Никотиновая кислота для роста: Никотиновая кислота для роста волос. Инструкция

Чтобы никотиновая кислота принесла волосам пользу, а не вред, ознакомьтесь с некоторыми предостережениями по поводу ее использования.

• Людям с повышенным давлением лечение волос никотинкой не подойдет. Ее применение может вызвать головную боль.
• Поскольку средство способствует расширению кровеносных сосудов, оно противопоказано при кровоизлияниях и кровотечениях, которые может усилить.
• В сутки можно втирать не больше одной ампулы никотиновой кислоты, этого будет вполне достаточно. Кровь разнесет ее по всей поверхности головы.
• В случае возникновения аллергии при следующем применении кислоты попробуйте разводить ее пополам с водой. Если реакция слишком сильная, от использования никотиновой кислоты следует отказаться.

Применение

Для усиления роста волос

1. Волосы вымойте и чуть подсушите.
2. Вотрите одну или две ампулы никотиновой кислоты (в зависимости от длины волос) в кожу головы.
3. Смывать кислоту не надо, просто высушите волосы обычным способом.
4. Делайте такие процедуры каждый день в течение месяца.

Для питания шевелюры

1. Разведите 1 ампулу никотиновой кислоты в 50 мл сока алоэ.
2. Полученным средством смажьте волосы.
3. Держите в течение двух часов, потом смойте обычным способом.
4. Повторяйте такие процедуры в течение недели, после чего сделайте месячный перерыв.

После такого ухода ваши волосы станут блестящими и шелковистыми, а на ощупь – гладкими и живыми. А чтобы проверить, насколько эффективна эта кислота для роста волос, сфотографируйте вашу шевелюру в начале использования препарата и после. Результат вас приятно удивит!

: Домашний уход :: «ЖИВИ!

С ниацином, как еще называют никотиновую кислоту, делают домашние процедуры для укрепления волос и стимуляции их роста — массажи, маски, скрабы, добавляют ее и в косметику.

Надо сказать, что изначально никотиновая кислота предназначена не для косметического ухода. Это вещество (представитель группы витаминов В) прописывают для специфического лечения авитаминоза. Ольга Молчанова, заведующий отделением дерматологии, врач-дерматовенеролог, трихолог, к. м. н., Клинико-диагностического центра МЕДСИ на Белорусской. — В организме никотиновая кислота в малых количествах синтезируется в кишечнике с помощью бактериальной флоры и витаминов В6, В2 из триптофана, а также поступает с белковыми и растительными продуктами (мясо, морепродукты и рыба, орехи, грибы, некоторые сухофрукты). Основная польза ниацина для кожи и волос заключается в улучшении кровообращения и > функции крови — доставки кислорода и питательных веществ для роста и развития клеток>>. Стимулируя кровообращение, мы улучшаем питание клеток кожи и волосяных фолликул. За счет этого формируются здоровые и крепкие стержни волос. Они меньше выпадают.

На фото: Ольга Молчанова, заведующая отделением дерматологии, врач-дерматовенеролог, трихолог, к. м. н., Клинико-диагностического центра МЕДСИ на Белорусской.

Как использовать никотиновую кислоту для ухода за волосами

Ниацин выпускают в виде таблеток и раствора для инъекций. >.

Никотиновая кислота: противопоказания

Решив подлечить волосы с помощью никотиновой кислоты, имейте в виду, что она небезопасна. При использовании препарата из-за интенсивного местнораздражающего действия может появиться стойкое покраснение кожи с зудом и жжением. Почувствовав дискомфорт, откажитесь от дальнейшего применения никотиновой кислоты. С ниацином следует быть осторожным людям с жирной кожей головы. Это вещество может усилить активность сальных желез.

Рецепты для ухода за волосами с никотиновой кислотой

Вот самые эффективные и безопасные способы использования никотиновой кислоты для домашнего ухода за волосами

Вместо ампульной косметики для волос

Этот способ работает по аналогии с использованием ампульной косметики, только в кожу головы втираете никотиновую кислоту. Для 1 процедуры вам понадобятся 1-2 ампулы никотиновой кислоты. Используйте средство полностью — остатки средства для дальнейшего использования хранить не следует. Перед нанесением никотиновой кислоты голову желательно вымыть.

• Вотрите никотиновую кислоту в кожу головы массажными движениями, разделив волосы на секции.
• Оберните голову на 20-30 минут махровым полотенцем — тепло усилит эффективность процедуры.
• Мыть голову после процедуры не нужно. Сделайте курс из 25-30 процедур.

Маски для волос с никотиновой кислотой

Рекомендуется проводить курсом — 5-6 масок с интервалом в три дня.

Маска для стимулирования роста волос

Смешайте 1 ампулу никотиновой кислоты, 1 ст.л. сока алоэ вера, 15-20 капель настойки красного перца, 1/4 стакана оливкового масла. Полученную смесь вотрите массажными движениями в чистую кожу головы. Оберните голову целлофаном, затем махровым полотенцем. Оставьте на волосах на 20-30 минут, затем тщательно промойте волосы.

Маска от выпадения волос

Смешайте 2 ампулы никотиновой кислоты, 1 мл витамина А, 1/5 ст репейного масла, 20 капель витамина Е. Полученную смесь нанесите массажными движениями на кожу головы и волосы. Покройте голову целлофаном и махровым полотенцем. Через 20-30 минут тщательно промойте волосы с шампунем.

Питательная маска для сухих и поврежденных волос

Смешайте 1 ампулу никотиновой кислоты, 30 мл меда, 40 мл оливкового масла, 1 желток. Полученную смесь вотрите массажными движениями в чистую кожу головы. Оберните голову целлофаном, затем махровым полотенцем. Оставьте на волосах час, затем тщательно промойте волосы.

Смешайте 1 ст.л. морской соли, 1 ампулу никотиновой кислоты, 3 капли эфирного масла (кедра, бергамота, шалфея, можжевельника). Полученную смесь нанесите на кожу головы массажными движениями, оставьте для воздействия на 5-7 минут, затем тщательно промойте волосы с шампунем .

Еще больше полезной информации о том, как укрепить волосы и оздоровить кожу головы вы найдете здесь и здесь.

Маски для роста и укрепления волос с никотиновой кислотой

Применение никотиновой кислоты для улучшения роста волос, ослабленных стрессами и авитаминозом, может стать чудодейственным средством, если знать, как правильно ее использовать. И цена никотинки намного меньше, чем стоимость салонного ухода.

Что такое никотиновая кислота

Несмотря на название, к табаку и вредным привычкам она отношения не имеет. Это лекарственный препарат, являющийся одной из форм витамина В (PP), его также можно встретить под названием ниацин и никотинамид .

В медицине раствор никотиновой кислоты используют для лечения заболеваний, связанных с нарушением обмена веществ и острым недостатком витаминов. Они и бывают главными причинами проблем с волосами.

Ниацин существует в виде белесых мелких крупинок, хорошо растворимых в горячей воде. Но чаще витамин PP встречается в виде раствора в ампулах или в таблетках.

Колют ее, как правило, внутривенно, так как внутримышечное введение очень болезненно. Сосудорасширяющие свойства никотиновой кислоты используются также при физиотерапевтическом лечении волос электрофорезом.

В чем польза для волос

Волосы – это лакмусовая бумажка, отражающая состояние организма. Они первыми проявляют негативные изменения, происходящие в нем: становятся тоньше, медленнее растут, тускнеют, начинают выпадать.

Если нет более серьезных причин, то часто это происходит из-за дефицита витамина В. Ведь именно он влияет на кератиновый белок – главную составляющую волоса.

Ускорение роста волос

При нанесении никотиновой кислоты на кожу головы, она дает согревающий эффект. «Задремавшие» из-за стресса или диеты волосяные луковицы можно отлично простимулировать.

Витамин PP активизирует кровоснабжение сосудов кожи головы, что дает фолликулам дополнительную энергию для более быстрого роста волос. В результате состояние волос улучшается, они становятся более упругими, толстыми и лучше держат форму.

Лечение облысения

Сосудорасширяющее свойство никотиновой кислоты помогает при лечении выпадения волос. Восстановление волос происходит благодаря усилению кровотока в коже, насыщению кислородом и витаминами волосяных луковиц.

