По каскад: Стропы цепные, текстильные, канатные от компании КАСКАД.

Код заказа и контактную информацию отправлять на адрес электронной почты: [email protected].

* Стоимость указана для единицы продукции, в рублях, без учета стоимости материалов (ключ защиты, диск), доставки и НДС. Данное ценовое предложение не является офертой.

** Одному каналу соответствует один физический аналоговый канал ввода/вывода или 8 дискретных. Стоимость системы на число каналов, большее 8192, определяется индивидуально.

*** Стоимость системы при количестве модулей одного типа, большем 30, определяется индивидуально.

Горизонтальная жесткая анкерная линия КАСКАД

Перемещение по анкерной линии осуществляется с помощью бегунка, который передвигается внутри рельсового сегмента (профиля). В зависимости от вида проведения работ страховочную линию КАСКАД можно дополнительно разделить на 2 или 3 рельсовых сегмента, что позволит беспрепятственно расходится пользователям во время проведения работ на высоте. Стоит отметить, что на жесткой линии можно проводить работы в системе канатного доступа (в положении сидя)

Монтаж горизонтальной анкерной линии производят над местом проведения работ к стационарной конструкции здания или строительного объекта. Одним из самых распространенных объектов установки Каскада являются пункты АСН (автостанции слива налива)

В качестве соединительно-амортизирующей подсистемы мы рекомендуем использовать средства защиты втягивающего типа, например Средство Защиты Втягивающего типа 10м (с нержавеющим тросом). Не забудьте так же подобрать страховочную привязь. В качестве современного решения с возможностью проведения различных типов работ оптимальным выбором станет Синтез-2, а для систем канатного доступа Промальп

Профиттер-Каскад — АО «СФЕРА» Разработка программного обеспечения, системная интеграция

Программный комплекс Профиттер-Каскад предназначен для автоматизации деятельности финансово-хозяйственных служб крупных организаций, представляет собой платформу, на основе которой реализованы различные прикладные модули, как общего, так и специального назначения.

Программный комплекс Профиттер-Каскад позволяет автоматизировать следующие процессы:

• кадровый учет (включая движение по званиям)
• расчет зарплаты
• бухгалтерский учет, в том числе многовалютный и многобюджетный
• бухгалтерский документооборот
• материальный учет
• учет договоров
• управленческий учет
• бюджетное планирование

Профиттер-Каскад был разработан специально для крупных государственных организаций, в первую очередь — силовых ведомств. Однако богатые возможности настройки обеспечивают возможность применения комплекса в любых организациях, включая коммерческие.

На различных этапах существования системы Профиттер-Каскад работал и продолжает рааботать в подразделениях МВД России (включая ГУВД г. Москвы, УВО при ГУВД г. Москвы), ФМС России.

Отличительные особенности реализованного функционала модулей общего назначения.

Кадровый учет

• Движение по званиям
• Контроль проверки кандидатов
• Контроль выполнения регламентов
• Контроль штатного расписания

Расчет зарплаты

• Гибкая система настройки правил расчета
• Перерасчет за прошедший период

Бухгалтерский учет

• Многовалютность
• Одновременное ведение любого числа независимых систем учета (несколько бюджетов, управленческий учет)
• Аналитический учет неограниченной глубины
• Гибкая настройка отображения аналитического учета
• Произвольные отчетные периоды
• Автоматическое проведение первичных документов

Бухгалтерский документооборот

• Автоматическое изготовление документов на основании других
• Сложные связи между документами
• Контроль правильности изготовления документов

Надежность

Помимо функциональных модулей, в программном комплексе Профиттер-Каскад реализованы подсистемы управления справочниками и правами доступа к информации, содержащейся в системе.

