрицательно окрашенными частицами, наблюдается несколько большее размытие, что, в свою очередь, означает, что отдельные глобулярные домены могут казаться наложенными.Тем не менее, мы смогли различить от шести до девяти выступающих областей в большинстве средних по классам (рис. 4 E , столбцы 1 и 3). Более того, угловое распределение изображений оказалось более равномерным, чем в данных по отрицательному окрашиванию, что привело к среднему диаметру ~ 38 нм в средних значениях криокласса. Что касается комплекса C1r ₂ s ₂ , мы преобразовали репрезентативную модель C1 SAXS в карту плотности с одинаковым масштабом и рассчитали проекции под разными углами обзора (рис.4 E , столбцы 2 и 4). Опять же, вычисленный прогноз был вручную назначен каждому среднему классу. В этом сравнении можно увидеть, что имеется хорошее общее согласие в общих чертах средних по классам и назначенных прогнозах SAXS. Однако точное положение отдельных глобулярных доменов может варьироваться между средними значениями класса EM и единственной моделью SAXS, используемой здесь для проекции. Эти несоответствия могут возникать из-за структурной неоднородности C1, а индивидуальная гибкость компонентов C1q и C1r ₂ s ₂ может привести к значительному отклонению от двойной симметрии, принятой для моделирования твердого тела методом SAXS.Такая конформационная гибкость хорошо согласуется с вариациями, обнаруженными между различными моделями SAXS, которые мы вычислили, как описано выше.

Обсуждение

Структурные данные, представленные здесь, противоречат общепринятой структуре комплекса C1, где тетрамерный C1r ₂ s ₂ свернут внутри стеблей C1q. Автоактивация, происходящая между двумя молекулами C1r, заключенными в одну молекулу C1, кажется невозможной из-за разделения их SP-доменов, которые мы наблюдаем для неактивированного C1 как в растворе, так и в электронной микроскопии.Мы также наблюдаем, что несвязанный C1r ₂ s ₂ сильно расширен, что еще раз доказывает против компактной конформации C1r ₂ s ₂ , когда-то связанной внутри C1. Самым простым решением загадки активации, по-видимому, является то, что зимоген C1r в одном комплексе C1 активируется с помощью C1r в соседнем комплексе C1. Наше исследование не позволяет исключить, что C1r активирует соседний зимоген C1s в той же молекуле C1. На обоих концах тетрамера протеазы SP-домены одного C1r и одного C1s будут присутствовать рядом друг с другом.Однако периферическое расположение активного сайта на дальнем конце домена SP C1r оказывается лучше совместимым с активацией C1s в соседней молекуле C1 по сравнению с активацией C1s, принадлежащих той же молекуле C1. Для решения этого вопроса, вероятно, потребуются сложные кинетические исследования с использованием нескольких вариантов C1r и C1s и модельной системы, в которой обмен C1r и C1s между тетрамерами находится под строгим контролем.

Поскольку первая стадия активации C1 является межкомплексной реакцией, основная роль активатора состоит в том, что он объединяет молекулы C1 и ориентирует SP-домены в соседних молекулах C1 примерно в плоскости, обеспечивая активацию между C1.Этот механизм был бы похож на тот, который мы показали для лектинового пути (11). Это предположение также согласуется с выводом о том, что gC1q-специфическое mAb и его фрагмент F (ab ‘) ₂ способны активировать C1 в жидкой фазе посредством агрегации C1q (13). Кроме того, подтверждая, что связывание C1 в правильной ориентации при определенной плотности достаточно для активации CP, фрагменты биспецифических антител, диатела фрагментов scFv, специфичных для gC1q и лизоцима, были способны нацеливать C1 на покрытые лизоцимом эритроциты и вызывать их лизис (14 ).Оба результата, по-видимому, совместимы с моделью межкомплексной активации, а не с внутрикомплексной активацией.

Постоянно растущий список природных активаторов CP также является сильной стороной в пользу механизма межкомплексной активации. Связывание C1q в основном регулируется электростатическим взаимодействием между gC1q и более чем 100 установленными лигандами (15). Не все способны активировать комплемент, но структурно неродственные лиганды, такие как IgG / IgM, C-реактивный белок, gC1qR и ассоциированные с болезнью Альцгеймера олигомеры Aβ, и многие другие, активируют классический путь (16).Преобладающая модель внутрикомплексной активации довольно сложна механически и ее трудно согласовать с таким большим количеством разнообразных активаторов.

Преобладающая модель для комплекса C1 основана на более старых отрицательных исследованиях ЭМ окрашивания C1 и C1r ₂ с ₂ , взаимодействия C1r – C1r, наблюдаемые в упаковке кристаллов (2, 9, 10) и масс-спектрометрическом анализе ( 5). Эта модель предполагает, что CCP1-CCP2-SP домены C1r и C1s плотно упаковываются в центре C1. Также предполагается, что активация C1 является внутримолекулярной реакцией, вызываемой конформационными изменениями, распространяющимися через стебли коллагена C1q при связывании активатора.Помимо наших структурных исследований, представленных здесь, есть дополнительные аргументы против преобладающей модели: во-первых, насколько нам известно, нет прямых экспериментальных данных, показывающих, что связывание активатора вызывает конформационные изменения в стеблях коллагена C1q. Во-вторых, взаимодействия упаковки кристаллов между двумя C1r фрагментами CCP1-CCP2-SP, в которых SP домен одной молекулы контактирует с доменом CCP1 во второй, как предполагается, отражают взаимодействия C1r – C1r в неактивированном C1 (2, 9, 10). Однако важность контакта с кристаллами in vivo никогда не подтверждалась мутациями в C1r.В-третьих, предполагаемая компактная конформация C1, лежащая в основе преобладающей модели, никогда не наблюдалась однозначно другими (2). В-четвертых, для активации C1q-связанного C1r необходимы домены C1s CUB1-EGF-CUB2, но не домены C1s CCP1-CCP2-SP (17, 18). Этот результат был бы странным, если бы домены C1s и их эквиваленты C1r были плотно упакованы в центре комплекса C1, но он легко совместим с доменами C1r и C1s SP, отходящими от центра. В-пятых, предполагаемая компактная конформация C1 также потребует, чтобы домен C1r CUB2 принял сильно изогнутую или частично развернутую конформацию, чтобы одновременно участвовать во взаимодействии со стеблем коллагена C1q и позволить доменам CCP1-CCP2-SP располагаться в ядре C1.В-шестых, масс-спектрометрическое количественное определение доступности лизина в C1r ₂ s ₂ в качестве свободного тетрамера по сравнению с включением в C1 предположило, что несколько лизинов в домене C1s SP защищены при включении в C1, что было принято в качестве доказательства в поддержку компактной модели C1, лежащей в основе внутримолекулярной активации (5). Однако это различие также может быть связано с введением тетрамера в C1, что, скорее всего, изменит динамические свойства C1s и его SP-домена и, по-видимому, также приведет к более компактной организации тетрамера, как показано нижним номером D . _max значение для C1 по сравнению со свободным тетрамером.

Наши результаты не исключают конформационного изменения C1 при связывании активатора. Такое изменение может фактически изменить как доступность, так и конформацию доменов C1r ₂ s ₂ SP и способствовать межкомплексной активации. Решающее различие между преобладающей моделью и моделью, которую мы представляем, заключается в конформации неактивированного C1 в жидкой фазе. Наши структурные исследования проводились с помощью двух дополнительных методов, один из которых, SAXS, непосредственно касается конформации жидкой фазы.Эти исследования показывают, что C1r ₂ s ₂ , как несвязанный, так и присутствующий в неактивированном C1, является удлиненным, а не компактным по отношению к доменам SP. Недавние исследования крио-ЭМ томографии C1, связанного с гексамерной платформой IgG, вероятно, представляют активированное состояние C1. Здесь также предполагается, что домены C1r ₂ s ₂ CCP1-CCP2-SP выступают из центра молекулы C1 (19).

Очевидной стратегией различения межмолекулярной и внутримолекулярной активации C1 является исследование кинетики реакции.Тетрамер C1r ₂ s ₂ дикого типа может медленно активироваться спонтанно, но активация ускоряется за счет образования комплекса C1, и быстрая активация происходит при связывании с иммунными комплексами, содержащими IgG (17, 20). Кинетика активации C1 чрезвычайно сложна, поскольку она включает связывание C1 с активатором, автоактивацию C1r и последующую активацию C1s с помощью C1r, возможно, сопровождаемую конформационными изменениями в сложном комплексе C1. Упрощенная модель предполагает, что преобразование неактивированного C1 в активированный C1 имеет один общий этап ограничения скорости.Одно исследование в пользу внутримолекулярной активации C1 поддерживает кинетику первого порядка для спонтанной активации C1 в растворе в отсутствие активатора с t _1/2 4 и 7 минут при 37 и 30 ° C, соответственно ( 21). Здесь C1 был восстановлен из субъединиц, полученных из сыворотки. Однако другое исследование не показало измеримой активации жидкой фазы восстановленного C1 через 20 минут, если не присутствовали значительные количества олигомеров или мономеров IgG (22). Третье исследование с использованием агрегатов антиген-антитело в качестве активатора также показало слабую активацию восстановленного C1 в отсутствие иммунных комплексов (17).Четвертое исследование с использованием C1, очищенного непосредственно из свежей плазмы, показало только медленную активацию в отсутствие иммунного комплекса (23). Позже было высказано предположение, что небольшие количества загрязняющих активных протеаз (включая активированные C1 и C1r) могут способствовать очевидной активации C1 первого порядка (24, 25). В целом, существующие кинетические данные по активации C1 не могут различить две модели активации.

В заключение, наши структурные исследования показывают, что первая стадия активации C1 включает отщепление зимогена C1r в одном комплексе C1 с помощью C1r из соседнего комплекса C1, в то время как дополнительные данные необходимы, чтобы решить, происходит ли активация C1s с помощью C1r также между комплексами C1.Наши результаты привели нас к предложению универсальной модели активации, происходящей через родственный лектин и классический путь комплемента. Выяснение структуры и функции важно для будущего дизайна терапевтических стратегий вмешательства, направленных на стимуляцию или ингибирование активации комплемента. Комплемент-зависимые антитела, индуцирующие цитотоксичность, используемые в терапии рака, основаны на том, что их сегмент Fc организован в олигомеры, с которыми может связываться C1, и усиление нацеливания C1 на раковые клетки является проверенной стратегией (26).В сочетании с вышеупомянутыми существующими экспериментальными данными, показывающими, что привязки C1 к мишени достаточно для индукции активации CP, наши результаты подтверждают, что IgG-независимое нацеливание C1 на раковые клетки или патогены является жизнеспособной стратегией.

Методы

C1q очищали из плазмы, тогда как рекомбинантный C1r ₂ s ₂ , оба несущие мутации S / A в обеих протеазах, экспрессировались в клетках HEK293-F. Восстановленный комплекс C1 очищали ультрацентрифугированием в градиенте сахарозы.Данные SAXS для C1r ₂ s ₂ и C1q были собраны в пакетном режиме на ESRF BM29, тогда как данные Superose 6 SEC inline SAXS для комплекса C1 были собраны на Petra P12. Начальные модели для твердотельного уточнения C1r ₂ s ₂ и C1 были построены из доступных подструктур, имеющихся в банке данных по исследованиям структурной биоинформатики. Для приготовления образцов EM с отрицательным окрашиванием для C1r ₂ с ₂ использовали фракцию пика из колонки SEC Superdex 200, тогда как для C1 комплекс сначала очищали центрифугированием в градиенте сахарозы, а затем SEC на Superose 6. столбец.Сетки получали на микроскопе Tecnai T12. Для крио-ЭМ анализа C1 очищали градиентом сахарозы и SEC, разбавляли и адсорбировали на сплошной углеродной пленке. После замораживания в жидком этане образцы визуализировали на Titan Krios EM (FEI), оборудованном камерой Gatan US4000, работающей при 200 кВ. Полные экспериментальные детали представлены в SI Methods .

Методы SI

Экспрессия и очистка белков.

Гены в соответствии с последовательностью для C1r (NM_001733.4) и C1s (NM_201442.2) были синтезированы GenScript Inc. USA. Синтезированные гены клонировали в вектор pcDNA3.1 / myc-His (-) A (Invitrogen) с использованием сайтов рестрикции EcoRI / XbaI. Неактивные C1r и C1s были получены путем мутации активного серина каталитической триады в C1r (S637A) и C1s (S632A). Линию клеток эмбриональной почки человека HEK293-F (Invitrogen) использовали для временной экспрессии рекомбинантных неактивных версий C1r и C1s. Клетки HEK293-F выращивали в среде, не содержащей белков (FreeStyle 293 Expression Medium; Gibco), при перемешивании при 37 ° C и 8% CO ₂ .Трансфекцию проводили с использованием PEI (25 кДа; Polysciences) в качестве реагента для трансфекции в соотношении PEI: ДНК 3: 1. После трансфекции клетки выращивали в течение 4–5 дней, а супернатанты собирали после центрифугирования.