Противопоказания и вред

Витамин PP легко купить в аптеке без рецепта. Но не стоит самостоятельно назначать курс уколов для улучшения состояния волос. Так можно скорее навредить, чем получить пользу для шевелюры. Его не стоит использовать если у вас имеется:

• Повышенная чувствительность к витамину;
• Язвенные болезни органов пищеварения;
• Высокое артериальное давление и атеросклероз;
• Заболевания почек и печени.

Относительными противопоказаниями являются беременность и кормление грудью.
Но и у здоровых людей могут возникнуть побочные эффекты даже при наружном использовании средства:

• Заметное покраснение кожи головы, шеи, плеч с ощущением ожога;
• Головокружение, связанное с понижением давления из-за сосудорасширяющего эффекта применения препарата;
• Расстройства желудка и кишечника.

Способы применения никотиновой кислоты в домашних условиях

Ниацин может использоваться в чистом виде или для приготовления масок, шампуней и эликсиров.

Жирные волосы перед процедурой лучше вымыть, чтобы облегчить проникновение в их структуру. При сухих волосах не стоит наносить чистый раствор на всю длину, он сделает их еще более слабыми и тонкими. В этом случае лучше сочетать ее с другими ингредиентами.

Правила использования

Учитывая противопоказания и побочные эффекты от применения никотиновой кислоты, а также ее свойства и особенности воздействия на волосы и кожу, желательно придерживаться некоторых рекомендаций:

• Для нанесения на волосы используется раствор, а не таблетки;
• Сначала стоит попробовать средство на руке и подождать некоторое время. Если нет негативной реакции, можно пользоваться средством;
• Не следует пугаться легкого покалывания на коже, это нормальная реакция, означающая, что никотиноамид работает. Если же чувствуется сильное жжение, лучше смыть средство с помощью шампуня;
• Для 1 процедуры достаточно использовать 2 ампулы. Большее количество может дать обратный эффект;
• Если негативная реакция возникла после нескольких сеансов в виде появления или усиления перхоти, стоит поискать другое средство для волос.

Как втирать в кожу головы

• Вскрыть 2 ампулы и вылить в пластиковую или стеклянную посуду.
• Чистые и чуть влажные волосы разделяют с помощью расчески с острым концом. Массажными движениями втирают в кожу лба, затем в боковые части и в последнюю очередь затылок.
• Наносят средство в полиэтиленовых перчатках или чистой кистью для окрашивания. Раствор не вытирают полотенцем и не смывают водой. Он не имеет запаха, не меняет цвет волос, так что можно спокойно выходить «в люди».

Чтобы увидеть эффективность никотиновой кислоты для роста волос достаточно применять ее в течение месяца. Если есть необходимость в повторении курса лечения, то лучше провести его через 10-20 дней.

Таблетки и инъекции

Такие процедуры обязательно должны быть согласованы с врачом. Так как, если проблемы с волосами вызваны другими причинами, вместо толстой косы можно получить гипервитаминоз и множество иных неприятностей со здоровьем.

• Ниацин участвуют в окислительных процессах организма. Поэтому прием таблеток оказывает положительное влияние на рост и качество волос. Курс — 15 дней по 2 таблетки в сутки с водой или молоком. Перед приемом следует обязательно поесть.
• Внутривенные инъекции никотиновой кислоты способствуют укреплению и быстрому росту волос.
• Делать уколы в голову не стоит. Такие «инъекции красоты» могут спровоцировать жесточайший приступ аллергии, гипертонический криз или инсульт.
• Уколы или таблетки лучше сочетать с наружным применением раствора, так эффективность процедуры будет выше.

Маски для роста и укрепления волос с никотиновой кислотой

Самый простой рецепт маски – добавить витамин PP в шампунь, 1 ампулу на одну порцию для мытья голову. Шампунь следует подержать на голове 5-7 минут, затем смыть.
Никотинку полезно добавлять в отвары ромашки, сок алоэ и имбиря. Маски с никотиновой кислотой делают каждый день в течение месяца, не забывая наблюдать за реакцией кожи. Волосы при этом должны быть чистыми и чуть влажными.

Для сухих волос

• 1 ампула витамина PP;
• 1 капсулу витамина Е;
• 2 ст. л. льняного масла;
• 1 ст. л. аптечной настойки элеутерококка.

Маска наносится на корни и всю длину волос. Достаточно подержать ее 1 час, чтобы почувствовать эффект. В результате волосы становятся упругими, но послушными и быстрее растут. Средство смывается горячей водой.

Для всех типов волос

С прополисом и алоэ

По 2 чайные ложки:

• никотиновой кислоты;
• сока алоэ;
• настойки прополиса.

Ингредиенты маски смешиваются и наносятся на волосы и кожу головы на 40 минут. Через пару минут появится ощущение приятного покалывания и тепла. Маска хорошо помогает при выпадении волос.

С яйцом и медом

• 1 сырого желтка;
• 1 ч. л. меда;
• ½ ч. л. витамина Е;
• 2 ст. л. оливкового масла
• 1 ампулы никотинки.

Маску нужно втереть к кожу головы и нанести по всей длине волос. Спустя 1 час следует смыть средство шампунем. Витамин Е и оливковое масло сохраняют нужное количество влаги. Мед тонизирует кожу, укрепляет волосы и насыщает микроэлементами.

Для тонких волос

• 1 упаковка бесцветной хны;
• ½ ст. л. дрожжей;
• 1 ампула никотиновой кислоты;
• несколько капель масла лимонной вербены.

Хну заваривают кипятком и остужают до 40 градусов. Дрожжи разводят водой. Объединив ингредиенты, добавляют масло и витамин PP. Держать маску нужно 1 час, замотав голову пленкой и платком, смывать шампунем.

Маска с никотиновой кислотой останавливает выпадение и ускоряет рост волос. Бесцветная хна делает локоны толще и жестче, благодаря чему они становятся объемнее. Дрожжи восстанавливают структуру каждого волоска. Масло лимонной вербены увлажняет.

Где купить

Для ухода за волосами применяется 1%-й раствор витамина PP. Обычная фасовка — 10 ампул по 1 мл. Для разовой процедуры хватит 1-2 штук. 

Польза никотинки уже проверены многими женщинами. Ничто не мешает сочетать препарат с другими полезными составляющими. Ведь каждая из нас знает, что любят ее волосы.

С заботой о Вас наши любимые девочки!

Rinail.ru

Никотиновая кислота для волос: отзывы и правила применения

Витамины для волос можно не только пить курсом или получать из пищи. Например, витамин РР или В3 (никотиновая кислота), часто используется в качестве внешней терапии.

Никотиновая кислота для роста волос продается в любой аптеке в виде ампул. Вы можете добавлять жидкость одной ампулы в бальзам, маску или шампунь, но такой вид терапии будет малоэффективным. Дело в том, что «никотинка» быстро испаряется, поэтому она может даже не «дойти» до кожи головы, особенно, если вы используете ее в составе бальзама, который в принципе не наносится на корни волос. Поэтому никотиновую кислоту для роста волос стоит использовать другим образом.

Instagram: @gigiadid

Зачем использовать никотиновую кислоту для волос

При недостатке витамина В3 в нашем организме замедляются окислительно-восстановительные реакции, из-за чего все питательные и полезные вещества плохо впитываются. В медицине никотиновую кислоту прописывают для лечения заболеваний, связанных с нарушением обмена веществ, а также острым авитаминозом. Именно эти состояния и являются главными виновниками замедления роста волос. Вот, почему «никотинка» так эффективна для решения этой проблемы.

Показания для использования никотиновой кислоты следующие:

1. Тонкие и редкие локоны: никотиновая кислота расширяет капилляры, улучшая кровообращение. Таким образом, она активирует «спящие» фолликулы и стимулирует рост новых волосков.

2. Чрезмерная жирность волос: витамин В3 по консистенции напоминает обычную воду, но, впитываясь в кожу головы, она помогает регулировать сальные железы. При регулярном использовании кожа будет жирнеть реже.

3. Тусклость и ломкость волос: ниацин (никотиновая кислота) «запечатывает» чешуйки волос и делая их более гладкими. На волосах образуется тонкая защитная пленка, которая делает локоны более плотными и блестящими.