Подсистема нормативно-справочной информации

• Версии справочников
• Возможность получения состояния справочников на любую дату

Подсистема информационной безопасности

• Регистрация пользователей
• Система ролей
• Любые схемы разграничения доступа на уровне объектов
• Разграничение доступа на уровне строк
• Защита на уровне СУБД

Структурная основа распознавания ДНК под управлением CRISPR с помощью Cascade

Структурная основа для РНК-управляемой деградации ДНК под действием Cascade и Cas3

Целевая деградация типа I CRISPR

Адаптивные иммунные системы CRISPR защищают бактерии от захватчиков.Системы CRISPR-Cas типа I, наиболее распространенный тип, используют комплекс Cascade для поиска целевой ДНК, которая затем расщепляется белком Cas3. Сяо и др. сообщают о криоэлектронной микроскопии структур комплекса Type I-E Cascade / Cas3 в состояниях до и после ДНК-никения. Эти структуры показывают, как Cas3 захватывает Cascade только в его правильной конформации, чтобы уменьшить отклонение от цели, и как Cas3 переключается с начального режима выделения ДНК на режим процессивной деградации ДНК.

Наука , в этом выпуске стр.eaat0839

Структурированный реферат

ВВЕДЕНИЕ

CRISPR-Cas типа I, наиболее распространенная система CRISPR, включает процесс последовательного поиска и деградации целей. Во-первых, мультисубъединичный комплекс наблюдения Cascade (комплекс, связанный с CRISPR для противовирусной защиты) распознает соответствующую двухцепочечную ДНК-мишень, фланкированную оптимальным мотивом, примыкающим к протоспейсеру (PAM), способствует образованию гетеродуплекса между CRISPR РНК (crRNA) и цепью-мишенью ( TS) ДНК и смещает ДНК, не являющуюся целевой цепью (NTS), что приводит к образованию R-петли в целевом сайте.Фермент слияния геликазы и нуклеазы Cas3 затем специфически рекрутируется в каскад / R-петлю и разрывы и процессивно разрушает ДНК-мишень. Структуры высокого разрешения комплексов каскад / R-петля типа I-E и Cas3 / одноцепочечная ДНК (оцДНК) из Thermobifida fusca объясняют механизм распознавания PAM и образования R-петли. Однако рекрутирование Cas3 и механизмы образования и деградации ДНК остаются неуловимыми.

ОБОСНОВАНИЕ

Мы реконструировали тройной комплекс Tfu Cascade / R-loop / Cas3 и захватили структуры пре- и пост-R-петель-состояний с помощью одночастичной криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ).Вместе эти результаты обеспечивают структурную основу для понимания деградации ДНК под управлением crRNA в системах CRISPR-Cas типа I.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Мы определили крио-ЭМ структуру Tfu Cascade / R-loop / Cas3 в состоянии до NTS-nicking с разрешением 3,7 Å. Связывание Cas3 не вносит дальнейших конформационных изменений в каскад, формирующий R-петлю, это указывает на то, что взаимодействие Cascade-Cas3 по большей части характеризуется захватом конформации, а не механизмом индуцированной подгонки.Взаимодействие Cas3-Cascade опосредуется исключительно субъединицей Cse1 в Cascade. Распознавания являются комплементарными по заряду и контуру поверхности для Cascade / R-loop, но не для состояний аполипопротеина и семенного пузыря Cascade. Это потому, что до образования полной R-петли C-концевой домен Cse1 находится в альтернативной ориентации. Установив обширные контакты с обоими доменами Cse1, Cas3 способен ощущать измененный поверхностный ландшафт Cse1 и отклонять Каскад в таких функциональных состояниях.Условное рекрутирование Cas3 в Cascade служит механизмом, позволяющим избежать неправильного нацеливания ДНК только с частичной комплементарностью [см. Рисунок, (A)].

Кроме того, мы предоставили прямые доказательства того, что механизм передачи подложки необходим для вмешательства CRISPR типа I-E. Нуклеаза HD Cas3 непосредственно захватывает NTS для обрыва цепи, и это действие полностью обходит часть геликазы. Захват субстрата зависит от наличия гибкой выпуклости в NTS, а предпочтение места надреза предопределяется путем пути рекрутирования.