C1 и C1r

Тетрамер C1r ₂ (S637A) C1s ₂ (S632A) очищали согласно Bally et al. (7), тогда как C1q был очищен из сыворотки согласно Tenner et al. (27). Для восстановления C1, C1q смешивали с молярным избытком C1r ₂ s ₂ и загружали градиентом сахарозы 10–30% (мас. / Об.) В 50 мМ EPPS (4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинпропансульфоновая кислота). кислота) (pH 8.5), 145 мМ NaCl, 3 мМ CaCl ₂ и центрифугировали в роторе TH-660 (Sorvall, ThermoFisher Scientific) при 185 795 × g в течение 17 ч при 4 ° C. После ультрацентрифугирования фракции собирали со дна центрифужной пробирки с помощью перистальтического насоса и анализировали с помощью SDS-PAGE. Перед поточным SAXS-анализом C1 его диализовали против 50 мМ EPPS (pH 8,5), 145 мМ NaCl, 3 мМ CaCl ₂ и концентрировали непосредственно перед измерениями SAXS. C1r ₂ с ₂ и C1q очищали, как C1, в градиенте сахарозы 10–30% (мас. / Об.) В 50 мМ трис-HCl (pH 7.4), 145 мМ NaCl, 3 мМ CaCl ₂ . Перед сбором данных SAXS образцы диализовали против 50 мМ Tris⋅HCl (pH 7,4), 145 мМ NaCl, 3 мМ CaCl ₂ и концентрировали непосредственно перед измерениями SAXS.

Сбор и обработка данных SAXS.

Данные для C1r ₂ с ₂ и C1q были собраны в пакетном режиме (от 1,0 до 6,8 мг / мл) на канале ESRF BM29 с использованием пиксельного детектора PILATUS 1M и λ = 0,992 Å при температуре -контролируемый капилляр при 4 ° C.Расстояние от образца до детектора составляло 2,867 м, охватывая диапазон передачи импульса 0,004 < с <0,5 Å ⁻¹ [ q = (4 × π × sin θ) ÷ λ, где 2θ — угол рассеяния]. Для комплекса С1 проводную эксклюзионную хроматографию методом SAXS проводили на канале PETRA III / EMBL P12 с использованием колонки Superose 6 10/300 GL, уравновешенной 50 мМ EPPS (pH 8,5), 145 мМ NaCl, 3 мМ CaCl. ₂ . Скорость потока составляла 0,3 мл / мин. Данные регистрировали при 20 ° C с использованием пиксельного детектора PILATUS 2M (DECTRIS) и λ = 1.240 Å. Расстояние от образца до детектора составляло 3,0 м, покрывая 0,002 < с <0,48 Å ^-1 . Каждый кадр охватывает экспозицию продолжительностью 0,995 с, выполняемую каждую секунду во время прогона SEC. Нормализация и радиальное усреднение проводились на канале пучка с помощью автоматизированного трубопровода (28, 29). Обработку данных для получения сокращенного профиля рассеяния с вычитанием из буфера проводили с помощью следующих стандартных методов (30). Фоновые данные и данные C1 были получены для кадров 3800–3900 и 1851–1950 соответственно.

SAXS Ab Initio Моделирование и уточнение твердых тел.

В тетрамере C1r ₂ s ₂ две молекулы C1s расположены по центру с одной молекулой C1r снаружи каждой молекулы C1s (2, 3). Входная модель для CORAL усовершенствования тетрамера C1r ₂ s ₂ была построена в три этапа (рис. S1 C ). Во-первых, фрагменты CCP1-CCP2-SP были сконструированы путем комбинации структур зимогена C1r (коды PDB ID 1GPZ и 1MD7), тогда как для зимогена C1s использовали код 4J1Y.Во-вторых, тетрамер CUB1-EGF был сконструирован на основе тетрамера кристаллической упаковки в структуре фрагмента C1s CUB1-EGF-CUB2 (идентификационный код 4LMF), предложенного для представления возможной модели для C1r ₂ s ₂ CUB1- Тетрамер EGF (3). Домены C1r CUB1 и CUB2 были смоделированы с помощью phenix.sculptor (31), исходя из структуры Ca ²⁺ , связанного с C1s CUB1-EGF-CUB2 (ID-код 4LOR). Затем эти модели были объединены со структурой домена C1r EGF (идентификационный код 1APQ).В идентификационном коде 4LMF домен CUB2 изгибается из плоскости тетрамера CUB1-EGF. Мы смоделировали приблизительную ориентацию в плоскости как C1r, так и C1s доменов CUB2 по сравнению со структурой MAP-1 (ID код 4AQB), которая лучше совместима с одновременным связыванием коллагеновых стеблей как с доменами CUB1, так и с CUB2. На третьем этапе модель тетрамера C1r ₂ s ₂ была дополнена комбинацией тетрамера CUB1-EGF-CUB2 с фрагментами CCP1-CCP2-SP C1r и C1s с использованием структуры C1s CUB2-CCP1- Фрагмент CCP2 (идентификационный код 4LOT) в качестве ориентира.Наконец, меньшие отсутствующие области в этой модели тетрамера были смоделированы вручную в программе «O» (32), и два Asn-связанных гликана на C1s и четыре на C1r были смоделированы, как описано (33). Однако, поскольку пространственное соотношение между доменами C1r CUB1-EGF и соответствующими доменами из C1s неизвестно, мы также построили две альтернативные стартовые модели с 27 и 54 Å трансляциями в плоскости C1r относительно фиксированного C1s (рис. S1 ). D и E ).

Каркас и β-атомы углерода стеблей коллагена C1q были смоделированы с использованием интерактивного скрипта построения коллагена Triple-Helical (THe BuScr) (34).Коллагеновый стержень C1q моделировали в виде двух отдельных частей, причем один фрагмент состоял из аминокислот до перегиба, а другой — из аминокислот после перегиба. Цепи были смоделированы с глицином цепи А, водородным связыванием со следующей аминокислотой в трипептидной единице в цепи С, глицином цепи С водородной связью с цепью В и глицином цепи В водородной связью с цепью А, как описано в исх. 4. Полноатомная модель была получена из основной цепи и модели β-углерода с использованием библиотеки ротамеров боковой цепи (35) с последующим добавлением гидроксипролинов с THe BuScr.В последней модели коллагенового стержня C1q коллагеновый стержень после перегиба был добавлен в виде двух отдельных частей, чтобы обеспечить лучшую сольватацию в CORALXL. Изгиб не моделировался в деталях, вместо этого две части C1q удерживались вместе двумя ограничителями расстояния, чтобы обеспечить гибкость угла между двумя стержнями. Наконец, полная молекула C1 была собрана путем размещения остатков лизина в стеблях коллагена C1q, которые, как известно, важны для взаимодействия, близко к сайтам кальция в доменах CUB1 и CUB2 в доменах C1r и CUB1 C1s (7), чтобы установить начальную геометрию для взаимодействия. между стержнем коллагена и доменами CUB, как это наблюдается в ID-кодах 4LOR (C1s CUB1-коллаген) и 3POB (MASP-1 CUB2-коллаген).Только модель тетрамера C1r ₂ s ₂ с трансляцией C1r 0 Å использовалась, поскольку для последующего размещения коллагеновых стержней на домены CUB в двух моделях с трансляциями C1r было обнаружено, что требуется плотная кластеризация коллагеновых стержней. на противоположных концах тетрамера CUB1-EGF-CUB2.

Уточнения твердого тела были выполнены с использованием диапазона данных в диапазоне с <0,25 Å ⁻¹ с CORALXL, заказной версией CORAL (36), допускающей 30 твердых тел и 1000 ограничений расстояния, составленных Максимом. Петухов на ЕМБЛ в Гамбурге.Операция двойной симметрии была применена с использованием симметрии P2 к входным моделям, чтобы минимизировать количество твердых тел. Ограничения расстояния использовались для поддержания границы раздела между связанными с симметрией доменами C1s CUB1-EGF поперек оси двойного вращения. Для C1r ₂ s ₂ были применены три ограничения расстояния, тогда как для C1 использовалось 28 ограничений. Несколько значений этих ограничений (связность и расстояние) были протестированы перед окончательными уточнениями и оценены на основе внутренней согласованности между полученными моделями и биологической значимости.Типичная выходная модель и данные, используемые для уточнения твердого тела, хранятся в SASBDB как для C1r ₂ s ₂ , так и для комплекса C1 (Таблица S1). Графики были подготовлены с помощью GraphPad Prism 5.03. Объем Porod определялся с помощью собственного программного обеспечения, написанного J.S.P. Выражение Гинье было подогнано к нижней части данных — q для определения I (0), а закон Порода I ( q ) ∝ q ^{— 4} с добавленной константой был приспособлен к части high- q , чтобы определить константу, которую нужно вычесть из данных, чтобы они соответствовали закону Порода.Инвариант Порода был рассчитан путем численного интегрирования экспериментальных данных, умноженных на q ² с соответствующими экстраполяциями на q = 0 и q = ∞.

ЭМ.

Для отрицательного окрашивания EM комплекса C1r ₂ s ₂ , фракция пика по результатам эксклюзионной хроматографии на 24-мл колонке Superdex 200 (GE Healthcare), уравновешенной 10 мМ Hepes (pH 7,4), 150 мМ NaCl и 3 мМ CaCl ₂ разбавляли соответствующим образом.Углеродную пленку, приготовленную на слюде, флотировали на свежеприготовленном образце в течение 2 мин, а сетки готовили по сэндвич-методу (37). Чтобы приготовить образцы C1 для EM и крио-EM с негативным окрашиванием, комплекс C1 подвергали центрифугированию в градиенте сахарозы, как описано выше для приготовления образца SAXS. Фракции, содержащие комплекс C1 (рис.2 C ), подвергали SEC на колонке Superose 6 10/300 GL, уравновешенной 50 мМ EPPS (pH 8,5), 145 мМ NaCl, 3 мМ CaCl ₂ и Пиковая фракция была приготовлена ​​в соответствии с сэндвич-методом для ЭМ с отрицательным окрашиванием.Сетки были получены с помощью микроскопа Tecnai T12 (FEI / Thermo Fisher Scientific) при комнатной температуре при высоком напряжении 60 кВ на камере Gatan Multiscan 794 CCD (Gatan) при номинальном увеличении 42000 ×, что привело к размеру пикселя 4,2 Å. на пиксель. Для C1r ₂ с ₂ использовалась расфокусировка от -1,5 до -2,1 мкм. В общей сложности 7,551 частицы были вручную отобраны из изображений, скорректированы на расфокусировку (38) и сгруппированы, как описано (12), в среднем по 34 изображениям на класс. Для комплекса C1 расфокусировка -1.От 2 до -1,4 мкм было выбрано 14 331 частицы и сгруппированы в среднем в 28 изображений на класс.

Для крио-ЭМ анализа был также использован материал C1 из SEC. На сетку Quantifoil (Йена, Германия) 3,5 / 1 монтировалась сплошная углеродная пленка. Соответствующим образом разбавленный образец адсорбировали на сетке с тлеющим разрядом в течение 1 мин с последующим ручным блоттингом и замораживанием в жидком этане с использованием системы Leica EM CPC (Leica Microsystems). Образец был отображен в Titan Krios EM при 200 кВ (FEI), расфокусировке от -5 до -8 мкм и номинальном увеличении 59000 × на камере Gatan US4000, в результате чего конечный размер пикселя был равен 1.2 Å на пиксель. Поскольку комплекс C1qrs создает довольно низкий контраст в криогенных условиях, к изображениям был применен фильтр Винера нижних частот, и 12890 изображений были выбраны вручную. Изображения были сгруппированы в среднем по 65 изображений на класс.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников компании Petra P12 и ESRF BM29 за поддержку во время сбора данных и, в частности, Сай Джеффриса за помощь с поточной обработкой данных и Максима Петухова за компиляцию CORALXL. Г.A. был поддержан Biostruct-X, Danscatt, Датским советом независимых исследований в области естественных наук и центром BRAINSTRUC фонда Lundbeck Foundation. S.T. был поддержан Датским советом независимых исследований в области медицинских наук и Ново-Северным фондом. Б.С. выражает признательность за финансирование Датского совета независимых исследований в области естественных наук. М.М.Г. получил финансирование от программы Sapere Aude Датского совета независимых исследований и стипендии Фонда Лундбека.

Сноски

• Вклад авторов: S.A.M., J.C.J., S.T. и G.R.A. спланированное исследование; S.A.M., B.S., R.K.J., M.M.G. и A.G.H. проведенное исследование; S.A.M., B.S., R.K.J., J.S.P., M.M.G., J.C.J., S.T. и G.R.A. проанализированные данные; и B.S., S.T. и G.R.A. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Размещение данных: данные, представленные в этой статье, были депонированы в Банке биологических данных по малому углу рассеяния (SASBDB), https: // www.sasbdb.org (инвентарные номера SASDBZ7, SASDB28 и SASDB38).

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1616998114/-/DCSupplemental.