Instagram: @rosiehw

Как использовать никотиновую кислоту для роста волос

Самый эффективный способ использования витамина В3 — нанесение витамина в чистом виде на очищенную кожу головы. Для этого тебе нужно 2 ампулы на один сеанс. Помойте голову, просушите волосы процентов на 70. Сделайте центральный пробор. Обмокните пальцы в «никотинку» и массирующими движениями втирайте в кожу головы. Затем сделайте пробор на 1 см дальше и проделайте то же самое. И так по всему периметру головы.

Курс терапии с витамином В3 расчитан на 15 применения через день или два. Отзывы о применении никотиновой кислоты для роста волос говорят о том, что за месяц локоны должны стать длиннее на 2-3 см, при нормальном росте в 1-1,5 см. После курса терапии стоит сделать перерыв на месяц, потом можно повторить при желании.

Будьте аккуратны: не рекомендуется сушить волосы феном в течение 30 минут после нанесения витамина. Также не нужно наносить ниацин на волосы после использования фена: локоны должны «остыть», чтобы никотиновая кислота не испарилась с кожи.

Instagram: @mirandakerr

По материалам cosmo.com.ua

Никотиновая кислота: простой и безопасный способ увеличить выработку гормона роста

Рисунок 1 — Структура никотиновой кислоты

Гормон роста (GH), кажется, подвергается большой критике в субкультуре бодибилдинга; люди либо любят это, либо ненавидят. Вместо того, чтобы баловаться дебатами о пользе / использовании GH в отношении спортивных результатов, я считаю более благоразумным изучить корреляцию между обычным B-витамином ниацином (витамин B3) и секрецией гормона роста in vivo.

Прежде чем углубиться в подробности этой статьи, имейте в виду, что ниацин в дозах, предложенных в исследованиях, включенных в настоящий документ, нельзя получить только из пищевых источников. Людям потребуется токсичное количество говядины (> 15 фунтов в день) для достижения номинального количества ниацина, которое усиливает высвобождение гормона роста. Так что нет, вы не можете просто есть продукты, богатые ниацином, чтобы достичь эффекта, наблюдаемого в этих исследованиях.

Исследование, проведенное Stokes et. соавторы обнаружили, что субъекты, которые принимали значительно большие болюсы (примерно от 1000 до 3000 мг) из ниацина ( никотиновая кислота), демонстрировали «усиленное» высвобождение гормона роста с некоторой задержкой (т.е.е. примерно через 5 часов после приема дозы). [1]

На рисунке выше вы можете увидеть экспоненциальное увеличение уровней GH, которое произошло в группе, получавшей ниацин, по сравнению с контрольной группой (которая не принимала дополнительный ниацин). Имейте в виду, что в этом исследовании изучались люди, которые завершили спринтерские интервалы на велосипедах. Таким образом, был сделан вывод, что ниацин оказывает стимулирующее действие на высвобождение гормона роста, которое мы обычно достигаем при соответствующих анаэробных упражнениях высокой интенсивности.

Также обратите внимание, насколько значительным было увеличение GH. Во время пикового интервала времени (300 минут после лечения) у лиц, получавших ниацин, наблюдалось на 600-1500% большее увеличение GH по сравнению с контрольной группой. Фактически, эти уровни были большими секрециями, чем мы обычно достигаем во время самой глубокой фазы сна, которая в противном случае является самым большим естественным эндогенным выбросом GH, который мы когда-либо вызывали.

Таким образом, мы можем экстраполировать из этого исследования открытие, что ниацин все еще может быть полезен для людей даже без упражнений, поскольку он будет стимулировать значительную секрецию GH даже при отсутствии упражнений.

Это означает, что при правильном выборе времени и включении в ваш тренировочный / кардио режим, ниацин может предоставить простой, безопасный и законный способ естественным образом воспользоваться преимуществами собственной секреции GH вашего тела.

Польза ниацина для похудания и наращивания мышечной массы

Многие люди будут утверждать, что GH в физиологических диапазонах бесполезен, но я не могу согласиться с такой позицией. GH является мощным антикатаболическим гормоном у людей и служит косвенным посредником в смеси анаболических гормонов.[2] Гормон роста также оказался полезным средством для сжигания жира, особенно у людей, страдающих натощак, поскольку он оказывает прямое воздействие на различные пептиды кишечника, такие как лептин и грелин. [3] Кроме того, GH способствует более глубокому и более спокойному сну, что необходимо как бодибилдерам, так и любителям тренажерного зала.

Более того, эндогенные уровни GH, достигнутые после приема ниацина, довольно значительны. Я осторожно отношусь к описанию этих уровней как «фармакологических», потому что я не хочу, чтобы люди думали, что прием ниацина вызовет те же эффекты, что и прием экзогенного гормона роста (потому что, честно говоря, не многое может воспроизвести сам пептид).

Вывод из включенных здесь исследований, однако, заключается в том, что мы все еще можем воспользоваться этим дополнительным «преимуществом» от простой, безопасной и легальной безрецептурной добавки, которая представляет собой ниацин / никотиновую кислоту (витамин B3). Имейте в виду, что никотиновая кислота — это не то же самое, что ниацинамид или гексаникотинат инозита! Вам нужна добавка в чистом виде ниацина (кислотная форма), а не в форме, связанной с амидом или инозитом.

Рекомендуемое использование ниацина

Для людей, которые соблюдают периодическое голодание (или тренируются голодным):

Принимайте 1–3 г (начните с нижнего предела и увеличивайте при необходимости) примерно 3-4 часа (180–240 минут до тренировки).

Причина такой разницы во времени между приемом ниацина и физическими упражнениями заключается в том, что GH является гормоном с замедленным действием по своим липолитическим и антикатаболическим эффектам. [4] Оптимально, если вы хотите повысить уровень гормона роста на ранней стадии или даже до того, как начать тренировку, и дать своему организму 20-30 минут, чтобы ослабить его реакцию.

–Кроме того, этот вариант должен предоставить тренирующимся натощак максимальную выгоду от их собственной секреции GH и предоставить достаточно времени для тренировки, а затем нарастить уровень инсулина в посттренировочной фазе (который по большей части является антагонистом GH).

Для учеников, которые тренируются в сытом состоянии (особенно после инсулиногенной / углеводной еды):
Принимайте ниацин (в тех же дозах, что и выше) примерно через 1,5–2 часа после последнего приема пищи перед тренировкой. Гипотеза для этого дозирования заключается в том, что он должен найти золотую середину между возвращением инсулина к исходным уровням и тем, чтобы позволить GH проявить свои эффекты как раз вовремя, чтобы вы могли тренироваться или делать кардио.

ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы придерживаетесь низкоуглеводной диеты / кето диеты, вы можете следовать протоколу, аналогичному протоколу группы натощак, поскольку ваш уровень инсулина должен быть относительно статичным в течение дня.

В дни, не связанные с тренировками и / или перед сном:
Учитывая данные / результаты, обсуждаемые здесь, возможно, одним из самых разумных периодов приема ниацина будет 60-90 минут перед сном. Постулат здесь состоит в том, что вы можете получить значительно «избыточную» (кто-нибудь преувеличивает?) Эндогенную секрецию гормона роста во время сна с дополнительным эффектом ниацина.

Как избежать приливов ниацина:

Большинство читателей, вероятно, знают, что никотиновая кислота может вызывать побочный эффект, известный как покраснение.Это вызывает ощущение зуда и тепла в коже, что немного похоже на «покалывание» бета-аланином, но вызывает большее раздражение. Чтобы избежать промывки ниацином, лучше всего принимать ниацин во время еды или после нее. или начинать с низкой дозы — например, 100 мг — и постепенно увеличивать ее до целевой дозы с шагом от 50 до 100 мг на каждый прием пищи. день.

Другой вариант — принять 325 мг аспирина примерно за 30 минут до запланированной дозы ниацина.

Заключение

Плюс к добавкам ниацина (никотиновой кислоты) в том, что они легко доступны, дешевы, безопасны и на самом деле имеют убедительные клинические доказательства, подтверждающие это.Существует множество других преимуществ ниацина для здоровья, которые не были рассмотрены в этой статье, например, оптимизация профилей холестерина и улучшение когнитивных функций.

Эта статья никоим образом не предлагает вам обозначить ниацин как «чудо-пилюлю», но, тем не менее, он очень эффективен, особенно для увеличения секреции эндогенного гормона роста.