Далее мы определили структуру post-NTS-nicking с разрешением 4,7 Å, что позволило нам идентифицировать структурные изменения, сопровождающие реакцию образования цепей. Структура показывает, что вся цепь NTS в области R-петли исчезает с ее первоначального пути из-за повышенной гибкости. При гидролизе аденозин-5′-трифосфата (АТФ) PAM-проксимальная половина NTS спонтанно перемещается к открытию геликазы Cas3. Отсюда следует, что после гидролиза АТФ геликаза Cas3 будет питать оцДНК через себя и далее в свою нуклеазу HD, переходя в режим процессивной деградации ДНК [см. Рисунок, (B)].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы завершили структурно-функциональную характеристику молекулярных событий, которые приводят к интерференции CRISPR типа I-E. Начало интерференции CRISPR жестко контролируется на этапе рекрутирования Cas3 в качестве механизма уменьшения отклонения от цели. Однако при NTS-nicking системы типа I преуспевают в разрушении мишени, потому что Cas3 деградирует ДНК процессивно, а не останавливается на генерации двухцепочечного разрыва. Такие характеристики могут объяснить, почему тип I стал наиболее распространенной системой CRISPR-Cas, встречающейся в природе.Было бы интересно посмотреть, можно ли будет преобразовать систему Типа I в инструмент редактирования генома с другими утилитами, чем у Cas9.

( A ) Объяснение механизма зависимого от R-петли рекрутирования Cas3. Это предотвращает неправильную ориентацию частично совпадающих последовательностей ДНК. ( B ) Структурные перестройки после разрывания R-петли с помощью Cas3. ДНК NTS самопроизвольно перемещается к открытию геликазы Cas3, готовой к процессуальной деградации.

Abstract

Система CRISPR-Cas типа I обеспечивает последовательный процесс поиска мишеней и деградации двухцепочечной ДНК с помощью комплекса Cascade (связанный с CRISPR для противовирусной защиты) комплекса Cascade (связанный с CRISPR комплекс для противовирусной защиты) и фермента слияния нуклеазы и геликазы Cas3 соответственно . Здесь мы представляем криоэлектронную микроскопию (крио-ЭМ) с разрешением 3,7 ангстрем для комплекса Type I-E Cascade / R-loop / Cas3, способного инициировать деградацию ДНК. Cas3 различает конформации Cascade и захватывает только каскад, формирующий R-петлю, чтобы избежать расщепления частично комплементарных мишеней.Его нуклеазный домен рекрутирует ДНК, не являющуюся мишенью (NTS), в выпуклой области для разделения одноцепочечной ДНК. Дополнительная крио-ЭМ структура с разрешением 4,7 ангстрем фиксирует состояние постникинга, в котором оторванные NTS втягиваются ко входу геликазы, чтобы быть направленным для зависимой от аденозин-5′-трифосфата процессивной деградации. Эти снимки формируют основу для понимания РНК-управляемой деградации ДНК в системах CRISPR-Cas типа I-E.