Система дополнения | Британское общество иммунологии

Комплемент был обнаружен Жюлем Борде как термолабильный компонент нормальной плазмы, который вызывает опсонизацию и уничтожение бактерий . Система комплемента относится к серии из> 20 белков, циркулирующих в крови и тканевых жидкостях.Большинство белков обычно неактивны, но в ответ на распознавание молекулярных компонентов микроорганизмов они последовательно активируются в ферментном каскаде — активация одного белка ферментативно расщепляет и активирует следующий белок в каскаде. Комплемент может быть активирован тремя разными путями ( Рисунок 1 ), каждый из которых может вызывать активацию C3 , расщепляя его на большой фрагмент C3b , который действует как опсонин , и маленький фрагмент C3a (анафилатоксин), который способствует воспалению.Активированный C3 может запускать литический путь , который может повреждать плазматические мембраны клеток и некоторых бактерий. C5a, продуцируемый этим процессом, привлекает макрофагов и нейтрофилов , а также активирует тучных клеток .

Классический путь

Этот путь включает компоненты комплемента C1 , C2 и C4 . Этот путь запускается комплексом антитело-антиген , связывающимся с C1 , который сам имеет три подкомпонента: C1q , C1r и C1s .Этот путь образует конвертазу C3, C4b2a , которая расщепляет C3 на два фрагмента; большой фрагмент, C3b , может ковалентно прикрепляться к поверхности микробных патогенов и опсонизировать их; небольшой фрагмент, C3a , активирует тучных клеток , вызывая высвобождение вазоактивных медиаторов, таких как гистамин.

Альтернативный путь

Этот путь включает в себя различные факторы, B, D, H и I , которые взаимодействуют друг с другом и с C3b, чтобы сформировать конвертазу C3, C3bBb , которая может активировать больше C3, поэтому путь иногда бывает называется «петлей усиления».Активация петли стимулируется в присутствии клеточных стенок бактерий и грибов, но ингибируется молекулами на поверхности нормальных клеток млекопитающих.

Маннозо-связывающий лектиновый путь

Этот путь активируется связыванием связывающего маннозу лектина ( MBL ) с остатками маннозы на поверхности патогена. Это, в свою очередь, активирует MBL-ассоциированные сериновые протеазы, MASP-1 и MASP-2 , которые активируют C4 и C2 , с образованием конвертазы C3, C4b2a .

Lytic Pathway

Этот путь инициируется расщеплением C5 и прикреплением C5b к цели. C6, C7, C8 и C9 объединяются с C5b, и этот комплекс , атакующий мембрану ( MAC ), при вставке во внешнюю мембрану некоторых бактерий может способствовать их гибели в результате лизиса. Эритроциты, у которых есть антитела, связанные с клеточной поверхностью, также могут активировать классический и литический пути и становиться восприимчивыми к лизису.

Роль комплемента в заболевании

Система комплемента играет решающую роль в воспалении и защите от некоторых бактериальных инфекций. Комплемент также может активироваться во время реакций на переливание несовместимой крови и во время повреждающих иммунных реакций, сопровождающих аутоиммунное заболевание. Дефицит отдельных компонентов комплемента или ингибиторов системы может приводить к множеству заболеваний (, таблица 1, ), что дает некоторое представление об их роли в защите от болезней.

Таблица 1 . Болезни, связанные с дефицитом комплемента

© Авторские права на это произведение принадлежат автору

Classical Complement Pathway — обзор

4.34.3.1.3 Механизм действия антикомплементарной активности

Все активные пектиновые полисахариды активируют как классический, так и альтернативный пути комплемента. Другие кислые полисахариды, такие как Plantago, mucilage A и paniculatan, также активируют оба пути. ^47,64

Предполагается, что система комплемента также способствует предотвращению развития опухолей. Было показано, что опосредованные хозяином противоопухолевые (1 → 3) -β-d-глюканы активируют альтернативный путь. ⁵³ Один такой противоопухолевый водонерастворимый 6-разветвленный (1 → 3) -β-d-глюкан, лентинан, который был выделен из съедобного гриба L. edodes (Berk.) Sing., Активировал C3, но не C1, и приводит к образованию соответствующих фрагментов комплемента, C3b (большой фрагмент C3), C5a (небольшой фрагмент C5) и фактора Ba (небольшой фрагмент регулятора комплемента B) путем активации альтернативного пути комплемента. ⁵⁴ Было высказано предположение, что продукция этих фрагментов комплемента приводит к активации макрофагов за счет усиления включения комплекса C3b-лентинан в макрофаги. ^53,54 Следовательно, предполагается, что противоопухолевый эффект лентинана усиливается активацией системы комплемента.

Известно, что формы инулина в виде частиц являются активаторами альтернативного пути комплемента (APC), не влияя на классический путь комплемента. ^4,51 Три полиморфные формы инулина в виде частиц присутствуют в зависимости от их растворимости в воде; β-инулин мгновенно растворяется в воде при 23 ° C, α-инулин растворим при 37 ° C с полупериодом 8 минут, а γ-инулин нерастворим при 37 ° C. ⁵¹ γ-Инулин имеет самую высокую молекулярную массу (10000–8500) и проявляет наиболее сильную активирующую активность в отношении APC по сравнению с другими формами инулина в виде частиц. ⁵¹ C3 играет несколько важных ролей для специфического иммунного ответа, таких как презентация антигена и ответ антител, индукция перераспределения комплексов пептид-MHC, стимулирование поглощения антигена и экспрессия костимулирующих факторов. ⁵⁶ Сообщалось, что внутрибрюшинная инъекция γ-инулина мышам индуцировала отложение C3-фрагмента в антиген-презентирующих клетках посредством активации APC и усиливала пролиферацию антигенспецифических Т-клеток посредством этого отложения C3-фрагмента. ⁶⁵ Из этих результатов было сделано заключение, что γ-инулин может быть полезным адъювантом для системной вакцинации. ⁶⁶ Было проведено несколько исследований для установления эффективности гамма-инулина в качестве адъюванта вакцины против белка HPV E7 рака шейки матки, HbsAg вируса гепатита B, целых и живых вирусов и их гемагглютинина вируса гриппа, карциномы, меланомы, цельного менингкокка. , столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин и т. д. ⁶⁶

Активация системы комплемента классическим путем инициируется образованием иммунных комплексов. ⁵⁷ Когда использовали нормальную человеческую сыворотку с обедненной IgG для измерения активирующей комплемент активности пектиновых полисахаридов (AAFIIb-2 и-IIb-3) из листьев Artemisia princeps PAMP, активность была значительно снижена по сравнению с активностью активность необработанной сыворотки. ⁶⁷ Это наблюдение поднимает гипотезу о том, что нормальная человеческая сыворотка содержит антитела против полисахаридов, активирующих комплемент. Поскольку некоторые рецепторы иммуноглобулинов экспрессируются в B-клетках, макрофагах, дендритных клетках, естественных киллерах (NK) и тучных клетках, ⁸ это антитело может играть важную роль в экспрессии иммунофармакологической активности через активирующие комплемент пектиновые полисахариды. в лекарственных травах.

Киёхара и др. . ⁶⁸ обнаружил, что нормальная сыворотка человека и человеческое молозиво содержат классы IgM, IgG, иммуноглобулина A (IgA) и секреторных IgA естественных антител, которые в разной степени реагируют с пектинами, активирующими комплемент, пектиновыми полисахаридами и арабиногалактанами из лекарственных трав. . Реагирующее антитело IgG в нормальной сыворотке человека распознает разветвленные области активных пектинов как активные сайты для активности, активирующей комплемент.Корреляционный анализ показал, что наблюдалась значимая и положительная корреляция между реактивностью с реагирующим антителом класса IgG и степенью активирующей комплемент активностью активных полисахаридов. ⁶⁸

Сакураи и др. . ⁶⁹ сообщили, что пектиновый полисахарид, буплеуран 2IIc из B. falcatum , присутствовал в печени после перорального введения мышам с использованием антиполисахаридных антител, и на основании этого наблюдения они предположили, что буплеуран 2IIc может абсорбироваться из пищеварительная система в кровоток.Поскольку рецепторы иммуноглобулинов экспрессируются в нескольких иммунных клетках, предполагается, что ⁷⁰ природные антитела, реагирующие с пектиновыми полисахаридами, вносят вклад в экспрессию иммунофармакологической активности пектиновых полисахаридов через рецепторы иммуноглобулинов после абсорбции. Присутствие реагирующих с пектиновыми полисахаридами природных и секреторных антител IgA в человеческом молозиве также свидетельствует о том, что это же антитело существует в участках слизистой оболочки, таких как кишечник человека. ^71,72 Было обнаружено, что рецептор IgA расположен на микроскладках (M) клеток пейеровских бляшек в кишечнике человека, и рецептор способствует захвату иммунных комплексов антиген-IgA в пейеровых бляшках. ⁷³ Сакураи и др. . ⁶⁹ также сообщили, что буплеуран 2IIc накапливается в пейеровых бляшках после перорального введения мышам. Между тем, предполагается, что димерный IgA способствует активации альтернативного пути комплемента с образованием некоторых биологически активных фрагментов комплемента, ⁷⁴ и компонентов комплемента, таких как C3 и C4, которые, как известно, продуцируются эпителиальными клетками кишечного тракта. ⁷⁵ Также предполагается, что образование иммунных комплексов природного IgA-антитела, реагирующего с пектиновыми полисахаридами, с активным пектиновым полисахаридом в кишечной жидкости может не только участвовать в эффективном включении активных пектиновых полисахаридов в пейеровы бляшки, но также активировать компоненты комплемента. в жидкости, чтобы вызвать определенные изменения иммунной системы кишечника. ⁶⁸

Система комплемента и врожденный иммунитет — иммунобиология

Комплемент был открыт много лет назад как термолабильный компонент нормальной плазмы, который увеличивает опсонизацию бактерий антителами и позволяет антителам убивать некоторые бактерии. Эта деятельность было сказано, что он «дополняет» антибактериальную активность антитела, отсюда и название. Хотя комплемент был впервые обнаружен как эффекторное плечо ответа антител, также могут активироваться на ранних стадиях инфекции в отсутствие антител.Действительно, это Теперь кажется очевидным, что комплемент сначала развился как часть врожденной иммунной системы, где он по-прежнему играет важную роль.

Система дополнения состоит из большого количества отдельных плазменных белки, которые реагируют друг с другом, опсонизируя патогены и вызывая серию воспалительные реакции, которые помогают бороться с инфекцией. Ряд белков комплемента представляют собой протеазы, которые сами активируются протеолитическим расщеплением. Такие ферменты называются зимогенами и впервые были обнаружены в кишечнике.Пищеварительный фермент пепсин, например, хранится внутри клеток и секретируется как неактивный фермент-предшественник, пепсиноген, который расщепляется до пепсина только в кислой среде желудка. Преимущество отсутствия автопереваривания для хоста очевидно.

В случае системы комплемента зимогены-предшественники широко распространены во всех жидкостях и тканях организма без побочных эффектов. В местах заражения, однако они активируются локально и вызывают серию мощных воспалительных События.Система комплемента активируется через каскад запускаемых ферментов. В таком каскад, активный фермент комплемента, генерируемый расщеплением его зимогена затем предшественник расщепляет свой субстрат, другой зимоген комплемента, до своего активного ферментативная форма. Это, в свою очередь, расщепляет и активирует следующий зимоген в комплемент путь. Таким образом, активация небольшого количества комплемента белки в начале пути значительно усиливаются каждым последующим ферментативная реакция, приводящая к быстрому образованию непропорционально большого количества дополнять ответ.Как и следовало ожидать, существует множество регуляторных механизмов, предотвратить неконтролируемую активацию комплемента. Система свертывания крови — другое пример каскада запускаемых ферментов. В этом случае небольшая травма крови стенка сосуда может привести к развитию большого тромба.

Есть три разных пути, по которым комплемент может быть активирован на патогенные поверхности. Эти пути зависят от разных молекул. инициации, но они сходятся, чтобы произвести тот же набор эффекторных молекул ().Есть три способа, которыми система комплемента защищает от инфекции. Во-первых, он генерирует большое количество активированные белки комплемента, которые ковалентно связываются с патогенами, опсонизируя их для поглощение фагоцитами, несущими рецепторы комплемента. Во-вторых, небольшой фрагменты некоторых белков комплемента действуют как хемоаттрактанты, чтобы привлечь больше фагоцитов к месту активации комплемента, а также для активации этих фагоциты. В-третьих, компоненты терминального комплемента повреждают определенные бактерии путем создание пор в бактериальной мембране.