Ссылки:
1.Stokes, K.A., Tyler, C., & Gilbert, K.L. (2008). Реакция гормона роста на повторяющиеся спринтерские упражнения с подавлением липолиза и без него у мужчин. Журнал прикладной физиологии, 104 (3), 724-728.

2. Дэниел-младший, В. А., Эйнсли-Грин, А., Захманн, М., и Прадер, А. (1976). Взаимосвязь терапевтических эффектов гормона роста и тестостерона на рост при гипопитуитаризме. Журнал педиатрии , 89 (6), 992-999.

3. Саломон, Ф., Кунео, Р. К., Хесп, Р., и Сонксен, П. Х. (1989). Влияние лечения рекомбинантным гормоном роста человека на состав тела и метаболизм у взрослых с дефицитом гормона роста. Медицинский журнал Новой Англии , 321 (26), 1797-1803.

4.Куаббе, Х.Дж., Люкс, А.С., Лаге М., и Шварц, К. (1983). Концентрации гормона роста, кортизола и глюкагона во время депрессии свободных жирных кислот в плазме: различные эффекты никотиновой кислоты и производного аденозина (BM 11.189). J. Clin Endocrinol Metab., 57 (2): 410-4.

Почему некоторым видам дрожжей для роста требуется ниацин? Различные режимы синтеза НАД | FEMS дрожжевое исследование

4″ data-legacy-id=»ss0″> Введение

НАД хорошо известен как важный кофермент в различных метаболических реакциях. Недавние исследования показали, что это универсальное соединение играет роль во многих различных клеточных процессах, таких как деацетилирование белка (Lin et al. , 2000; Hekimi & Guarente, 2003; Howitz et al., 2003), моно- и поли-АДФ-рибозилирование (Berger et al. , 2004), передачу сигналов кальция (Guse, 2004) и модуляцию транскрипционной активности (Rutter et al. , 2001; Zhang et al. др. , 2002).

НАД является важным кофактором в живых системах. Два альтернативных пути биосинтеза НАД de novo (начиная с l-аспарагиновой кислоты или l-триптофана) могут использоваться в различных организмах. Многие прокариоты, такие как Escherichia coli (Begley et al., 2001), а некоторые растения, такие как Arabidopsis thaliana (Katoh & Hashimoto, 2004; Katoh et al. , 2006), синтезируют НАД через аспартатный путь. Напротив, большинство эукариот используют путь деградации триптофана (кинуренин) (Katoh & Hashimoto, 2004). Недавно было продемонстрировано, что кинурениновый путь обнаруживается также у некоторых бактерий (Курнасов и др. , 2003). У растения Oryza sativa , вероятно, есть оба пути, согласно поиску сходства взрыва (Katoh & Hashimoto, 2004).Пути аспартата и кинуренина сходятся в хинолиновой кислоте, а затем используются те же стадии реакции для окончательного образования НАД. С другой стороны, в различных реакциях с потреблением НАД, НАД превращается в никотинамид (Berger et al. , 2004), который может быть возвращен обратно в НАД через никотиновую кислоту (Na) и мононуклеотид никотиновой кислоты (NaMN), или через никотинамидмононуклеотид (NMN) путями спасения (Rongvaux et al. , 2003). Такие схемы рециркуляции НАД связывают ниацин (общее название, относящееся как к никотиновой кислоте, так и к никотинамиду) с биосинтезом НАД.В то время как никотинамид может использовать два разных пути спасения, никотиновая кислота универсально превращается в НАД консервативным «путем Прейсс-Хэндлера» (три стадии от никотиновой кислоты до НАД в пути спасения через Na и NaMN) (Rongvaux et al. , 2003 г.). Таким образом, через эти пути биосинтеза НАД (суммированные на рис. 1) как аминокислоты (аспарагиновая кислота и триптофан), так и ниацин могут действовать как предшественники НАД.

1

Схематическое изображение различных путей синтеза НАД.Биосинтез НАД включает два пути de novo — кинурениновый путь и аспартатный путь (начиная с триптофана или аспарагиновой кислоты), а также два пути спасения — через никотиновую кислоту (Na) и мононуклеотид никотиновой кислоты (NaMN) и через мононуклеотид никотинамида ( NMN). Показаны стадии реакции, требующие включения O ₂ .

1

Схематическое изображение различных путей синтеза НАД. Биосинтез NAD включает два пути de novo — путь кинуренина и путь аспартата (начиная с триптофана или аспарагиновой кислоты), а также два пути спасения — через никотиновую кислоту (Na) и мононуклеотид никотиновой кислоты (NaMN) и через мононуклеотид никотинамида ( NMN).Показаны стадии реакции, требующие включения O ₂ .

Большинству видов дрожжей для роста ниацин не требуется. Все такие хорошо известные виды, как Saccharomyces cerevisiae, Debaryomyces hansenii, Candida albicans и Yarrowia lipolytica , являются ниацин-положительными. Однако существует меньшинство дрожжей, которым необходим ниацин (35 из 590 описанных видов ниацин-отрицательные) (Barnett et al. , 1990). К ним относятся Kluyveromyces lactis, Candida glabrata и Schizosaccharomyces pombe (рис.2).

2

Тесты на ауксотрофию никотиновой кислоты различных видов дрожжей. Штаммы дрожжей, представляющие S. cerevisiae (S288C), C. glabrata (CBS138), K. lactis (CBS2359), D. hansenii (CBS767), C. albicans (CBS562), Y . lipolytica (CLIB89) и Schiz. pombe (CBS356) выращивали до стационарной фазы при 28 ° C в полной среде с глюкозой. Культуры центрифугировали, и осадки промывали физиологическим раствором (0.15 М NaCl). Десять микролитров 100-кратно разведенных клеточных суспензий по каплям наносили на среду с минимальным содержанием глюкозы с (верхняя панель) и без никотиновой кислоты (нижняя панель), а затем выращивали при 28 ° C в течение 3 дней (за исключением D. hansenii , который выращивали 4 дня).

2

Тесты на ауксотрофию никотиновой кислоты различных видов дрожжей. Штаммы дрожжей, представляющие S. cerevisiae (S288C), C. glabrata (CBS138), K. lactis (CBS2359), D.hansenii (CBS767), C. albicans (CBS562), Y. lipolytica (CLIB89) и Schiz. pombe (CBS356) выращивали до стационарной фазы при 28 ° C в полной среде с глюкозой. Культуры центрифугировали и осадки промывали физиологическим раствором (0,15 М NaCl). Десять микролитров 100-кратно разведенных клеточных суспензий по каплям наносили на среду с минимальным содержанием глюкозы с (верхняя панель) и без никотиновой кислоты (нижняя панель), а затем выращивали при 28 ° C в течение 3 дней (за исключением D.hansenii , который выращивали 4 дня).

Ниацин участвует в некоторых путях синтеза НАД. Следовательно, возможно, что разные потребности в ниацине разных дрожжей происходят из-за различий в способах биосинтеза НАД. Поскольку большинство генов, непосредственно участвующих в различных путях образования НАД, уже известно, можно реконструировать на основе данных о последовательности генома пути синтеза НАД, действующие у разных видов дрожжей. Для указанных выше семи видов доступны полные последовательности генома (Goffeau et al., 1996; Wood et al. , 2002; Dujon et al. , 2004; Джонс и др. , 2004). Сравнивая эти пути, мы искали возможную основу для различий в потребности в ниацине среди этих дрожжей.

Еще один интерес, который побудил нас изучить пути биосинтеза НАД, — это связь между аэробным / анаэробным ростом и путями биосинтеза НАД в S. cerevisiae , где синтез НАД осуществляется как кинурениновым, так и спасательным путем (Panozzo et al., 2002). Путь кинуренина представляет собой процесс, зависящий от O ₂ , в котором три стадии реакции требуют включения молекулярного кислорода (рис. 1). По этой причине для роста этих дрожжей в среде, обедненной O ₂ , необходим спасательный путь. В то время как S. cerevisiae могут расти анаэробно, многие из этих дрожжей не могут расти без кислорода. Поэтому мы исследовали возможную связь между способностью к анаэробному росту и наличием или отсутствием различных путей биосинтеза НАД у этих дрожжей.