CRISPR (кластеры с регулярным расположением коротких палиндромных повторов) и ближайший оперон cas (связанный с CRISPR) устанавливают основанную на РНК систему адаптивного иммунитета у прокариот ( 1 — 6 ).Они подразделяются на два основных класса: системы класса 1 используют мультисубъединичный эффекторный комплекс для поиска и уничтожения нуклеиновых кислот-мишеней, тогда как системы класса 2 используют единственный эффекторный комплекс ( 7 , 8 ). CRISPR-Cas типа I, наиболее распространенная система CRISPR, относится к классу 1 и может быть разделена на шесть подтипов ( 7 ). Он имеет последовательный процесс поиска и деградации цели. Во-первых, мультисубъединичный комплекс наблюдения, называемый Cascade (комплекс, связанный с CRISPR для противовирусной защиты), распознает соответствующую мишень двухцепочечной ДНК (дцДНК), фланкированную оптимальным мотивом, примыкающим к протоспейсеру (PAM), способствует образованию гетеродуплекса между CRISPR РНК (crRNA) и ДНК-мишени (TS), и смещает ДНК, не являющуюся целевой цепью (NTS), что приводит к образованию R-петли в целевом сайте (рис.1А) ( 9 — 14 ). Фермент слияния геликазы и нуклеазы Cas3 специфически рекрутируется в комплекс Cascade / R-loop, разрывает NTS (рис. 1A) и переключается в режим процессной деградации ДНК ( 11 , 15 — 17 ). Системы CRISPR-Cas типа I-E из Escherchia coli и Thermobifida fusca были тщательно изучены ( 9 — 25 ). В системе T. fusca (рис. 1A) снимки структуры с высоким разрешением прояснили механизм распознавания PAM и выявили согласованный набор конформационных изменений, поскольку Tfu Cascade проходит от промежуточного звена (пузыря исходной последовательности) к промежуточному звену. полное состояние R-петли; Tfu Cas3 избирательно связывается с последним состоянием ( 25 ).Предыдущие попытки определить взаимодействие Cascade-Cas3 были недостаточными для разрешения молекулярных механизмов, касающихся рекрутирования Cas3 и деградации ДНК ( 17 ). Одноцепочечная ДНК (ssDNA) -связанная кристаллическая структура Tfu Cas3 привела к предположению, что начальный механизм защелкивания R-петли с помощью Cas3, вероятно, отличается от последующего механизма деградации ДНК ( 24 ). Чтобы разрешить эти механистические неоднозначности, мы воссоздали Tfu Cascade / R-loop / Cas3 комплекс и получили две криоэлектронные микроскопические (крио-ЭМ) структуры, представляющие состояния до и после R-петли-перерыва, в 3.Разрешение 7 и 4,7 Å соответственно. Предыдущий снимок объясняет, как Cas3 конкретно захватывает полный каскад, формирующий R-петлю, как механизм, позволяющий избежать неправильного нацеливания. Последний снимок особенно информативен, показывая, как Cas3 переключается с начального режима выделения ssDNA на более поздний режим процессивной деградации ДНК. Вместе эти результаты обеспечивают структурную основу для понимания деградации ДНК под управлением crRNA в системах CRISPR-Cas типа I.

( A ) Схематическая диаграмма оперона T. fusca Type I-E CRISPR- cas , каскадная организация Tfu , образование R-петли, сайт связывания Tfu Cas3 и сайт связывания NTS. Неупорядоченные нуклеотиды NTS являются полупрозрачными, и красными стрелками отмечены Tfu, Cas3-никелированные сайты. Эта раскраска сохраняется и на других рисунках. ( B ) Схема восстановления и очистки тройного комплекса Tfu Cascade / R-loop / Cas3.( C и D ) Эксклюзионная хроматография, электрофорез в нативном полиакриламидном геле (PAGE), SDS-PAGE и мочевина-PAGE анализы тройного комплекса.

Результаты

Восстановление тройного комплекса Cascade / R-loop / Cas3 из

Как показано ранее ( 25 ), система IE типа T. fusca демонстрирует крутой температурно-зависимый R- поведение петли, позволяющее запрограммировать Tfu Cascade на связывание дцДНК, формирование семенного пузыря или полное состояние R-петли путем изменения температуры инкубации. Tfu Cas3 взаимодействует только с Tfu Cascade в состоянии полной R-петли, но не в состоянии затравочного пузыря, по-видимому, путем исследования конформационных различий между ними. В этом исследовании мы увеличили масштаб реконструкции тройного комплекса Tfu Cascade / R-loop / Cas3 и очистили его от отдельных компонентов, используя комбинацию методов аффинной и эксклюзионной хроматографии (рис. 1, B и C). В тройном комплексе Tfu, Cas3 предпочтительно разрывается после 7-го, 9-го (очень предпочтительно) и 11-го нуклеотида (нуклеотида (нуклеотида) NTS ДНК в R-петле, считая от PAM-проксимальной стороны.Когда был введен аденозин-5′-трифосфат (АТФ), Tfu Cas3 переключился в режим процессной деградации, расщепляя обе цепи ДНК на части ( 25 ). Это поведение аналогично описанному поведению Cas3 в системах E. coli и Streptococcus thermophilus типа I-E ( 15 — 17 ). Ранее структура Tfu Cas3 / ssDNA выявила присутствие двух ионов трехвалентного железа в центре нуклеазы HD ( 24 ).Позже мы обнаружили, что их присутствие сильно подавляет нуклеазную активность, тогда как Co ²⁺ поддерживает расщепление оцДНК ( 25 ). Тем не менее, комбинация использования включенного в железо Tfu Cas3 и исключения АТФ (или введения негидролизуемого аналога АТФ аденилимидодифосфата) позволила нам запрограммировать комплекс Tfu Cascade / R-loop / Cas3 в преимущественно предварительное состояние; по крайней мере 74% NTS были неповрежденными согласно количественной оценке ImageJ, и процессивной деградации не наблюдалось (рис.1D).