Рисунок 2.7

Схематический обзор дополнительного каскада. Есть три пути активации комплемента: классический путь, который запускается антителом или прямым связыванием комплемента компонент C1q на поверхность возбудителя; MB-лектиновый путь, который (подробнее …)

2-5. Комплемент — это система белков плазмы, которая взаимодействует с патогенами, чтобы пометить их для разрушения фагоцитами

На ранних этапах инфекции каскад комплемента может быть активирован на поверхность патогена через один или несколько из трех показанных путей в .Классический путь может быть инициирован связывание C1q, первого белка в каскаде комплемента, непосредственно с поверхность возбудителя. Он также может быть активирован во время адаптивного иммунного ответа посредством связывание C1q с комплексами антитело: антиген и, таким образом, является ключевым звеном между эффекторные механизмы врожденного и адаптивного иммунитета. В маннан-связывающий лектиновый путь ( MB-лектиновый путь ) инициируется связыванием маннан-связывающего лектина, сывороточного белка, с маннозосодержащие углеводы на бактерии или вирусы.Наконец, можно начать альтернативный путь. когда спонтанно активированный компонент комплемента связывается с поверхностью возбудитель. Каждый путь следует за последовательностью реакций для генерации протеазы. называется C3-конвертазой. Эти реакции известны как «ранние» события активации комплемента и состоят из каскадов триггерных ферментов, в которых неактивные зимогены комплемента последовательно раскалываются, давая два фрагмента, больший из которых является активным сериновая протеаза. Активная протеаза удерживается на поверхности патогена и это гарантирует, что следующий зимоген комплемента в этом пути также расщепляется и активируется на поверхности патогена.Напротив, небольшой пептидный фрагмент высвобождается из места реакции и может действовать как растворимый медиатор.

Рисунок 2.8

Обзор основных компонентов и исполнительных действий дополнение. Ранние события всех трех путей активации комплемента включают серию реакций расщепления, которые завершаются образование ферментативной активности, называемой C3-конвертазой, (подробнее …)

C3-конвертазы, образованные этими ранними событиями активации комплемента, являются ковалентно связывается с поверхностью патогена.Здесь они расщепляют C3, чтобы получить большие количество C3b, главного эффектора молекула системы комплемента и C3a, пептидный медиатор воспаления. Молекулы C3b действуют как опсонины; они ковалентно связываются с возбудителем и тем самым направляя его на разрушение фагоцитами, оснащенными рецепторами для C3b. C3b также связывает C3-конвертазу с образованием C5-конвертазы , которая производит самый важный небольшой пептидный медиатор воспаления, C5a , а также большой активный фрагмент C5b, который инициирует «поздние» события активации комплемента.Они включают последовательность реакции полимеризации, в которых концевые компоненты комплемента взаимодействуют с образуют мембранно-атакующий комплекс, который создает поры в клеточных мембранах некоторых патогенов, которые могут привести к их смерть.

Номенклатура белков комплемента часто является значительным препятствием для понимание этой системы, и прежде чем обсуждать каскад дополнений более подробно подробно, мы объясним условные обозначения и номенклатуру, используемые в этой книге. Все компоненты классического пути комплемента и комплекса атаки на мембрану обозначены буквой C, за которой следует число.Родной компоненты имеют простое числовое обозначение, например С1 и С2, но к сожалению, компоненты были пронумерованы в порядке их обнаружения а не последовательность реакций, которая есть C1, C4, C2, C3, C5, C6, C7, C8, и C9. Продукты реакций расщепления обозначены добавленными строчные буквы, больший фрагмент обозначается b, а меньший a; таким образом, например, C4 расщепляется до C4b, большого фрагмента C4, который связывает ковалентно к поверхности возбудителя, а C4a — небольшой фрагмент со слабым провоспалительные свойства.Компоненты альтернативного пути вместо этого пронумерованы, обозначаются разными заглавными буквами, например фактор B и фактор D. Как и в случае классического пути, продукты их расщепления обозначаются добавлением строчных букв a и b: таким образом, большой фрагмент части B называется Bb, а небольшой фрагмент — Ba. Наконец, в связывании маннозы лектиновый путь, первые активируемые ферменты известны как m аннан-связывающий лектин- a ssociated s erine p ротеизирует MASP-1 и MASP-2, после чего Путь по существу такой же, как и классический путь.Активированный комплемент компоненты часто обозначаются горизонтальной линией, например, ; однако мы не будем использовать это соглашение. Также полезно знать, что большой активный фрагмент C2 первоначально обозначался как C2a и до сих пор называется так в некоторых текстах и научно-исследовательские работы. Здесь для единообразия мы будем называть все большие фрагменты комплемент b, поэтому большой активный фрагмент C2 будет обозначен как C2b.

Формирование активности C3-конвертазы имеет решающее значение для активации комплемента, приводя к продукции основных эффекторных молекул и инициируя поздние события.В классическом пути и пути MB-лектина конвертаза C3 является образуется из связанного с мембраной C4b в комплексе с C2b. В альтернативном пути гомологичная C3 конвертаза образуется из мембраносвязанного C3b в комплексе с Bb. Альтернативный путь может действовать как петля амплификации для всех трех путей, поскольку это инициируется связыванием C3b.

Очевидно, что путь, ведущий к такому сильному воспалительному и деструктивному эффекты, и который, кроме того, имеет ряд встроенных шагов усиления, является потенциально опасны и должны подлежать строгому регулированию.Один важный гарантия заключается в том, что ключевые активированные компоненты комплемента быстро деактивируются если они не связываются с поверхностью патогена, на которой была их активация инициирован. Есть также несколько точек пути, на которых регулирующие белки действуют на компоненты комплемента, чтобы предотвратить непреднамеренную активацию комплемент на поверхности клеток-хозяев, тем самым защищая их от случайного повреждения. Мы вернемся к этим механизмам регулирования позже.

Мы представили все необходимые компоненты дополнения и готовы для более подробного описания их функций.Чтобы помочь различить различные компоненты в соответствии с их функциями, мы будем использовать цветовой код в рисунки в этой части главы. Это введено в, где все компоненты дополнение сгруппированы по функциям.

Рисунок 2.9

Функциональные классы белков в системе комплемента.

2-6. Классический путь инициируется активацией комплекса C1

Классический путь играет роль как в врожденном, так и в адаптивном иммунитете. Как мы увидим в главе 9 первый компонент этого пути, C1q, связывает адаптивный гуморальный иммунный ответ с система комплемента путем связывания с антителами в комплексе с антигенами.C1q может, тем не менее, они также связываются непосредственно с поверхностью определенных патогенов и, таким образом, вызывают активация комплемента в отсутствие антител. C1q является частью комплекса C1, который состоит из одной молекулы C1q, связанной с двумя молекулами каждой из зимогены C1r и C1s. C1q — кальций-зависимый сахар-связывающий белок, лектин, принадлежащий к семейству белков collectin , который содержит как коллагеноподобный, так и лектиновый домены, отсюда и название коллаген. Она имеет шесть шаровидных головок, соединенных коллагеноподобным хвостом, которые окружают (C1r: C1s) ₂ комплекс ().Связывание более чем одной из голов C1q с патогеном поверхность вызывает конформационное изменение комплекса (C1r: C1s) ₂ , что приводит к активации автокаталитической ферментативной активности C1r; в активная форма C1r затем расщепляет связанные с ней C1s с образованием активного серина протеаза.

Рисунок 2.10

Первый белок в классическом пути комплемента активация — это C1, который представляет собой комплекс C1q, C1r и C1s. C1q состоит из шести идентичных субъединиц с шаровидными головками и длинные коллагеноподобные хвосты.Хвосты соединяются с двумя молекулами. каждый (подробнее …)

После активации фермент C1s воздействует на следующие два компонента классического пути, расщепляя C4, а затем C2 с образованием двух больших фрагментов, C4b и C2b, которые вместе образуют конвертазу C3 классического пути. Во-первых стадии, C1s расщепляет C4 с образованием C4b, который ковалентно связывается с поверхностью возбудитель. Ковалентно присоединенный C4b затем связывает одну молекулу C2, делая он, в свою очередь, подвержен расщеплению C1s.C1s расщепляет C2, образуя большой фрагмент C2b, который сам по себе является сериновой протеазой. Комплекс C4b с активная сериновая протеаза C2b остается на поверхности патогена как C3 конвертаза классического пути. Его самая важная деятельность — расщеплять большое количество молекул C3 для производства молекул C3b, которые покрывают патоген поверхность. В то же время другой продукт расщепления, C3a, инициирует локальный воспалительная реакция. Эти реакции, которые составляют классический путь активация комплемента, схематически показаны в; вовлеченные белки и их активные формы, перечислены в.

Рисунок 2.11

Классический путь активации комплемента генерирует C3 convertase, которая откладывает большое количество молекул C3b на поверхность возбудителя. Шаги реакции описаны здесь и подробно описаны в тексте. Расщепление C4 с помощью C1s открывает реактивный (подробнее …)

Рисунок 2.12

Белки классического пути комплемента активация.

2-7. Маннан-связывающий лектиновый путь гомологичен классическому путь

Путь MB-лектин использует белок, очень похожий на C1q, чтобы запустить дополнить каскад.Этот белок, называемый маннан-связывающим лектином ( MBL ), представляет собой коллектин, как C1q. Маннан-связывающий лектин специфически связывается с остатками маннозы и некоторые другие сахара, которые доступны и расположены в порядке, позволяющем связывание со многими патогенами. Однако на клетках позвоночных они покрыты другие группы сахаров, особенно сиаловая кислота. Таким образом, маннан-связывающий лектин способен инициировать активацию комплемента путем связывания с поверхностями патогенов. Это присутствует при низких концентрациях в нормальной плазме большинства людей, и, как мы увидим, в последней части этой главы его производство печенью увеличено. во время острой фазы реакции врожденного иммунного ответа.

Маннан-связывающий лектин, как и C1q, представляет собой шестиглавую молекулу, которая образует комплекс с двумя зимогенами протеаз, которые в случае маннан-связывающего лектина комплекс (комплекс МБЛ) МАСП-1 и MASP-2 (). MASP-1 и MASP-2 близко гомологичны C1r и C1s, и всем четырем ферментам вероятно, произошли от дупликации гена общего предшественника. Когда Комплекс MBL связывается с поверхностью патогена, MASP-1 и MASP-2 активируются, чтобы расщепить C4 и C2. Таким образом, путь MB-лектина инициирует активацию комплемента в так же, как и классический путь, образуя C3-конвертазу из C2b, связанную с C4b.Люди с дефицитом маннан-связывающего лектина испытывают значительное увеличение при инфекциях в раннем детстве, что указывает на важность MB-лектина путь для защиты хозяина. Возрастное окно восприимчивости к инфекциям связанный с дефицитом маннан-связывающего лектина, иллюстрирует особую важность врожденных защитных механизмов хозяина в детстве, до того, как ребенок адаптивные иммунные ответы полностью созрели и после материнских антител переносятся через плаценту и в молозиве.

Рисунок 2.13

Маннан-связывающий лектин образует комплекс с сериновыми протеазами, которые напоминает дополнительный С1 комплекс. MBL образует кластеры из двух-шести углеводсвязывающих головок вокруг центральная коллагеноподобная ножка. Эта структура, легко различимая под электрон (подробнее …)

2-8. Активация комплемента в основном ограничена поверхностью, на которой он инициировал

Мы видели, что классический и MB-лектиновый пути активации комплемента инициируются белками, которые связываются с поверхностями патогенов.В течение каскад запускаемых ферментов, который следует, важно, чтобы активирующие события ограничены этим же сайтом, так что активация C3 также происходит на поверхности возбудителя, а не в плазме или на поверхности клеток-хозяев. Это достигается главным образом за счет ковалентного связывания C4b с поверхностью патогена. Расщепление C4 обнажает высокореактивную тиоэфирную связь в молекуле C4b, которая позволяет ему ковалентно связываться с молекулами в непосредственной близости от его сайта активации. При врожденном иммунитете расщепление C4 катализируется C1 или MBL. комплекс, связанный с поверхностью патогена, а C4b может связывать соседние белки или углеводы на поверхности возбудителя.Если C4b не образует эту связь быстро, тиоэфирная связь расщепляется реакцией с водой, и этот гидролиз реакция необратимо инактивирует C4b (). Это помогает предотвратить распространение C4b с места его распространения. активация на микробной поверхности и связывание с клетками-хозяевами.

Рисунок 2.14

Расщепление C4 обнажает активную тиоэфирную связь, которая вызывает большой фрагмент, C4b, для ковалентного связывания с соседними молекулами на поверхность бактериальных клеток. Неповрежденный C4 состоит из цепей α, β и γ с экранированной тиоэфир (подробнее…)

C2 становится восприимчивым к расщеплению C1s только тогда, когда он связан с C4b, а Таким образом, сериновая протеаза C2b также ограничивается поверхностью патогена, где она остается связанным с C4b, образуя конвертазу C3. Активация C3 Таким образом, молекулы также встречаются на поверхности патогена. Кроме того, C3b продукт расщепления также быстро инактивируется, если он не связывается ковалентно тот же механизм, что и C4b, и поэтому опсонизирует только поверхность, на которой активация комплемента произошла.

2-9. Гидролиз C3 вызывает инициирование альтернативного пути комплемент

Третий путь активации комплемента называется альтернативным путем. потому что он был открыт как второй или «альтернативный» путь для дополнения активация после того, как был определен классический путь. Этот путь может воздействовать на многие микробные поверхности в отсутствие специфических антител, и это приводит к образованию отдельной C3-конвертазы, обозначенной C3b, Bb. В в отличие от классического и MB-лектинового путей активации комплемента, альтернативный путь не зависит от патоген-связывающего белка для его инициация; вместо этого он инициируется самопроизвольным гидролизом C3, так как показаны на трех верхних панелях.Отличительные компоненты пути перечислены в. Ряд механизмов обеспечивают что путь активации будет проходить только на поверхности патогена.