3″ data-legacy-id=»ss2″> Штаммы и среды

Штаммы дрожжей перечислены в таблице 1. Дрожжевые клетки обычно выращивали при 28 ° C в полной среде, содержащей 1% бакто-дрожжевой экстракт (Difco), 1% бакто-пептон (Difco) и 2% глюкозу. При необходимости добавляли 200 мкг мл ^-1 антибиотика G418. Для споруляции диплоидный штамм K. lactis выращивали на чашке ME (5% бакто-солодовый экстракт и 2% бакто-агар, Difco).Синтетическая минимальная среда была приготовлена, как описано (Sherman, 1991), и никотиновая кислота была удалена, как указано.

8″ data-legacy-id=»ss4″> Сравнительный анализ генома и реконструкция путей биосинтеза НАД у дрожжей

Веб-сайты баз данных о видах дрожжей, использованных в этом исследовании, перечислены в конце таблицы 2.поиск взрыва проводился с использованием реализованных в нем инструментов.

Сравнение путей биосинтеза НАД у дрожжей

Сравнение путей биосинтеза НАД у дрожжей

Результаты

Гены, кодирующие ферменты в путях биосинтеза de novo НАД, отсутствуют в геномах K. lactis, C. glabrata и Schiz. Помбе . В дрожжах S. cerevisiae путь кинуренина является признанным путем для биосинтеза НАД de novo , а гены с BNA1 до BNA6 (которые кодируют все ферменты, катализирующие превращение триптофана в мононуклеотид никотиновой кислоты) были идентифицированы, за исключением BNA3 (Schott et al., 1971 г .; Ивамото и др. , 1995; Kucharczyk et al. , 1998; Panozzo et al. , 2002). Используя аминокислотные последовательности из S. cerevisiae , мы с помощью алгоритма blast провели поиск предполагаемых кодирующих последовательностей для ферментов кинуренинового пути в геномных последовательностях шести других видов дрожжей. Результаты представлены в Таблице 2. В D. hansenii, C. albicans и Y. lipolytica были обнаружены ортологи генов BNA1 – BNA6 , что позволяет предположить, что эти три дрожжа имеют кинурениновый путь, аналогичный что в S.cerevisiae . Однако в геномах C. glabrata, K. lactis или Schiz не было обнаружено генов, ортологичных BNA1, BNA2, BNA4, BNA5 и BNA6 . pombe , что указывает на то, что у этих дрожжей отсутствует весь кинурениновый путь. Возможно ли, что эти виды могли использовать путь аспартата для биосинтеза НАД, хотя до сих пор он был обнаружен только у прокариот и растений? Чтобы проверить эту возможность, в геномах был проведен поиск кодирующих последовательностей, соответствующих аминокислотным последовательностям E.coli l-аспартатоксидаза и хинолинатсинтаза. Но ни одного ортолога в геномах этих семи дрожжей обнаружить не удалось (таблица 2). Поиск был повторен с использованием аминокислотных последовательностей тех же ферментов из растения A. thaliana с тем же результатом (данные не показаны). Результаты показали, что C. glabrata, K. lactis и Schiz. pombe также не имеет пути аспартата, обнаруженного в бактериях и некоторых растениях. Это соответствует отсутствию ортолога BNA6 (в S.cerevisiae , этот ген кодирует хинолинатфосфорибозилтрансферазу, которая превращает хинолиновую кислоту в мононуклеотид никотиновой кислоты). Аспартатный и кинурениновый пути сходятся в хинолиновой кислоте. Чтобы дополнительно прояснить, есть ли какие-либо следы генов для синтеза NAD de novo у этих трех дрожжей, мы снова выполнили бластный поиск с использованием нуклеотидных последовательностей. Не было обнаружено значительных совпадений, за исключением BNA3 (данные не показаны). В заключение, биоинформатический анализ показал, что некоторые дрожжи, такие как C.glabrata, K. lactis и Schiz. pombe , вероятно, лишены каких-либо средств биосинтеза NAD de novo , поскольку отсутствуют как кинурениновый путь, так и путь аспартата.

Следует отметить два момента, касающихся отдельных генов кинуренинового пути. В то время как BNA1, BNA2, BNA4, BNA5 и BNA6 имеют ортологи в геномах D. hansenii, C. albicans и Y. lipolytica , все они отсутствуют в геномах K.lactis, C. glabrata и Schiz. Глазурь . BNA3 , однако, является исключением, поскольку он присутствует в каждом геноме, включая те, в которых явно отсутствуют гены кинуренинового пути (Таблица 2). Хотя предполагалось, что BNA3 кодирует арилформамидазу, катализирующую вторую стадию ( N -формил-1-кинуренин в l-кинуренин) пути кинуренина, его точная роль не установлена, в отличие от других пяти генов ( Panozzo et al., 2002). Наши сравнительные геномные данные предполагают, что этот ген может участвовать в другой функции. Во-вторых, две частично перекрывающиеся последовательности, показывающие значительное сходство с BNA6 , как на уровне белка, так и на уровне ДНК, были обнаружены в D. hansenii (Таблица 2). DEHA0F27995g может предсказать полипептид, похожий на N-концевую часть Bna6p и DEHA0F28006g на C-концевую часть. Эти две последовательности были аннотированы как псевдогены в базе данных генома, и их выведенные аминокислотные последовательности были исключены из реестра D.hansenii белков в базе. Присутствие этих двух открытых рамок считывания и тот факт, что D. hansenii может расти в отсутствие никотиновой кислоты (рис.2), строго подразумевает, что эти две последовательности могут действовать как гомолог BNA6 после вероятной ошибки сдвига рамки считывания. был исправлен.

Путь спасения NAD сохраняется во всех семи дрожжах

В дополнение к маршруту биосинтеза de novo , S. cerevisiae может использовать путь спасения (через Na и NaMN) для рециркуляции никотинамида, образующегося в различных реакциях с потреблением НАД.Используя этот путь, никотиновая кислота включается в синтез НАД под действием никотинатфосфорибозилтрансферазы, которая является высококонсервативной от прокариот до эукариот. Данные, представленные в таблице 2, показывают, что этот путь спасения также хорошо сохраняется среди видов дрожжей. В частности, гены никотинатфосфорибозилтрансферазы демонстрируют высокое сходство с NPT1 в S. cerevisiae (Panozzo et al. , 2002) на уровне аминокислотной последовательности. Сообщалось, что млекопитающие используют другой путь спасения (через NMN) для рециркуляции никотинамида посредством реакции, катализируемой никотинамидфосфорибозилтрансферазой (NAmPRTase) (Rongvaux et al., 2002, 2003). Однако наши биоинформатические исследования показали, что у дрожжей, исследованных в этой работе, нет гена, кодирующего предполагаемую NAmPRTase (Таблица 2).

De novo пути и путь спасения с использованием никотиновой кислоты сходятся в NaMN, поэтому они разделяют две стадии реакции от NaMN до NAD, катализируемые мононуклеотид аденилилтрансферазой никотиновой кислоты и глутамин-зависимой NAD синтетазой соответственно. Как показано в таблице 2, гены этих двух ферментов высоко консервативны у всех семи дрожжей.

Приведенные выше результаты показали, что K. lactis, C. glabrata и Schiz. pombe может не осуществлять de novo биосинтез NAD, в то время как они обладают путем спасения NAD (через Na и NaMN). Если это так, то спасательный путь был бы единственным путем, которым эти дрожжи генерируют НАД. Чтобы проверить эту точку зрения, мы удалили ген KlNPT1 , который, как предполагается, кодирует никотинатфосфорибозилтрансферазу, ключевой фермент, превращающий никотиновую кислоту в NaMN в пути спасения.Делецию KlNPT1 проводили в диплоидном штамме СК11 K. lactis . Полученный гетерозиготный диплоид Δ klnpt1 / KlNPT1 спорулировали, и 20 асков иссекали до полной глюкозной среды. Тетрадная диссекция показала образец сегрегации несущественного гена: 18 аски дали четыре жизнеспособные споры, а два аска дали три жизнеспособные споры [(a) на фиг. 3]. Этот результат был неожиданным. Однако мы заметили, что некоторые колонии были намного меньше, и что сегрегация спор в 18 аски представляла типичную менделевскую генетическую ситуацию: две нормальные колонии vs.две меньшие колонии. Все 40 меньших колоний были устойчивыми к антибиотику G418, в то время как 38 нормальных колоний были чувствительны [(b) на фиг. 3]. Клетки, устойчивые к G418, росли плохо, и рост, казалось, прекращался через 2 дня. Это наблюдение напомнило нам, что мутанты Δ klnpt1 могут выживать за счет некоторых метаболитов, таких как НАД, диффундированный их соседями KlNPT1 , даже если разрушение будет летальным. Известно, что клетки могут жить при очень низкой концентрации НАД. Чтобы проверить эту гипотезу, устойчивые к G418 колонии реплицировали второй раз на планшете, содержащем G418.Никакие клетки больше не могли расти [(c) на рис. 3]. В то же время был проведен эксперимент по кормлению со всеми этими G418-устойчивыми колониями, и результаты показали, что их выживаемость зависела от присутствия клеток KlNPT1 [(d) на фиг. 3]. Следовательно, мы заключаем, что разрушение KlNPT1 является летальным, показывая, что путь спасения является единственным средством биосинтеза NAD у K. lactis .