Общая архитектура комплекса Cascade / R-loop / Cas3 в предварительном состоянии

Крио-ЭМ анализ одиночных частиц показал, что тройной комплекс, заключенный во льду, был монодисперсным и однородным, с отчетливыми структурными особенностями, четко видимыми в двухмерном ( 2D) средние значения (рис. S1, A и B). Мы определили крио-ЭМ структуру интерференционного комплекса Tfu Cascade / R-loop / Cas3 с общим разрешением 3,7 Å (рис. S1, C и D). Тело Tfu Cascade / R-loop разрешено в 3.5 Å или лучше. Напротив, пальцевые домены Cas7, Cas6e / crRNA и внешняя оболочка дцДНК разрешаются при 4,7 Å или хуже из-за их конформационной гибкости (фиг. S1D и S2). Внутренняя оболочка Cas3 имеет разрешение лучше, чем 4,1 Å, разрешая большую часть боковых цепей интерфейса, контактирующих с Cascade; некоторые области внешней оболочки имеют значение хуже 4,7 Å. Из четырех доменов, нуклеаза HD и домены RecA1 Cas3 разрешены лучше, а RecA2 имеет меньшую плотность из-за шарнирного движения; С-концевой повторяющийся домен (CTD) плохо разрешается из-за повышенного термодвижения и моделируется твердотельной стыкованной кристаллической структурой (рис.S1D и S2).

Связывание Cas3 не вносит дальнейших конформационных изменений в каскад, образующий R-петлю; общая конформация Tfu Cascade в тройном комплексе хорошо согласуется с конформацией в бинарном комплексе [Protein Data Bank (PDB): 5U0A] (Рис. 2 и Рис. S3) ( 25 ). Эти наблюдения указывают на возможность, что взаимодействие Cas3-Cascade может использовать механизм связывания с захватом конформации, а не с индуцированным соответствием, хотя это требует анализа конформационной динамики для подтверждения.Конформация Cas3 внутри тройного комплекса находится в архитектурном согласии с таковой в кристаллическом состоянии (PDB: 4QQW) ( 24 ), за исключением того, что домены RecA2 и CTD претерпевают движения твердого тела в диапазоне от 2 до 10 Å, соответственно (рис. S3). Связывание Cas3 опосредуется исключительно субъединицей Cse1 Cascade. Расположение и ориентация домена Cas3 согласуются с данными биохимии ( 15 — 17 , 25 , 26 ).Однако нуклеазный центр Cas3 находится на расстоянии ~ 20 Å от пути NTS. Следовательно, должен существовать специальный механизм для передачи субстрата ДНК от Cascade к Cas3.

( A ) Cryo-EM map и ( B ) проиллюстрированная модель тройного комплекса преникинга в трех различных ориентациях, демонстрирующая связывание белка Cas3 с субъединицей Cse1 Cascade.Крио-ЭМ карты отображаются без повышения резкости B-фактора.

Интерфейс Cas3-Cascade: Как Cas3 захватывает каскад, формирующий R-петлю?

Взаимодействие Cas3-Cascade опосредуется исключительно субъединицей Cse1 в Cascade. Ранее мы показали, что Cse1_CTD поворачивается на 15 °, когда Cascade переходит от затравочного пузыря к состоянию полной R-петли (рис. 3A) ( 25 ). Это движение шарнира изменяет ориентацию и расстояния между Cse1_NTD (N-концевой домен) и CTD.Следовательно, любой дальний контакт с Cas3, который охватывает два домена Cse1, будет чувствителен к конформации Cse1. Конформационные изменения также изменили особенности поверхности в интерфейсе Cse1_NTD-CTD. Любые контакты Cas3, распознающие недавно открытый интерфейс Cse1_NTD-CTD, также помогут отличить конформацию Cascade.