Рисунок 2.15

Комплемент, активированный альтернативным путем, атакует патогены при сохранении клеток-хозяев, которые защищены комплементом регуляторные белки. Компонент комплемента C3 спонтанно расщепляется в плазме с образованием дают C3 (H ₂ O), который связывает фактор B и (подробнее …)

Рисунок 2.16

Белки альтернативного пути комплемента активация.

C3 содержится в плазме в больших количествах, а C3b со значительной скоростью продуцируется спонтанное расщепление (также известное как «тикание»). Это происходит через спонтанный гидролиз тиоэфирной связи в C3 с образованием C3 (H ₂ O) который имеет измененную конформацию, что позволяет связывать белок плазмы фактор B . Связывание B с помощью C3 (H ₂ O) затем позволяет протеаза плазмы под названием фактор D расщепляет фактор B до Ba и Bb, последний остается связанным с C3 (H ₂ O), чтобы сформировать Комплекс C3 (H ₂ O) Bb.Этот комплекс представляет собой C3-конвертазу в жидкой фазе, и хотя он образуется только в небольших количествах, он может расщеплять многие молекулы От C3 до C3a и C3b. Большая часть этого C3b инактивируется гидролизом, но некоторые ковалентно присоединяется через свою реактивную тиоэфирную группу к поверхностям клетки-хозяева или патогены. Связанный таким образом C3b способен связывать фактор B, позволяя его расщеплению фактором D давать небольшой фрагмент Ва и активный протеаза Bb. Это приводит к образованию конвертазы С3 альтернативного пути, C3b, Bb (см.).

Когда C3b связывается с клетками-хозяевами, присутствует ряд белков, регулирующих комплемент. в плазме и на мембранах клетки-хозяина вместе предотвращают образование комплемента активация из исходящего. Эти белки взаимодействуют с C3b и либо предотвращают конвертазы от образования, либо способствуют ее быстрой диссоциации (см.). Таким образом, рецептор комплемента 1 (CR1) и прикрепленный к мембране белок, известный как фактор ускорения распада ( DAF или CD55 ) конкурируют с фактором B за связывание с C3b на клетке поверхность и может вытеснить Bb из уже образовавшейся конвертазы.Образование конвертазы также можно предотвратить путем расщепления C3b на его неактивные производная iC3b. Это достигается с помощью протеазы плазмы, фактор I , в сочетании с C3b-связывающими белками, которые могут действовать как кофакторы, такие как CR1 и мембранный кофактор протеолиз ( MCP или CD46 ), другой хозяин белок клеточной мембраны. Фактор H является еще одним регулятором комплемента. белок в плазме, который связывает C3b и, как и CR1, способен конкурировать с фактор B и вытесняют Bb из конвертазы в дополнение к действию кофактора для фактора I.Фактор H связывается преимущественно с C3b, связанным с клетками позвоночных, как он имеет сродство к остаткам сиаловой кислоты, присутствующим на этих клетках.

Напротив, поскольку на поверхности патогенов отсутствуют эти регуляторные белки и сиаловые кислотных остатков конвертаза C3b, Bb может образовываться и сохраняться. Действительно, этот процесс может благоприятствовать положительный регуляторный фактор, известный как пропердин или фактор P , который связывается со многими микробными поверхностями и стабилизирует конвертазу. Недостаток фактора P связан с повышенной восприимчивостью к заражение видами Neisseria .После образования группы C3b, Bb конвертаза быстро расщепляет еще больше C3 до C3b, которые могут связываться с патогеном и либо действуют как опсонин, либо повторно инициируют путь образования другой молекулы конвертазы C3b, Bb. Таким образом, альтернативный путь активируется через петля амплификации, которая может проходить на поверхности возбудителя, но не на клетка-хозяин. Эта же петля амплификации обеспечивает альтернативный путь к способствуют активации комплемента, первоначально инициированной классическим или Пути MB-лектина ().

Рисунок 2.17

Альтернативный путь активации комплемента может усилить классический или MB-лектиновый путь путем образования альтернативного C3 конвертазы и депонирования большего количества молекул C3b на патогене. C3b, депонированный классическим путем или путями MB-лектина, может связываться (подробнее …)

Конвертазы C3, возникающие в результате активации классического и MB-лектина пути (C4b, 2b) и от альтернативного пути (C3b, Bb), по-видимому, отчетливый. Однако понимание системы комплемента несколько упрощается. признанием тесных эволюционных взаимоотношений между различными белки комплемента.Таким образом, зимогены комплемента, факторы B и C2, тесно связаны между собой. родственные белки, кодируемые гомологичными генами, расположенными в тандеме в главном комплексе гистосовместимости (MHC) на хромосоме 6 человека. Кроме того, их соответствующие партнеры по связыванию, C3 и C4, оба содержат тиоэфирные связи, которые предоставить средства ковалентного связывания конвертаз C3 с патогеном поверхность. Только один компонент альтернативного пути появляется полностью не связаны с его функциональными эквивалентами в классическом пути и пути MB-лектина; это инициирующая сериновая протеаза, фактор D.Фактор D также можно выделить как единственная активирующая протеаза системы комплемента, которая циркулирует как активный фермент, а не зимоген. Это необходимо для инициации. альтернативного пути через спонтанное расщепление C3 и безопасен для хозяина, потому что фактор D не имеет другого субстрата, кроме фактора B, когда он связан с C3b. Это означает, что фактор D находит свой субстрат только на очень низком уровне в плазме, и на поверхностях патогенов, где альтернативный путь активации комплемента разрешено продолжить.

Сравнение различных путей активации комплемента иллюстрирует общий принцип, что большинство иммунных эффекторных механизмов, которые могут быть активируется неклональным образом как часть раннего неадаптивного ответа хозяина против инфекции использовались в процессе эволюции в качестве эффектора механизмы адаптивного иммунитета. Почти наверняка адаптивный ответ эволюционировал путем добавления специфического признания к исходной неадаптивной системе. Этот особенно ярко проиллюстрирован в системе дополнений, потому что здесь компоненты определены, и можно видеть, что функциональные гомологи эволюционно связанные ().

Рисунок 2.18

Существует тесная взаимосвязь между факторами альтернативный, MB-лектин и классические пути комплемента активация. Большинство факторов либо идентичны, либо являются продуктами генов. которые последовательно продублировались, а затем разошлись. (Подробнее …)

2-10. Связанная с поверхностью C3-конвертаза откладывает большое количество фрагментов C3b на патогена на поверхность и генерирует активность C5-конвертазы

Образование C3-конвертаз — это точка, в которой три пути активации комплемента сходятся, потому что и классический путь, и MB-лектин конвертазы пути C4b, 2b и конвертазы альтернативного пути C3b, Bb имеют одна и та же деятельность, и они инициируют одни и те же последующие события.Они оба расщепляют C3 на C3b и C3a. C3b ковалентно связывается через свою тиоэфирную связь с соседние молекулы на поверхности возбудителя; в противном случае он деактивируется гидролиз. C3 — самый распространенный белок комплемента в плазме, встречающийся в концентрация 1,2 мг / мл ^–1 , и до 1000 молекул C3b может связываются в непосредственной близости от единственной активной C3-конвертазы (см.). Таким образом, основной эффект активации комплемента заключается в отложении больших количеств C3b на поверхности возбудителя инфекции, где он образует ковалентно связанное покрытие, которое, как мы увидим, может сигнализировать о окончательное уничтожение возбудителя фагоцитами.

Следующим шагом в каскаде является создание конвертеров C5. в классический и MB-лектиновый пути, конвертаза C5 образуется за счет связывания от C3b до C4b, 2b с получением C4b, 2b, 3b. Точно так же конвертаза C5 альтернативный путь образуется связыванием C3b с конвертазой C3 с образованием C3b ₂ , Bb. C5 захватывается этими комплексами C5-конвертазы через связывание с акцепторным сайтом на C3b, а затем становится восприимчивым к расщеплению активностью сериновой протеазы C2b или Bb.Эта реакция, которая генерирует C5b и C5a, гораздо более ограничен, чем расщепление C3, поскольку C5 может быть отщеплен только когда он связывается с C3b, который является частью комплекса конвертазы C5. Таким образом, дополнить активация как альтернативными, MB-лектином, так и классическими путями приводит к связывание большого количества молекул C3b на поверхности возбудителя, генерация более ограниченного числа молекул C5b и высвобождение C3a и C5a ().

Рисунок 2.19

Компонент комплемента C5 расщепляется при захвате C3b молекула, входящая в состав конвертазного комплекса C5.Как показано на верхней панели, конвертазы C5 образуются, когда C3b связывает либо классический, либо MB-лектиновый путь C3 конвертаза C4b, 2b в форма C4b, 2b, 3b, (подробнее …)

2-11. Поглощение фагоцитами патогенов, меченных комплементом, опосредуется рецепторами. для связанных белков комплемента

Наиболее важным действием комплемента является облегчение поглощения и уничтожение возбудителей фагоцитарными клетками. Это происходит из-за специфических распознавание связанных компонентов комплемента рецепторами комплемента (CR) на фагоцитах.Эти рецепторы комплемента связывают патогены, опсонизированные компонентами комплемента: опсонизация патогенов — это основная функция C3b и его протеолитических производных. C4b также действует как опсонина, но играет относительно небольшую роль, в основном потому, что C3b намного больше, чем C4b создается.

Перечислены пять известных типов рецепторов для связанных компонентов комплемента, с их функции и распределения, в. Лучше всего охарактеризован рецептор C3b CR1 ( CD35 ), который является экспрессируется как на макрофагах, так и на полиморфно-ядерных лейкоцитах.Связывание C3b к CR1 не может сам по себе стимулировать фагоцитоз, но может привести к фагоцитозу в присутствии других иммунных медиаторов, активирующих макрофаги. Для Например, небольшой фрагмент комплемента C5a может активировать макрофаги для поглощения бактерии, связанные со своими рецепторами CR1 (). C5a связывается с другим рецептором, экспрессируемым макрофагами, Рецептор C5a, который имеет семь мембранные домены. Рецепторы этого типа сочетаются с внутриклеточными гуанин-нуклеотид-связывающие белки, называемые G-белками, и рецептор C5a сигналы таким образом.Белки, связанные с внеклеточным матриксом, такие как фибронектин, также может способствовать активации фагоцитов; они встречаются когда фагоциты привлекаются к соединительной ткани и там активируются. C3a, который обладает воспалительной активностью, аналогичной таковой у C5a, хотя и менее эффективен. мощный хемоаттрактант, связывается со своим собственным специфическим рецептором, рецептором C3a, который по структуре гомологичен рецептору C5a.

Рисунок 2.20

Распределение и функция рецепторов белков комплемента на поверхности ячеек.Есть несколько разных рецепторов, специфичных для разного связывания. компоненты комплемента и их фрагменты. CR1 и CR3 являются особенно важен для индукции фагоцитоза (подробнее …)

Рисунок 2.21

Анафилотоксин C5a может усиливать фагоцитоз опсонизированных микроорганизмы. Активация комплемента либо альтернативой, либо MB-лектином пути, приводит к отложению C3b на поверхности микроорганизм (левая панель). C3b может быть связан (подробнее …)

Три других рецептора комплемента — CR2 (также известный как CD21 ), CR3 ( CD11b: CD18 ) и CR4 ( CD11c: CD18 ) — связываются с инактивированными формами C3b, которые остаются прикрепленными к поверхности патогена.Как и несколько других ключей компоненты комплемента, C3b подчиняется регуляторным механизмам и может быть расщепляется на производные, которые не могут образовывать активную конвертазу. Один из неактивные производные C3b, известные как iC3b (см. Раздел 2-9), действуют как опсонин сам по себе, когда он связан рецепторами комплемента CR2 или CR3. В отличие от связывания iC3b с CR1, связывания iC3b с CR3 достаточно самостоятельно стимулировать фагоцитоз. Второй продукт распада C3b, названный C3dg связывается только с CR2.CR2 — это обнаруживается на В-клетках как часть корецепторного комплекса, который может усиливать сигнал полученные через антиген-специфический рецептор иммуноглобулина. Таким образом, В-клетка рецептор антигена которого специфичен для данного патогена, получит сильную усиленный сигнал при связывании этого патогена, если он также покрыт C3dg. В Таким образом, активация комплемента может способствовать выработке сильного антитела. ответ (см. главы 6 и 9). Этот пример того, как врожденный гуморальный иммунный ответ может способствовать активации адаптивного гуморального иммунитета параллельна вкладу врожденного клеточного ответа макрофагов и дендритные клетки к инициированию Т-клеточного ответа, который мы будем обсудим позже в этой главе.

Центральная роль опсонизации C3b и его неактивных фрагментов в уничтожение внеклеточных патогенов можно увидеть в воздействии различных болезни дефицита комплемента. Принимая во внимание, что люди, испытывающие недостаток в любом из последних компоненты комплемента относительно не затронуты, люди с дефицитом C3 или в молекулах, которые катализируют осаждение C3b, проявляют повышенную восприимчивость к заражение широким спектром внеклеточных бактерий, как мы увидим в главе 11.