3

Анализ тетрадной диссекции K.lactis гетерозиготный диплоид Δ klnpt1 / KlNPT1 . Аски препарировали и выращивали на полной среде (а), а затем реплицировали на чашку, содержащую 200 мкг мл ^-1 антибиотика G418 (b). Вторую репликацию проводили с планшетом G418 (c). В то же время клетки каждой устойчивой к G418 колонии суспендировали в физиологическом растворе (0,15 М NaCl) и наносили на полную среду для эксперимента по кормлению, в котором диплоид Δ klnpt1 / KlNPT1 использовался в качестве держателя KlNPT1 . штамм (d).Все планшеты инкубировали при 28 ° C в течение 3-4 дней, а затем сфотографировали.

3

Анализ тетрадной диссекции гетерозиготного диплоида K. lactis Δ klnpt1 / KlNPT1 . Аски препарировали и выращивали на полной среде (а), а затем реплицировали на чашку, содержащую 200 мкг мл ^-1 антибиотика G418 (b). Вторую репликацию проводили с планшетом G418 (c). В то же время клетки из каждой устойчивой к G418 колонии суспендировали в физиологическом растворе (0.15 M NaCl) и наносили на полную среду для эксперимента по кормлению, в котором диплоид Δ klnpt1 / KlNPT1 использовали в качестве удерживающего штамма KlNPT1 (d). Все планшеты инкубировали при 28 ° C в течение 3-4 дней, а затем сфотографировали.

Обсуждение

Путем анализа данных геномной последовательности мы обнаружили, что три вида, нуждающихся в ниацине ( K. lactis, C. glabrata и Schiz. Pombe ), лишены как кинуренинового пути, так и пути аспартата.Присутствуют только гены пути спасения. Фактически, все исследованные виды дрожжей, по-видимому, обладают генами этого пути (никотинамидаза, никотинатфосфорибозилтрансфераза). Таким образом, для ниацин-отрицательных видов этот путь абсолютно необходим для биосинтеза НАД. Это было экспериментально подтверждено тем фактом, что мутант K. lactis , удаленный из NPT1 , был неспособен к росту даже в присутствии никотиновой кислоты. Насколько нам известно, все другие ранее исследованные организмы, от низших прокариот до млекопитающих или зеленых растений, имеют либо кинурениновый путь, либо аспартатный путь, либо оба пути для синтеза НАД de novo .Следовательно, хотя ниацин обычно считается витамином (B ₃ ), он не является витамином в строгом смысле этого слова, потому что никотинатная составляющая НАД также может быть синтезирована из триптофана или аспарагиновой кислоты в этих организмах. Однако наша работа показала, что ниацин действительно является витамином для некоторых дрожжей, таких как K. lactis, C. glabrata и Schiz. Глазурь .

Согласно имеющимся таксономическим данным (Barnett et al. , 1990), существует всего около 35 видов дрожжей, нуждающихся в ниацине.Такие виды чрезмерно представлены в отдельных родах. Например, все виды, близкие к K. lactis , являются ниацин-отрицательными ( K. marxianus, K. aestuarii, K. africanus, K. wickerhamii и т. Д.). Hanseniaspora видов также часто нуждаются в ниацине для роста. Мы можем предположить, что все эти виды утратили пути синтеза НАД, производные от аминокислот, и сделали путь спасения достаточно эффективным, чтобы обеспечить альтернативу. Возможно, что этот способ приобретения NAD мог предшествовать развитию кинуренинового пути у эукариот.

Было показано, что путь спасения НАД с использованием никотиновой кислоты необходим для анаэробного роста дрожжей S. cerevisiae (Panozzo et al. , 2002). Поэтому стоит изучить связь между анаэробиозом и наличием пути спасения. Однако, поскольку путь спасения сохраняется у разных видов дрожжей, независимо от их способности расти в отсутствие кислорода (таблица 2), мы исследовали их способность переносить никотиновую кислоту.Хотя основным путем абсорбции никотиновой кислоты считается процесс пассивной диффузии (Henderson, 1983), TNA1 , был идентифицирован ген высокоаффинного переносчика никотиновой кислоты (Klebl et al. , 2000; Llorente И Dujon, 2000). Поиск ортологов TNA1 показал, что гены для такого предполагаемого переносчика существуют в разных геномах дрожжей и что эта функция часто является совершенно избыточной (Таблица 2). Таким образом, наши данные не предполагают какой-либо прямой связи между различиями в путях биосинтеза НАД и способностью дрожжей к анаэробному росту.

Благодарности

Мы очень благодарны доктору Хироши Фукухара (Институт Кюри), доктору Моник Болотин-Фукухара (IGM, Орсе) и профессору Стивену Оливеру (Манчестер) за критическое прочтение рукописи. Мы благодарим доктора Хироши Фукухару и доктора Синь Цзе Чена (Юго-западный медицинский центр) за любезно предоставленные нам штаммы.

Эта работа была поддержана «Institut Fédératif de Recherche Génomes-IFR115-».

Список литературы

(

1990

Дрожжи: характеристики и идентификация

Издательство Кембриджского университета

(

2001

Биосинтез никотинамидадениндинуклеотидов в бактериях

Vitam Horm

61

103

119

(

2004

Новая жизнь долгожителя: сигнальные функции NAD (P)

Trends Biochem Sci

29

111

118

и другие. (

2004

Эволюция генома дрожжей

Природа

430

35

44

(

1996

Новые векторы для комбинаторных делеций в хромосомах дрожжей и для клонирования с восстановлением разрывов с использованием рекомбинации «маркеров расщепления»

Дрожжи

12

1439

1457

и другие. (

1996

Жизнь с 6000 генами

Наука

274

546

563

(

2004

Регуляция кальциевой передачи сигналов вторым мессенджером циклической аденозиндифосфорибозы (cADPR)

Curr Mol Med

4

239

248

(

2003

Генетика и специфика процесса старения

Наука

299

1351

1354

(

1983

Ниацин

Annu Rev Nutr

3

289

307

и другие. (

2003

Низкомолекулярные активаторы сиртуинов увеличивают продолжительность жизни Saccharomyces cerevisiae

Природа

425

191

196

(

1995

Триптофан-2,3-диоксигеназа в Saccharomyces cerevisiae

Can J Microbiol

41

19

26

и другие. (

2004

Диплоидная последовательность генома Candida albicans

Proc Natl Acad Sci USA

101

7329

7334

(

2004

Молекулярная биология пиридиновых нуклеотидов и биосинтез никотина

Передняя панель Biosci

9

1577

1586

(

2006

Ранние этапы биосинтеза НАД у арабидопсиса начинаются с аспартата и происходят в пластиде

Plant Physiol

141

851

857

(

2000

Транскрипция дрожжевого гена TNA1 регулируется не только никотинатом, но также п-аминобензоатом

FEBS Lett

481

86

87

(

1998

Дрожжевой ген YJR025c кодирует диоксигеназу 3-гидроксиантраниловой кислоты и участвует в биосинтезе никотиновой кислоты

FEBS Lett

424

127

130

(

2003

Биосинтез НАД: идентификация пути от триптофана до хинолината у бактерий

Chem Biol

10

1195

1204

(

2000

Требование NAD и SIR2 для увеличения продолжительности жизни путем ограничения калорийности у Saccharomyces cerevisiae