( A ) Конформационные различия между семенным пузырем и полным каскадом R-петли.Cas3 связывается исключительно с субъединицей Cse1 Cascade. ( B ) Контакт Cas3-Cse1 сзади. Cas3 вставляет клин в паз между Cse1_NTD и CTD. ( C ) Эта бороздка отсутствует в состоянии зародышевого пузыря, и связывание Cas3 привело бы к стерическому конфликту. ( D ) Четыре интерфейса на Cas3 и Cse1, окрашенные в розовый, синий, белый и бежевый цвета соответственно. (От E до H ) Подробные контакты на интерфейсах с I по IV, соответственно. Однобуквенные сокращения аминокислотных остатков следующие: A, Ala; C, Cys; D, Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; H, Его; Я, Иль; К, лиз; L, лей; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gln; R, Арг; S, Ser; Т, Тр; V, Val; W, Trp; и Y, Tyr.У мутантов в определенных местах были заменены другие аминокислоты; например, R162E указывает, что аргинин в положении 162 был заменен глутаминовой кислотой. ( I ) Анализ сдвига собственной электрофоретической подвижности для оценки интерфейсных остатков. Нижняя и верхняя полосы представляют комплексы Cascade / R-loop и Cascade / R-loop / Cas3 соответственно.

Оба принципа исследуются Cas3 для определения конформации Cascade (Рис. 3, B и C). Интерфейс Cascade-Cas3 скрывает большую площадь поверхности 2520 Å ² и охватывает всю сторону Cas3.Его можно условно разделить на четыре сектора (интерфейсы с I по IV) (рис. 3D). На интерфейсе I Cas3 вставляет выступающую петлю из своего домена нуклеазы HD (аминокислоты с 157 по 171) в бороздку между Cse1_NTD и CTD (рис. 3E), которая открывается только тогда, когда Cascade находится в полной конформации R-петли. (Рис. 3, Б и В). Тяжелые конфликты могли бы возникнуть, если бы Cas3 связывался с Cascade в конформации семенного пузыря (Fig. 3C). Контакты на интерфейсе I отличаются комплементарностью формы; благоприятные водородные связи, опосредованные Q160, R161 и N163 из Cas3, дополнительно усиливают взаимодействие.Мутагенез с заменой заряда, R162E, полностью нарушает контакт Cascade-Cas3 (Fig. 3I), подчеркивая функциональную важность этих полярных контактов.

Интерфейсы II и III фланкируют интерфейс I и служат молекулярной линейкой для определения угловых изменений и изменений расстояния между двумя доменами Cse1. Это служит прокси для считывания, открыл ли Cascade R-loop на целевом сайте. На стороне Cse1_CTD поверхностная петля из домена Cas3 HD (аминокислоты со 105 по 114) вставляется в бороздку, перпендикулярную четырехспиральному пучку в Cse1_CTD (интерфейс II) (рис.3F). Хотя конкретные контакты являются слабыми, две поверхности будут смещаться и конфликтовать, если Cascade не находится в состоянии полного R-контура. На стороне Cse1_NTD вся линкерная область Cas3, состоящая из α-спирали (аминокислоты с 779 по 798) и гибкой петли (аминокислоты с 799 по 817), скрыта на границе раздела (рис. 3G). Длинная линкерная область специфична для ветви Cas3 геликаз Super Family II и была задействована в нашем предыдущем исследовании для обеспечения взаимодействий с Cascade; замена этой области линкером Gly / Ser полностью устраняет связывание Cas3 ( 24 ).Здесь мы определяем область, с которой контактирует гибкая линкерная петля и близлежащие поверхностные петли Cas3 (аминокислоты 151–156, 503–508 и 826–828) как интерфейс III (рис. 3, D и G). В дополнение к опосредованию комплементарности формы, контакты на этом интерфейсе подчеркивают дополнительность заряда. В частности, кислотный патч в линкерной петле (D802, D804, D805, E807, D808, N809 и N811) дополняет базовый патч в Cse1_NTD (N87 N89, K91, R92 и K93; интерфейс III). Мутагенез с заменой заряда либо со стороны Cas3 (E807K / D808K), либо со стороны Cse1 (KRK91–93 / DDD) интерфейса приводит к полному фенотипу потери связывания.Комбинирование этих двух мутаций с заменой заряда устраняет дефект связывания (Fig. 3I), подчеркивая важность комплементарности зарядов на интерфейсе III.