2-12.Небольшие фрагменты некоторых белков комплемента могут инициировать местное воспалительное заболевание. ответ

Малые фрагменты комплемента C3a, C4a и C5a действуют на специфические рецепторы (см. ) производить местные воспалительные реакции. При производстве в больших количествах или системном введении они вызывают общий коллапс кровообращения, вызывая шокоподобный синдром аналогично системной аллергической реакции с участием антител IgE (см. главу 12). Такая реакция называется анафилактическим шоком и поэтому эти маленькие фрагменты комплемента часто называют анафилотоксины .Из трех C5a является наиболее стабильным и имеет наивысшая удельная биологическая активность. Все три вызывают гладкую мускулатуру сокращение и увеличение проницаемости сосудов, но C5a и C3a также действуют на эндотелиальные клетки, выстилающие кровеносные сосуды, индуцируют молекулы адгезии. В кроме того, C3a и C5a могут активировать тучные клетки, которые заселяют подслизистый слой. ткани для высвобождения медиаторов, таких как гистамин и TNF-α, которые вызывают аналогичные эффекты. Изменения, вызванные C5a и C3a, привлекают антитела, комплемент и фагоцитарные клетки к месту инфекции (), а увеличение жидкости в тканях ускоряет перемещение патоген-несущих антиген-представляющих клеток к местным лимфатическим узлам, способствуя быстрому инициированию адаптивного иммунного ответа.

Рисунок 2.22

Местные воспалительные реакции могут быть вызваны малым комплементом. фрагменты, особенно C5a. Малые фрагменты комплемента дифференцированно активны: C5a более активен. активнее, чем C3a, который более активен, чем C4a. Они вызывают местные воспалительные реакции (подробнее …)

C5a также действует непосредственно на нейтрофилы и моноциты, увеличивая их прилипание к стенкам сосудов, их миграция к местам депонирования антигенов и их способность поглощать частицы, а также увеличивать экспрессию CR1 и CR3 на поверхности этих ячеек.Таким образом, C5a и, в меньшей степени, C3a и C4a, действуют совместно с другими компонентами дополнения, чтобы ускорить уничтожение возбудителей фагоцитами. Сигнал C5a и C3a через трансмембранный рецепторы, активирующие G-белки; таким образом, действие C5a по привлечению нейтрофилов и моноцитов аналогичен хемокинам, которые также действуют через G-белки для контроля миграции клеток.

2-13. Конечные белки комплемента полимеризуются с образованием пор в мембранах, которые может убивать определенные патогены

Одним из важных эффектов активации комплемента является сборка терминальные компоненты комплемента (), чтобы сформировать комплекс атаки на мембрану.Реакции, приводящие к Формирование этого комплекса схематично показано на рис. Конечный результат — поры в липидном бислое. мембрана, нарушающая целостность мембраны. Считается, что это убивает патоген за счет разрушения протонного градиента через мембрану клетки патогена.

Рисунок 2.23

Компоненты клеммного блока собираются, образуя Мембранно-атакующий комплекс.

Рис. 2.24

Сборка комплекса мембранной атаки создает поры в липидная двухслойная мембрана.Здесь показана последовательность шагов и их примерный вид. в схематическом виде. C5b запускает сборку комплекса из одного молекулы каждого из C6, C7 и (подробнее …)

Первым шагом в образовании комплекса атаки на мембрану является расщепление C5 с помощью конвертазы C5 для высвобождения C5b (см.). На следующих этапах, показанных на, C5b инициирует сборку более позднего дополнения. компоненты и их внедрение в клеточную мембрану. Во-первых, одна молекула C5b связывает одну молекулу C6, а комплекс C5b, 6 затем связывает одну молекулу C7.Эта реакция приводит к конформационному изменению составляющих молекул, с обнажением гидрофобного сайта на C7, который вставляется в липид двухслойный. Подобные гидрофобные сайты открыты на более поздних компонентах C8 и C9. когда они связаны с комплексом, что позволяет этим белкам также вставляться в липидный бислой. C8 представляет собой комплекс двух белков, C8β и C8α-γ. C8β белок связывается с C5b, а связывание C8β с ассоциированным с мембраной C5b, 6,7 комплекс позволяет гидрофобному домену C8α-γ вставляться в липидный бислой.Наконец, C8α-γ индуцирует полимеризацию от 10 до 16 молекул C9 в порообразующая структура, называемая комплексом мембранной атаки. Мембранная атака Комплекс, показанный схематически и с помощью электронной микроскопии в, имеет гидрофобную внешнюю поверхность, что позволяет ему связаны с липидным бислоем, но с гидрофильным внутренним каналом. В диаметр этого канала составляет около 100 Å, что обеспечивает свободный проход растворенных веществ. и вода через липидный бислой. Нарушение липидного бислоя приводит к потеря клеточного гомеостаза, нарушение протонного градиента по мембрана, проникновение в клетку ферментов, таких как лизоцим, и возможное уничтожение возбудителя.

Хотя эффект комплекса атаки на мембрану очень драматичен, особенно в экспериментальных демонстрациях, в которых антитела против красных кровяных телец мембраны используются для запуска каскада комплемента, значение этих Компоненты защиты хоста кажутся весьма ограниченными. На сегодняшний день недостатки в компоненты комплемента C5 – C9 были связаны с восприимчивостью только к Neisseria вида бактерий, вызывающих половое передающееся заболевание гонорея и распространенная форма бактериального менингита.Таким образом, опсонизирующее и воспалительное действие более ранних компонентов каскад комплемента, несомненно, наиболее важен для защиты хозяина от инфекционное заболевание. Формирование комплекса мембранной атаки представляется важным только для уничтожения нескольких патогенов, хотя, как мы увидим в главе 13, это может иметь серьезные последствия. роль в иммунопатологии.

2-14. Белки контроля комплемента регулируют все три пути комплемента активация и защита хозяина от его деструктивного воздействия

Учитывая деструктивные эффекты комплемента и способ его активации быстро усиливается через каскад запускаемых ферментов, это неудивительно что существует несколько механизмов предотвращения его неконтролируемой активации.Как мы видели, эффекторные молекулы комплемента генерируются через последовательная активация зимогенов, которые присутствуют в плазме в неактивном форма. Активация этих зимогенов обычно происходит на поверхности патогена, и активированные фрагменты комплемента, образующиеся в последующем каскаде реакций обычно связываются поблизости или быстро инактивируются при гидролизе. Эти две особенности активации комплемента действуют как гарантии против неконтролируемой активации. Даже Таким образом, все компоненты комплемента активируются спонтанно с низкой скоростью в плазма, а активированные компоненты комплемента иногда связывают белки в организме хозяина. клетки.Потенциально опасные последствия предотвращаются серией белки, контролирующие комплемент, кратко изложенные в, которые регулируют каскад комплемента в различных точках. В качестве мы видели при обсуждении альтернативного пути активации комплемента (см. Раздел 2-9) многие из этих контрольных белков специфически защищают клетки-хозяева, позволяя продолжить активацию комплемента на поверхности патогенов. Таким образом, белки, контролирующие комплемент, позволяют дополнять отличать себя от чужого.

Рисунок 2.25

Белки, регулирующие активность комплемента.

Реакции, регулирующие каскад комплемента, показаны на. Две верхние панели показывают, как активация C1 контролируется ингибитором сериновой протеиназы плазмы или серпин , ингибитор С1 (C1INH). C1INH связывает активный фермент C1r: C1s, и заставляет его диссоциировать от C1q, который остается связанным с возбудитель. Таким образом, C1INH ограничивает время, в течение которого активные C1 могут расщепить C4 и C2.Таким же образом C1INH ограничивает спонтанную активацию C1 в плазме. Его важность можно увидеть в болезни дефицита C1INH, наследственный ангионевротический отек , в хроническая спонтанная активация комплемента приводит к выработке избыток расщепленных фрагментов C4 и C2. Небольшой фрагмент C2, C2a, дальше расщепляется на пептид, кинин C2, который вызывает обширное набухание — большую часть Опасно быть локальным отеком трахеи, который может привести к удушью. Брадикинин, который имеет действие, подобное кинину С2, также продуцируется в неконтролируемая мода при этом заболевании в результате отсутствия подавления другая протеаза плазмы, калликреин, которая активируется при повреждении тканей и также регулируется C1INH.Это заболевание полностью исправляется заменой C1INH. В большие активированные фрагменты C4 и C2, которые обычно объединяются с образованием конвертазы C3, не повреждают клетки-хозяева у таких пациентов, потому что C4b быстро инактивирован в плазме (см.) и конвертаза не создается. Кроме того, любая конвертаза, которая случайно формы на клетке-хозяине инактивируется с помощью механизмов, описанных ниже.

Рисунок 2.26

Активация комплемента регулируется рядом белков, которые служат для защиты клеток-хозяев от случайного повреждения.Они действуют на разных этапах каскада комплемента, диссоциируя комплексов или катализирующих ферментативную деградацию ковалентно связанная (подробнее …)

Тиоэфирная связь активированных C3 и C4 чрезвычайно реактивна и не имеет механизм различения акцепторной гидроксильной или аминогруппы на клетке-хозяине из аналогичной группы на поверхности возбудителя. Серия защитных механизмы, опосредованные другими белками, эволюционировали, чтобы гарантировать, что связывание небольшого количества молекул C3 или C4 на мембраны клетки-хозяина приводит к минимальное образование C3-конвертазы и небольшая амплификация комплемента активация.Мы уже сталкивались с большинством этих механизмов в описание альтернативного пути (см.), но мы еще раз рассмотрим их здесь, поскольку они важны регуляторы конвертазы классического пути (см. второй и третий ряды). Механизмы могут быть разделены на три категории. Первые катализируют расщепление любого C3b или C4b который действительно связывается с клетками-хозяевами в неактивные продукты. Комплементарно-регуляторный ответственный фермент — фактор I сериновой протеазы плазмы; он циркулирует в активная форма, но может расщеплять C3b и C4b только тогда, когда они связаны с кофактором белок.В этих обстоятельствах фактор I расщепляет C3b сначала на iC3b, а затем далее в C3dg, таким образом навсегда отключив его. Аналогичным образом инактивирован C4b расщеплением на C4c и C4d. Есть два белка клеточной мембраны, которые связывают C3b. и C4b и обладают кофакторной активностью для фактора I; это CR1 и MCP (см. Раздел 2-9). Стенки микробных клеток лишены этих защитных белков и не могут способствовать расщеплению C3b и C4b. Вместо этого эти белки действуют как сайты связывания для факторов B и C2, способствуя активация комплемента.Важность фактора я могу увидеть в людях с генетический дефицит фактора I. Из-за неконтролируемой активации комплемента белки комплемента быстро истощаются, и такие люди страдают от повторяющихся бактериальные инфекции, особенно с вездесущими гноеродными бактериями.

Существуют также белки плазмы с кофакторной активностью фактора I. C4b связывается кофактором, известным как C4b-связывающий белок ( C4BP ), который в основном действует как регулятор классический путь в жидкой фазе.C3b связан как в жидкой фазе, так и в на клеточных мембранах белком-кофактором, называемым фактором H (см. Раздел 2-9). Фактор H является важным регулятор комплемента на клеточных мембранах, и на первый взгляд не очевидно, как Фактор H может различать C3b, связанный с клетками-хозяевами или с патогеном. Однако содержание углеводов в клеточных мембранах бактериальных возбудителей отличается от это их хозяева, и это является основой защитного действия фактора H. Фактор H имеет сродство к терминальным сиаловым кислотам мембраны клетки-хозяина. гликопротеинов, и это увеличивает связывание фактора H с любым C3b, отложенным на клетки-хозяева.Напротив, фактор H имеет гораздо меньшее сродство к C3b, нанесенному на клеточные стенки многих бактерий, и фактор B предпочтительно связывается, что приводит к усиление активации комплемента на поверхности бактериальных клеток. В результате, Фактор H и фактор B конкурируют за связывание с C3b, связанным с клетками. Если фактор B «Побеждает», как это обычно бывает на поверхности патогена, тогда усиливается большее количество форм конвертазы C3b, Bb, C3 и активация комплемента. Если фактор H «выигрывает», поскольку в случае с клетками хозяина, то связанный C3b катаболизируется фактором I к iC3b и C3dg, и активация комплемента ингибируется.

Конкуренция между фактором H и фактором B за связывание с поверхностно связанным C3b составляет пример второго механизма ингибирования активации комплемента на хозяине клеточные мембраны. Ряд белков конкурентно ингибируют связывание C2 с связанный с клеткой C4b и фактора B к связанному с клеткой C3b, тем самым ингибируя конвертазу формирование. Эти белки связываются с C3b и C4b на поверхности клетки, а также опосредовать защиту от комплемента через третий механизм, который заключается в усиливают диссоциацию конвертаз C4b, 2b и C3b, Bb, которые уже сформирован.Молекулы мембраны клетки-хозяина, которые регулируют комплемент через оба этих механизмы включают DAF (см. Раздел 2-9) и CR1, который способствует диссоциации конвертазы в дополнение к ее кофактору деятельность. Все белки, связывающие гомологичные молекулы C4b и C3b, имеют общие одна или несколько копий структурного элемента, называемого коротким консенсусным повтором (SCR), повторение контрольного белка комплемента (CCP) или (особенно в Японии) суши домен.