Наука

289

2126

2128

(

2000

Регуляция транскрипции семейства генов Saccharomyces cerevisiae DAL5 и идентификация высокоаффинной пермеазы никотиновой кислоты TNA1 (YGR260w)

FEBS Lett

475

237

241

(

2002

Аэробный и анаэробный метаболизм НАД + в Saccharomyces cerevisiae

FEBS Lett

517

97

102

(

2002

Фактор увеличения колоний пре-В-клеток, экспрессия которого повышается в активированных лимфоцитах, представляет собой никотинамидфосфорибозилтрансферазу, цитозольный фермент, участвующий в биосинтезе NAD

Eur J Immunol

32

3225

3234

(

2003

Реконструкция метаболизма НАД эукариот

Bioessays

25

683

690

(

2001

Регулирование часов и связывания ДНК NPAS2 окислительно-восстановительным состоянием кофакторов NAD

Наука

293

510

514

(

1971

Регулирующая функция l-кинуренин-3-гидроксилазы (EC 1.14.1.2) для биосинтеза пиридиновых нуклеотидов в анаэробно и аэробно выращенных Saccharomyces cerevisiae

Hoppe Seylers Z Physiol Chem

352

1654

1658

(

1991

Начало работы с дрожжами

Методы Enzymol

194

3

21

и другие. (

2002

Последовательность генома Schizosaccharomyces pombe

Природа

415

871

880

(

2002

Регулирование функции корепрессора ядерным NADH

Наука

295

1895

1897

© 2007 Федерация европейских микробиологических обществ. Издано Blackwell Publishing Ltd.Все права защищены

границ | Экспрессия гена, опосредованная ниацином, и роль NiaR как репрессора транскрипции niaX, nadC и pnuC в Streptococcus pneumoniae

Введение

Бактерии могут запускать транскрипционные и фенотипические программы для синхронизации адаптивного ответа в ответ на колебания окружающей среды или стрессы (Edwards et al., 2013). Это зависит не только от количества факторов вирулентности, которыми он обладает, но и от правильного использования питательных веществ, доступных в нишах человека (Phillips et al., 1990; Титгемейер и Хиллен, 2002). Для выживания и успешного роста бактериям требуется ряд важных витаминов и кофакторов. Streptococcus pneumoniae , главный грамположительный патоген человека и носоглоточный колонизатор, сталкивается с различными факторами окружающей среды и должен соответствующим образом настраивать экспрессию своего гена (Bogaert et al., 2004; Kadioglu et al., 2008).

Ниацин (никотиновая кислота), встречающийся в природе комплекс витаминов B, является предшественником коферментов НАД и НАДФ и играет важную роль в переносе электронов во время метаболических процессов (Wei et al., 2014). Ниацин давно используется для лечения нарушений липидного обмена и сердечно-сосудистых заболеваний (Wei et al., 2014). Он может регулировать активность микробных двухкомпонентных систем и впоследствии модулировать гены и фенотипы, которые контролируются этими регуляторными белками (McPheat et al., 1983). В частности, сообщалось, что ниацин подавляет экспрессию многих генов, включая факторы вирулентности в Bordetella pertussis , такие как токсин коклюша, токсин аденилатциклазы и нитчатый гемагглютинин (Schneider and Parker, 1982; McPheat et al., 1983; Коттер и ДиРита, 2000; Каммингс и др., 2006). Кроме того, двухкомпонентная система BvgA / BvgS, которая, как известно, играет роль в регуляции вирулентности и колонизации, становится неактивной у B. pertussis , когда в среде присутствует ниацин (Miller et al., 1989). Точно так же система Escherichia coli EvgA / EvgS, которая придает множественную лекарственную устойчивость и кислотостойкость, регулируется ниацином (Masuda and Church, 2002, 2003; Eguchi et al., 2003; Nishino et al., 2003).Как система BvgA / BvgS из B. pertussis , так и система EvgA / EvgS из E. coli являются частью семейства белков, которые используют многоступенчатый фосфорный ретранслятор для запуска своих ответных путей.

Было высказано предположение, что в S. pneumoniae ниацин проникает в клетку через NiaX и превращается в никотинат (никотиновая кислота) -мононуклеотид под действием PncB (Johnson et al., 2015). Затем никотинатмононуклеотид превращается в адениндинуклеотид никотиновой кислоты с помощью NadD, после чего NadE превращает адениндинуклеотид никотиновой кислоты в адениндинуклеотид никотиновой кислоты (NAD) (Johnson et al., 2015). Другой важный фермент — глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAP) — это высококонсервативный и многофункциональный белок со значительной активностью в нескольких основных клеточных путях (Sirover, 2011). Обычно дегидрогеназные реакции метаболических путей считаются основными источниками НАДФН. Тем не менее важность трансгидрогеназ, глюкозодегидрогеназ и нефосфорилирующих глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ (GAPN) становится очевидной, что позволяет предположить, что традиционная точка зрения является чрезмерно упрощенной (Sauer U.et al., 2004; Мацубара и др., 2011; Bräsen et al., 2014). Поскольку НАД является жизненно важным кофактором, используемым всеми живыми организмами, все виды бактерий используют пути восстановления НАД ⁺ до НАДН (Jurtshuk, 1996). NAD ⁺ также используется бактериями в качестве субстрата для дегидрогеназ, участвующих в расщеплении альдегидов и спиртов (Nobelmann, Lengeler, 1996; Kotrbova-Kozak et al., 2007; Luong et al., 2015). Кроме того, некоторые клеточные процессы в клетках бактерий и млекопитающих также используют НАД, например лигирование и восстановление ДНК, окислительно-восстановительный цикл в пути пируватдегидрогеназы и синтез ацетил-КоА для цикла трикарбоновых кислот (Ishino et al., 1986; Сато и Линдал, 1992; Wilkinson et al., 2001; Халкиадаки и Гуаренте, 2012 г .; Chiarugi et al., 2012; Patel et al., 2014).

YrxA (NiaR) оказался чувствительным к ниацину репрессором синтеза NAD de novo в Bacillus subtilis и регуляции транскрипции биосинтеза NAD у бактерий, имеющих ортологи B. subtilis yrxA был определен с использованием сравнительного геномного подхода. и исследования экспрессии (Родионов и др., 2008a). Члены семейства NiaR обычно консервативны в группе Bacillus / Clostridium и в неродственных линиях Fusobacteria и Thermotogales (Rodionov et al., 2008а). Реглон NiaR не ограничивается регуляцией транскрипции nadABC , но у некоторых видов он также охватывает спасение ниацина (гены pncAB ) и содержит нехарактеризованные мембранные белки, предположительно участвующие в транспорте ниацина (Родионов и др., 2008a). Более того, члены семейства NiaP (участвующие в поглощении ниацина) консервативны не только у бактерий, но и у многоклеточных эукариот, включая человека, что предполагает предполагаемое участие NiaP в утилизации ниацина этими организмами (Родионов и др., 2008а).

Это исследование объясняет транскриптомный ответ S. pneumoniae D39 на ниацин и регуляцию генов niaX, pnuC и nadC . Мы установили, что регулятор транскрипции NiaR действует как репрессор транскрипции для генов niaX, pnuC и nadC , участвующих в захвате и утилизации ниацина. Предполагаемый сайт оператора (5′-TACWRGTGTMTWKACASYTRWAW-3 ′, где R = A / G, K = G / T, S = G / C, Y = T / C, W = A / T и M = A / C) NiaR в промоторных областях niaX, pnuC и nadC предсказывается и впоследствии подтверждается мутацией сайтов-операторов NiaR в соответствующих промоторах.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы и условия роста

Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице 1. S. pneumonia e D39 выращивали, как описано ранее (Kloosterman et al., 2006; Afzal et al., 2014). Для анализов β-галактозидазы производные S. pneumoniae D39 выращивали в среде определенного химического состава (CDM) (Neves et al., 2002) с 10 мМ ниацином или без него. CDM был приготовлен без ниацина. Для отбора антибиотиков в среду добавляли следующие концентрации антибиотиков: 150 мкг / мл спектиномицина и 2.5 мкг / мл тетрациклина для S. pneumoniae и 100 мкг / мл ампициллина для E. coli . Все бактериальные штаммы, использованные в этом исследовании, хранили в 10% (об. / Об.) Глицерине при -80 ° C. Для ПЦР-амплификации в качестве матрицы использовали хромосомную ДНК S. pneumoniae D39 (Lanie et al., 2007). Праймеры, использованные в этом исследовании, основаны на последовательности генома S. pneumoniae D39 и перечислены в таблице 2.