В дополнение к механизмам предотвращения образования конвертазы C3 и C4 и Отложение C3 на клеточных мембранах, есть также тормозящие механизмы, которые предотвратить несоответствующее введение комплекса атаки на мембрану в мембраны.В Разделе 2-13 мы видели, что комплекс, атакующий мембрану, полимеризуется на молекулах C5b, высвобождаемых из C5 convertase. Этот комплекс в основном внедряется в клеточные мембраны, прилегающие к участку. конвертазы C5, то есть близко к сайту активации комплемента на возбудитель. Однако некоторые новообразованные комплексы, атакующие мембрану, могут диффундировать из сайт активации комплемента и вставки в соседние мембраны клетки-хозяина. Некоторые белки плазмы связываются с комплексом C5b, 6,7 и тем самым ингибируют его случайное внедрение в клеточные мембраны.Наиболее важным, вероятно, является сам C8β, когда он связывается с C5b, 6,7 в жидкой фазе. Мембраны клеток-хозяев также содержат собственный белок, CD59 или протектин, который ингибирует связывание C9 в комплекс C5b, 6,7,8 (см. нижний ряд). CD59 и DAF связаны с клеточной поверхностью. хвостом фосфоинозитолгликолипида (PIG), как и многие другие мембранные белки. Один из ферментов, участвующих в синтезе хвостов свиньи, кодируется на хромосома X. У людей с соматической мутацией в этом гене в клоне кроветворные клетки, как CD59, так и DAF, не функционируют.Это вызывает болезнь приступообразный ночной образ жизни гемоглобинурия, которая характеризуется эпизодами внутрисосудистого лизис эритроцитов комплементом. Эритроциты, в которых отсутствует только CD59, также подвержены разрушению в результате спонтанной активации дополнить каскад.

Резюме

Система комплемента является одним из основных механизмов, посредством которых патоген распознавание превращается в эффективную защиту хозяина от первоначального инфекционное заболевание. Комплемент — это система белков плазмы, которая может быть активирована непосредственно патогенами или косвенно патоген-связанными антителами, что приводит к каскад реакций, возникающий на поверхности патогенов и порождающий активные компоненты с различными эффекторными функциями.Есть три пути активация комплемента: классический путь, который запускается непосредственно патоген или косвенно путем связывания антител с поверхностью патогена; в MB-лектиновый путь; и альтернативный путь, который также обеспечивает петля амплификации для двух других путей. Все три пути могут быть инициируется независимо от антител как часть врожденного иммунитета. Ранние события во всех путях состоят из последовательности реакций расщепления, в которых более крупный продукт расщепления ковалентно связывается с поверхностью патогена и способствует активация следующего компонента.Пути сходятся с образованием Фермент C3-конвертаза, который расщепляет C3 с образованием активного комплемента. компонент C3b. Связывание большого количества молекул C3b с возбудителем центральное событие в активации комплемента. Связанные компоненты дополнения, особенно связанный C3b и его неактивные фрагменты, распознаются специфическими рецепторы комплемента на фагоцитарных клетках, которые поглощают патогены, опсонизированные C3b и его неактивные фрагменты. Небольшие фрагменты расщепления C3, C4 и особенно C5, привлекают фагоциты к участкам инфекции и активируют их путем связывание со специфическими тримерными рецепторами, связанными с G-белком.Вместе эти деятельность способствует поглощению и уничтожению патогенов фагоцитами. В молекулы C3b, которые связывают саму конвертазу C3, инициируют поздние события, связывание C5, чтобы сделать его восприимчивым к расщеплению C2b или Bb. Более крупный C5b фрагмент запускает сборку комплекса мембранной атаки, что может привести к лизис некоторых патогенов. Активность компонентов комплемента модулируется системой регуляторных белков, которые предотвращают повреждение тканей как результат непреднамеренного связывания активированных компонентов комплемента с клетками-хозяевами или спонтанная активация компонентов комплемента в плазме.

Структура и активация C1, комплекса, инициирующего классический путь каскада комплемента

Принадлежности Расширять

Принадлежности

• ¹ Департамент биомедицины, Орхусский университет, DK8000 Орхус, Дания.
• ² Центр стохастической геометрии и расширенного биоимиджинга, Орхусский университет, DK8000 Орхус, Дания.
• ³ Кафедра молекулярной биологии и генетики, Орхусский университет, DK8000 Орхус, Дания.
• ⁴ Междисциплинарный центр нанонаук, Орхусский университет, DK8000 Орхус, Дания.
• ⁵ Кафедра молекулярной биологии и генетики, Орхусский университет, DK8000 Орхус, Дания; гра @ mbg.au.dk.

Элемент в буфере обмена

Саймон А. Мортенсен и др. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 .

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

Принадлежности

• ¹ Департамент биомедицины, Орхусский университет, DK8000 Орхус, Дания.
• ² Центр стохастической геометрии и расширенного биоимиджинга, Орхусский университет, DK8000 Орхус, Дания.
• ³ Кафедра молекулярной биологии и генетики, Орхусский университет, DK8000 Орхус, Дания.
• ⁴ Междисциплинарный центр нанонаук, Орхусский университет, DK8000 Орхус, Дания.
• ⁵ Кафедра молекулярной биологии и генетики, Орхусский университет, DK8000 Орхус, Дания; [email protected].

Элемент в буфере обмена

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

Абстрактный

Система комплемента является важным противомикробным и вызывающим воспаление компонентом врожденной иммунной системы.Классический путь комплемента активируется при связывании комплекса C1 774 кДа, состоящего из молекулы распознавания C1q и тетрамерного протеазного комплекса C1r ₂ s ₂ , с различными активаторами, представляющими определенные молекулярные структуры, такие как IgG- и иммунные комплексы, содержащие IgM. Каноническая модель влечет за собой C1r ₂ s ₂ с его доменами сериновой протеазы, плотно упакованными вместе в центре C1, и сложный внутримолекулярный механизм реакции для активации C1r и C1s, индуцируемый при связывании C1 с активатором.Здесь мы показываем, что домены сериновой протеазы C1r и C1s расположены на периферии тетрамера C1r ₂ s ₂ как в одиночку, так и внутри неактивированного комплекса C1. Наши структурные исследования показывают, что комплекс C1 принимает конформацию, несовместимую с внутримолекулярной активацией C1, предполагая вместо этого, что происходит межмолекулярная протеолитическая активация между соседними комплексами C1, связанными с активирующей комплемент поверхностью. Наши результаты объясняют, как множество структурно не связанных молекулярных паттернов могут активировать C1, и предполагают консервативный механизм активации комплемента через классический и связанный с ним лектиновый путь.

Ключевые слова: дополнение; врожденный иммунитет; протеолитический каскад; структурная биология.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Цифры

Организация С1…

Организация субъединиц C1 и активация классического пути. (…

Организация субъединиц C1 и активация классического пути.( A ) Доменная структура C1q и C1r. В C1q «Nt» обозначает короткую N-концевую область во всех трех субъединицах C1q, участвующих в дисульфидных мостиках. В C1r ромб обозначает сайт связывания C1q, звездочкой — сайт активации и треугольником — активный сайт. В C1s отсутствует сайт связывания C1q в домене CUB2, но в остальном он имеет ту же структуру домена, что и C1r. ( B ) Неактивированный C1 (слева) с C1r и C1s в состоянии зимогена (серый цвет) присутствует в жидкой фазе и рекрутируется на поверхность активатора, где C1r автоматически активирует и впоследствии активирует C1s.Ниже показаны последующие события, происходящие после активации C1s, начиная с расщепления C4, затем расщепления C2 и заканчивая сборкой конвертазы CP C3.

Очистка и сбор данных SAXS…

Очистка и сбор данных SAXS для C1r ₂ с ₂ и C1. Покрытие серебром…

Очистка и сбор данных SAXS для C1r ₂ с ₂ и C1. Окрашенные серебром гели SDS / PAGE фракций от препаративной очистки С1 и его компонентов в градиенте плотности сахарозы. ( A ) Комплекс C1r ₂ s ₂ был рекомбинантным, и активный сайт S / A был мутирован для предотвращения аутоактивации.C1r имеет примерно 80 кДа, а C1s чуть ниже примерно 77 кДа. ( B ) C1q, очищенный из сыворотки крови человека, обратите внимание, что C1qA и C1qB объединяются в верхней полосе, тогда как C1qC мигрируют с более низкой молекулярной массой. ( C ) Выделение восстановленного C1, образованного смешиванием C1q с избытком C1r ₂ с ₂ . Образцы в A — C были сокращены до SDS / PAGE. Фракции, используемые для экспериментов SAXS и EM, обозначены пунктирными линиями. ( D ) SEC на Superose 6 10/300 GL очищенной в градиенте сахарозы C1q, C1r ₂ s ₂ и комплекса C1.( E ) Экспериментальная кривая рассеяния (черная) в сравнении с кривой, рассчитанной (серая) для модели C1r ₂ s ₂ , показанной на рис. 3 D . ( F ) Распределение парных расстояний предполагает, что C1r ₂ s ₂ имеет протяженность 45 нм. ( G ) Экспериментальная кривая рассеяния (черная) по сравнению с кривой, рассчитанной (серая) по модели C1, показанной на рис. 4 C . ( H ) Распределение парных расстояний предполагает, что длина C1 составляет 37 нм.

SAXS твердотельное моделирование и негатив…

Моделирование твердого тела SAXS и отрицательная окраска EM предполагают сильно вытянутую структуру…

SAXS и отрицательное окрашивание EM предполагают сильно вытянутую структуру C1r ₂ s ₂ . ( A ) Схематическое изображение доменов внутри C1r ₂ s ₂ . ( B ) Стартовая модель тетрамера C1r ₂ s ₂ для доработки твердого тела. ( C ) Все 43 конструкции, полученные из твердого тела, изогнуты, но имеют примерно равную вероятность изгиба в противоположных направлениях относительно центральной плоскости.( D ) Жесткая конструкция с наилучшим соответствием данным. ( E ) Отрицательная окраска EM C1r ₂ с ₂ тетрамера. Верхний показывает восемь выбранных средних значений класса C1r ₂ с ₂ . Комплекс имеет удлиненную форму с центральным расширением и небольшими глобулярными доменами, выступающими на периферии комплекса. Нижний показывает рассчитанные проекционные изображения модели SAXS из D с использованием того же масштабирования, что и для средних значений по классам.Для каждого среднего класса вручную назначалось аналогичное проекционное изображение. (Масштабные полосы: D , 5 нм; E , 50 нм.)

SAXS-анализ C1r _2…

SAXS-анализ C1r ₂ с ₂ . ( A ) Guinier…

SAXS-анализ C1r ₂ с ₂ . ( A ) График Гинье объединенных данных C1r ₂ s ₂ . Остаточный график показан по адресу Справа . ( B ) График Кратки данных предполагает, что C1r ₂ s ₂ является жесткой и сильно свернутой молекулой.( C ) Схематическое изображение в том же стиле, что и на рис. 3 A , описывающее процесс создания стартовой модели C1r ₂ s ₂ . Указываются записи PDB, используемые для различных шагов, как описано в методах SI . ( D ) Альтернативная входная модель, в которой молекула C1r транслируется на 27 Å по горизонтали по сравнению с входной моделью, показанной на рис. 3 B . Внизу наложены выходные модели из 10 доработок твердого тела.( E ) То же, что и C , но с переводом 54 Å.

SAXS анализ C1…

SAXS-анализ комплекса C1.( A ) Рассеяние вперед и…

SAXS-анализ комплекса C1. ( A ) Прямое рассеяние и R _g встроенных данных SAXS для C1 нанесены на график в зависимости от объема элюирования. Серая область отмечает объем, соответствующий кадрам, используемым для дальнейшей обработки. ( B ) Линейный график Гинье, рассчитанный на основе встроенных данных SAXS, не показывает никаких признаков агрегации C1 или межмолекулярного отталкивания.Остаточный график показан по адресу Справа . ( C ) График Кратки данных предполагает, что C1 в основном жесткий, но с некоторой внутренней гибкостью. ( D ) Усредненная модель C1 на основе 100 ab initio моделей, рассчитанных с помощью DAMMIN. ( E ) Пример выходной модели твердого тела, в которой фрагменты CCP1-CCP2-SP направлены вверх по сравнению с центральной плоскостью комплекса.

SAXS-анализ C1q. (…

SAXS-анализ C1q. ( A ) Данные рассеяния C1q представлены как…

SAXS-анализ C1q. ( A ) Данные рассеяния C1q представлены как I ( q ) в логарифмическом масштабе относительно q .( B ) График Гинье рассчитан на основе данных SAXS. Остаточный график показан по адресу Справа . ( C ) Функция распределения парных расстояний для C1q, указывающая на частицу с D _max , приближающуюся к 45 нм. ( D ) График Кратки для C1q предполагает, что C1q в основном жесткий, но с некоторой гибкостью внутри молекулы.

Неактивированные домены SP…

Домены SP в неактивированном C1 расположены на периферии…

Домены SP в неактивированном C1 расположены на периферии молекулы.( A ) Схематическое изображение доменной структуры молекулы C1 и ограничений, наложенных во время уточнения твердого тела по сравнению с данными МУРР. ( B ) Входная модель для уточнения. ( C ) Типичная выходная модель со всеми четырьмя доменами SP, расположенными на периферии C1r ₂ s ₂ , расположенных в центральной плоскости C1. ( D ) Средние по классу комплекса C1, полученного с помощью отрицательного окрашивания EM. Типичные средние значения классов показывают 8–10 выступающих глобулярных доменов, расположенных вокруг сети центральных плотностей.Предварительно назначенные глобулярные головки C1q помечены буквой «g», а ориентировочные центры C1q — буквой «h». ( E ) Крио-ЭМ комплекса С1. Столбцы 1 и 3 показывают средние значения криогенного класса для образца, а столбцы 2 и 4 — вычисленные проекционные изображения модели SAXS. Каждому среднему классу вручную назначается проекционное изображение с аналогичным контуром. Несмотря на более сильное размытие, вызванное дефокусом, все еще можно различить от шести до девяти выступающих глобулярных доменов, и имеется хорошее общее согласие модели SAXS с данными крио-ЭМ.(Масштабные полосы: C , 5 нм; E , 50 нм.)

Доработка двигателя С1 старт…

Усовершенствование твердого тела C1, начиная с фрагмента C1r CCP1-CCP2-SP, помещенного внутри…

Уточнение твердого тела C1, начиная с фрагмента C1r CCP1-CCP2-SP, помещенного внутри центральной полости. ( A ) Входная модель для уточнения с фрагментами C1r CCP1-CCP2-SP, помещенными внутри центральной полости. ( B ) Типичная выходная модель со всеми четырьмя доменами SP, расположенными на периферии C1r ₂ с ₂ , расположенных в центральной плоскости C1, показывая, что конформация C1r во входной модели не оказывала существенного смещения на выходные модели. при доработке твердого тела.

Все фигурки (8)

Комментарий в

• Ответ Арлауду и др .: Структура комплекса C1 и несвязанного C1r ₂ с ₂ тетрамера.

  Мортенсен С.А., Сандер Б., Йенсен Р.К., Педерсен Дж.С., Голас М., Йенсениус Дж.С., Хансен А.Г., Тиль С., Андерсен Г.Р.Мортенсен С.А. и др. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2017, 18 июля; 114 (29): E5768-E5770. DOI: 10.1073 / pnas.1704353114. Epub 2017 12 июля. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017. PMID: 28701383 Бесплатная статья PMC. Рефератов нет.

• Строение С1 комплекса комплемента.

  Арлауд Дж. Дж., Габорио С., Линг В. Л., Тиленс Н. М..Арлауд Дж. Дж. И др. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2017, 18 июля; 114 (29): E5766-E5767. DOI: 10.1073 / pnas.1703977114. Epub 2017 12 июля. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017. PMID: 28701384 Бесплатная статья PMC. Рефератов нет.

Похожие статьи

• Экспрессия рекомбинантного человеческого комплемента C1q позволяет идентифицировать сайты связывания C1r / C1s.

  Балли I, Анселет С., Морискот С., Гонне Ф., Мантовани А., Даниэль Р., Шон Дж., Арлауд Дж. Дж., Тиленс Н. М.. Bally I, et al. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2013 21 мая; 110 (21): 8650-5. DOI: 10.1073 / pnas.1304894110. Epub 2013 6 мая. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013. PMID: 23650384 Бесплатная статья PMC.

• Картирование поверхностной доступности тетрамера C1r / C1s с помощью химической модификации и масс-спектрометрии дает новое понимание сборки комплекса C1 человека.

  Brier S, Pflieger D, Le Mignon M, Bally I, Gaboriaud C, Arlaud GJ, Daniel R. Brier S, et al. J Biol Chem. 15 октября 2010 г .; 285 (42): 32251-63. DOI: 10.1074 / jbc.M110.149112. Epub 2010 30 июня. J Biol Chem. 2010 г. PMID: 205

Бесплатная статья PMC.
• Структура, функции и молекулярная генетика C1r человека и мыши.

  Arlaud GJ, Gaboriaud C, Garnier G, Circolo A, Thielens NM, Budayova-Spano M, Fontecilla-Camps JC, Volanakis JE.Арлауд Дж. Дж. И др. Иммунобиология. 2002 сентябрь; 205 (4-5): 365-82. DOI: 10.1078 / 0171-2985-00139. Иммунобиология. 2002 г. PMID: 12396000 Рассмотрение.

• Структурная основа взаимодействия C1q / C1s и его центральная роль в сборке комплекса C1 активации комплемента.

  Venkatraman Girija U, Gingras AR, Marshall JE, Panchal R, Sheikh MA, Harper JA, Gál P, Schwaeble WJ, Mitchell DA, Moody PC, Wallis R.Венкатраман Гириджа У и др. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2013 20 августа; 110 (34): 13916-20. DOI: 10.1073 / pnas.1311113110. Epub 2013 6 августа. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013. PMID: 23

  9 Бесплатная статья PMC.

• Структурная биология C1: расчленение сложной молекулярной машины.

  Арлауд Дж. Дж., Габорио К., Тиленс Н. М., Росси В., Берш Б., Эрнандес Дж. Ф., Фонтесилла-Кэмпс Дж. С..Арлауд Дж. Дж. И др. Immunol Rev.2001, апрель; 180: 136-45. DOI: 10.1034 / j.1600-065x.2001.1800112.x. Иммунол Ред. 2001. PMID: 11414355 Рассмотрение.

Процитировано

• Профессор Роберт Брейдвуд Сим — «Боб» — карьера в области исследований комплемента с 1973 по 21 год.

  Рид К. Рид К. Вирусы. 2021, 22 июня; 13 (7): 1190. DOI: 10.3390 / v13071190. Вирусы. 2021 г. PMID: 34206368 Бесплатная статья PMC.

• Белки комплемента как растворимые рецепторы распознавания образов патогенных вирусов.

  Муругайя В., Варгезе П.М., Бейраг Н., Де Кордова С., Сим Р.Б., Кишор Ю. Муругайя V и др. Вирусы.2021 г. 2 мая; 13 (5): 824. DOI: 10.3390 / v13050824. Вирусы. 2021 г. PMID: 34063241 Бесплатная статья PMC. Рассмотрение.

• Активация классического комплемента и инфламмасомы сходится в моноцитах CD14highCD16- при ВИЧ-ассоциированном воспалительном синдроме восстановления иммунной системы при ТБ.

  Lage SL, Wong CS, Amaral EP, Sturdevant D, Hsu DC, Rupert A, Wilson EMP, Qasba SS, Naqvi NS, Laidlaw E, Lisco A, Manion M, Sereti I.Lage SL, et al. PLoS Pathog. 2021 31 марта; 17 (3): e1009435. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1009435. eCollection 2021 Март. PLoS Pathog. 2021 г. PMID: 33788899 Бесплатная статья PMC.

• Роль макроглобулина альфа 2 в агрегации IgG и хронической активации системы комплемента у пациентов с хроническим лимфолейкозом.

  Насералдин Н., Мишелис Р., Бархум М., Чезар Дж., Тадмор Т., Авив А., Швидель Л., Литманович А., Шехадех М., Стемер Г., Шауль Е., Бестер А.Naseraldeen N, et al. Фронт Иммунол. 2021, 11 февраля; 11: 603569. DOI: 10.3389 / fimmu.2020.603569. Электронная коллекция 2020. Фронт Иммунол. 2021 г. PMID: 33643290 Бесплатная статья PMC.

• Роль комплемента в черепно-мозговой травме после внутримозгового кровоизлияния: обзор.

  Holste K, Xia F, Garton HJL, Wan S, Hua Y, Keep RF, Xi G. Холсте К. и др. Exp Neurol.2021 июн; 340: 113654. DOI: 10.1016 / j.expneurol.2021.113654. Epub 2021 20 февраля. Exp Neurol. 2021 г. PMID: 33617886 Рассмотрение.

Типы публикаций

• Поддержка исследований, за пределами США. Правительство

Условия MeSH

• Комплемент C1r / химия *
• Комплемент C1r / генетика
• Комплемент C1r / метаболизм
• Дополнение C1s / химия *
• Дополнение C1s / генетика
• Комплемент C1s / метаболизм
• Путь комплемента, классика / физиология *
• Рекомбинантные белки / химия
• Взаимосвязь между структурой и деятельностью

LinkOut — дополнительные ресурсы

• Источники полных текстов

• Другие источники литературы

• Медицинские

Комплемент и его роль в врожденных и адаптивных иммунных ответах

Каскад комплемента и его ингибиторы

Классический путь

C1 является первой молекулой в классическом каскаде комплемента и включает C1q и две молекулы C1r и C1s соответственно.C1q прикрепляется к антителам, связанным на поверхности патогена, что приводит к активации C1s. C1s расщепляет присутствующий в плазме C4, высвобождая C4a и C4b. C4b связывает C2, который впоследствии расщепляется C1s. Это приводит к высвобождению C2b и C2a. C2a остается связанным с C4b с образованием конвертазы C3 классического пути (C4b2a). C2a в комплексе конвертаз расщепляет C3, высвобождая C3a и C3b. Последний связывается с комплексом C3-конвертазы с образованием C4b2a3b, конвертазы C5 классического пути. Этот комплекс расщепляет C5, что приводит к высвобождению C5a и C5b.C5b последовательно связывается с C6, C7 и C8 с образованием комплекса, который прикрепляется к внешней поверхности плазматической мембраны патогена. Эта сборка действует как рецептор для C9, а также способствует олигомеризации последнего в пору (MAC), что обеспечивает свободный обмен ионами и жидкостью между внеклеточным и внутриклеточным пространствами, что приводит к осмотическому лизису клеток.

C1 является первой молекулой в классическом каскаде комплемента и включает C1q и две молекулы C1r и C1s соответственно.C1q прикрепляется к антителам, связанным на поверхности патогена, что приводит к активации C1s. C1s расщепляет присутствующий в плазме C4, высвобождая C4a и C4b. C4b связывает C2, который впоследствии расщепляется C1s. Это приводит к высвобождению C2b и C2a. C2a остается связанным с C4b с образованием конвертазы C3 классического пути (C4b2a). C2a в составе конвертазного комплекса расщепляет C3, высвобождая C3a и C3b. Последний связывается с комплексом C3-конвертазы с образованием C4b2a3b, конвертазы C5 классического пути. Этот комплекс расщепляет C5, что приводит к высвобождению C5a и C5b.C5b последовательно связывается с C6, C7 и C8 с образованием комплекса, который прикрепляется к внешней поверхности плазматической мембраны патогена. Эта сборка действует как рецептор для C9, а также способствует олигомеризации последнего в пору (MAC), что обеспечивает свободный обмен ионами и жидкостью между внеклеточным и внутриклеточным пространствами, что приводит к осмотическому лизису клеток.

Лектиновый путь

Маннан-связывающий лектин (MBL) и MBL-ассоциированные сериновые протеазы (MASP) участвуют в начальной стадии лектинового пути активации комплемента.Связывание MBL с маннозой и N-ацетилглюкозамином в микроорганизмах приводит к активации MASP, которые впоследствии расщепляют C4 и C2. После этих событий расщепления активация пути комплемента продолжается, как и в классическом пути.

Альтернативный путь

Альтернативный путь активации комплемента находится в постоянном состоянии активации низкого уровня (известном как тиквер). C3 гидролизуется в плазме до C3i, который обладает многими свойствами C3b.Затем C3i связывает белок плазмы, фактор B. Связанный фактор B расщепляется фактором D с образованием Ba и Bb. Ba высвобождается, а оставшийся комплекс, состоящий из C3iBb, образует конвертазу C3 альтернативного пути. Большая часть C3b, вырабатываемого конвертазой, гидролизуется. Однако, если C3b вступает в контакт с вторгающимся микроорганизмом, он связывается, и усилению альтернативного пути способствует связывание C3b с фактором B. Белок плазмы, пропердин, стабилизирует конвертазу C3 для продления активности.C3b, продуцируемый этим путем, также дает конвертазу C5, C3bBb3b, которая приводит к продукции C5a и C5b. Обратите внимание, что C3b, образующийся в классическом пути, попадает в альтернативный путь, чтобы усилить активацию комплемента.

Ингибиторы системы комплемента

Каскад комплемента строго контролируется для защиты клеток-хозяев от неизбирательной атаки. Ингибиторы комплемента включают ингибитор сериновой протеиназы плазмы серпин (инактиватор С1). Белки плазмы, фактор I и связывающий белок C4 (C4-bp), подавляют активность классической конвертазы C3.Активация классического пути также ингибируется поверхностно связанными белками, CD55 (также известным как фактор ускорения распада или DAF), CD35 (также известным как рецептор комплемента 1 или CR1) и CD46 (также известный как белок мембранного кофактора или MCP).