Таблица 1. Список штаммов и плазмид, использованных в данном исследовании .

Таблица 2. Список праймеров, использованных в этом исследовании .

Строительство

Мутант niaR (MA1300) был сконструирован в S. pneumoniae D39 путем аллельной замены кассетой устойчивости к спектиномицину. Пары праймеров niaR-1 / niaR-2 и niaR-3 / niaR-4 использовали для создания ПЦР-фрагментов левой и правой фланкирующих областей niaR с использованием ДНК-полимеразы Phusion ^® High-Fidelity.Продукты ПЦР левого и правого фланкирующих участков niaR содержат сайтов AscI и NotI соответственно. Маркер устойчивости к спектиномицину, который был амплифицирован праймерами SpecR / SpecF из pORI38, также содержит сайтов AscI и NotI на своих концах. Затем путем рестрикции и лигирования левую и правую фланкирующие области niaR были слиты с геном устойчивости к спектиномицину. Полученные продукты лигирования трансформировали в S.pneumoniae D39 дикого типа, и отбор мутанта проводили по соответствующей концентрации спектиномицина. Делецию niaR дополнительно подтверждали с помощью ПЦР с использованием пары праймеров NiaR-Conf-1 / NiaR-Conf-2 и секвенирования ДНК.

Конструирование промотора

Хромосомные транскрипционные слияния lacZ с промоторами niaX, pnuC и nadC были сконструированы в pPP2 (Halfmann et al., 2007) с парами праймеров, указанными в таблице 2, что дает pMA1301-03 соответственно. Эти конструкции были дополнительно введены в D39 дикого типа и D39 Δ niaR (MA1300), в результате чего были получены штаммы MA1301-03 и MA1304-06, соответственно. Следующие lacZ -слияния P niaX , P pnuC и P nadC с мутациями в сайте NiaR были сделаны в pPP2 (Halfmann et al., 2007) с использованием пар праймеров, указанных в таблице 2: P niaX-M (мутация в сайте niaR ), P pnuC-M (мутация в сайте niaR ), P nadC-R1 (мутация в сайте niaR 1) и P nadC-R2 (мутация в niaR сайте 2), что приводит к плазмидам pMA1304-07 соответственно.Эти конструкции были введены в штамм S. pneumoniae D39 дикого типа, в результате чего были получены штаммы MA1307-1310, соответственно. Аналогичным образом, хромосомные транскрипционные слияния lacZ с промоторами fba, rex, gapN, pncB, gap, adhE и adhB2 были сконструированы в pPP2 (Halfmann et al., 2007) с парами праймеров, указанными в таблице 2, в результате в pMA1308-14 соответственно. Эти конструкции затем вводили в D39 дикого типа, получая штаммы MA1311-17, соответственно.Все плазмидные конструкции дополнительно проверяли на наличие правильной вставки с помощью ПЦР и секвенирования ДНК.

β-галактозидазы выполняли, как описано ранее (Israelsen et al., 1995; Halfmann et al., 2007), с использованием клеток, которые были собраны в фазе среднего экспоненциального роста и выращены в CDM (Neves et al., 2002) с или без ниацина, как указано в разделе результатов.

Анализ микрочипов

Анализ микроматрицы выполняли, как описано ранее (Afzal et al., 2015; Shafeeq et al., 2015). Для анализа ДНК-микрочипов S. pneumoniae в присутствии ниацина транскриптом S. pneumoniae D39 дикого типа, выращенного в повторностях в CDM с 10 мМ ниацина, сравнивали с транскриптомом, выращенным в CDM с 0 мМ ниацина и собирали. на их соответствующих фазах среднего экспоненциального роста.

Для анализа ДНК микрочипов D39 Δ niaR транскриптом S. pneumoniae D39 Δ niaR сравнивали с S.pneumoniae D39 дикого типа выращивали в повторностях в полной CDM и собирали на соответствующих фазах среднего экспоненциального роста. Полный CDM содержит 8 мкМ ниацина. Процедуры анализа ДНК-микрочипов выполнялись, как описано ранее (Afzal et al., 2015; Shafeeq et al., 2015). Для идентификации дифференциально экспрессируемых генов применяли байесовский p <0,001 и пороговое значение кратного изменения> 1,5. Данные микрочипов были представлены в GEO (Gene Expression Omnibus) под номерами доступа GSE

Результаты

Регулирование ниацин-зависимых генов в

Сравнение микрочипов S. pneumoniae D39, выращенных в CDM с 0 мМ, с тем же штаммом, выращенным в CDM с 10 мМ ниацином, было выполнено для изучения влияния ниацина на транскриптом S. pneumoniae D39 дикого типа. CDM был приготовлен без ниацина. Ряд генов / оперонов дифференциально экспрессировался в тестируемых нами условиях (таблица 3). Конкретный кластер генов ( spd-0093-0095 ) был значительно активирован в отсутствие ниацина.Этот кластер генов кодирует три гипотетических белка, которые являются предполагаемыми мембранными белками. Другой кластер генов ( spd-1798-1802 ) был значительно активирован в отсутствие ниацина. Этот кластер генов состоит из регулятора реакции связывания ДНК (кодируется spd-1798 ), сенсорной гистидинкиназы (кодируется spd-1799 ), двух гипотетических белков (кодируется spd-1800 и spd- 1802 ) и транспортер ABC (кодируется spd-1801 ).Некоторые гены, которые, по-видимому, являются частью кластера генов, также были подавлены в наших тестируемых условиях ( spd-0113-15 и spd-0122-24 ). Все эти гены кодируют гипотетические белки, и роль этих генов требует дальнейшего изучения.

Таблица 3. Резюме сравнения транскриптомов S. pneumoniae D39 дикого типа, выращенного в CDM с 0 мМ ниацина, для выращивания в CDM с 10 мМ ниацина .

Предполагаемые гены пути биосинтеза ниацина были значительно активированы в отсутствие ниацина ( fba, rex, gapN, niaX, pncB — nadE, pnuC, gap, spd-1824, nadC, adhE и adhB2 ). fba кодирует фруктозо-бисфосфатальдолазу, тогда как rex кодирует окислительно-восстановительный регулятор транскрипции. Аналогично, gapN кодирует глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, которая участвует в образовании НАДФН из НАДН. pncB кодирует никотинатфосфорибозилтрансферазу, которая превращает никотинат в никотинатный D-рибонуклеотид, и наоборот, , тогда как nadE кодирует синтетазу NAD ⁺ , которая преобразует коды деамино-NAD 9273 + ^{+ NAD 9273 + NAD + для алкогольдегидрогеназы. gap кодирует другую глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, а adhE кодирует железосодержащую алкогольдегидрогеназу, тогда как adhB2 кодирует цинксодержащую алкогольдегидрогеназу. NiaX (кодируемый niaX ) представляет собой субстрат-специфический компонент, предсказанный транспортером ECF ниацина, тогда как PnuC (кодируемый pnuC ) является транспортером рибозилникотинамида. NadC (кодируемый nadC ) представляет собой никотинат-нуклеотидпирофосфорилазу, и было предложено преобразовать хинолинат, образованный из аланина, аспартата и глутамата, а также метаболизм триптофана в никотинат-D-рибонуклеотид (Kanehisa et al., 2014).}

Ниацин-зависимая экспрессия

Наши данные о ниацин-зависимом микрочипе, упомянутые выше, показали роль ниацина в регуляции fba, rex, gapN, niaX, pncB, pnuC, gap, spd-1824, nadC, adhE и adhB2 . Чтобы подтвердить результаты наших микроматриц и продолжить изучение влияния ниацина на экспрессию fba, rex, gapN, niaX, pncB, pnuC, gap, spd-1824, nadC, adhE и adhB2 , мы выполнили β-галактозидазу. тесты с промотором lacZ — слияниями этих генов, сконструированными в S.pneumoniae D39 дикого типа. Наши данные о β-галактозидазе показали, что экспрессия P fba-lacZ , P rex — lacZ , P gapN — lacZ , P niaX — lacZ , P