Вся линкерная спираль (аминокислоты с 779 по 798) расположена на границе раздела Cas3-Cascade (интерфейс IV), укладываясь под наклоном против двух параллельных петель в Cse1_NTD (аминокислоты с 258 по 269 и аминокислоты с 301 по 309) (Рис. 3H). Набор гидрофобных остатков в N-концевой половине линкерной спирали пересекается с гидрофобными остатками на поверхности Cse1.Однако мутагенез со сканированием аланином, направленный на гидрофобные остатки вдоль спирали, мало влияет на взаимодействие Cascade-Cas3. С-концевая половина линкерной спирали в Cas3 обеспечивает несколько взаимодействий солевых мостиков с Cse1. Мутация R796E с заменой заряда в Cas3 значительно ослабляет его сродство к Cascade / R-loop (рис. 3I). Мутация G793F в Cas3 имела мягкий эффект, предположительно за счет нарушения комплементарности формы на границе раздела (Fig. 3I).

Взятые вместе, наши структурные наблюдения объясняют, почему Cas3 способен связываться только с каскадами, которые завершили процесс проверки цели.Это служит механизмом, позволяющим избежать деградации целевой ДНК с частичной комплементарностью. Несмотря на сильную последовательность и структурную гомологию, нам не удалось собрать гетерокомплекс из T. fusca Cas3 и E. coli Cascade / R-loop (рис. S4A). Стыковка этих двух структур привела к разумной комплементарности поверхностей на предполагаемом интерфейсе (рис. S4, B и C). Однако неидеальная зарядовая комплементарность может быть обнаружена в нескольких основных границах раздела, а стерические конфликты присутствуют на границе раздела III (рис.S4D). Выравнивание последовательностей также показало, что интерфейсные остатки в Cas3 не консервативны (фиг. S5). Эти наблюдения объяснили, почему T. fusca Cas3 и E. coli Cascade / R-loop не смогли гетероорганизоваться. Учитывая, что несколько систем типа I часто сосуществуют в одной бактерии — T. fusca сама поддерживает две системы IE типа — это может быть механизмом предотвращения взаимодействия каскадных оперонов с Cas3, что может привести к неправильному нацеливанию или неправильному включению новых спейсеров во время грунтованная адаптация.

Механизм передачи и захвата NTS

Доступные биохимические данные предполагают, что Cas3 расщепляет NTS после связывания с Cascade, а затем гидролиз АТФ мобилизует геликазу. Эти согласованные действия приводят к процессной деградации ДНК. В структуре комплекса Tfu Cascade / R-loop / Cas3 близость Cas3 к NTS на стороне PAM находится в архитектурном согласии с наблюдаемым паттерном прикрепления ДНК. Ориентация Cas3 относительно NTS согласуется с направленностью 3′-к-5 ‘его геликазы (рис.4А). Тем не менее, тройная структура ясно показывает, что начальный механизм выделения ДНК отличается от механизма процессной деградации, который изображен в структуре Tfu Cas3 / оцДНК ( 24 ). NTS в тройном комплексе полностью обходит геликазу до NTS-захвата; плотности нуклеиновых кислот отсутствуют в ядре геликазы, как видно из структуры Tfu Cas3 / оцДНК (фиг. 4B). Скорее, первые четыре нуклеотида 3′-к-PAM перемещаются под петлей L3 каскада.Базы не разрешены на карте EM из-за отсутствия конкретных контактов, но основу можно проследить с хорошей уверенностью (рис. 4C). Затем плотность NTS исчезает с карты EM в областях между петлей L3 и Cse1_CTD, а затем снова появляется на краю Cse1_CTD и направляется к задней стороне Cse2.1. Похожий сценарий наблюдался в бинарной структуре Каскад / R-петля, и мы продемонстрировали, что это произошло потому, что NTS предполагал наличие гибкой выпуклости от 8 до 10 нт в этой области ( 25 ).Это было интерпретировано как механизм передачи субстрата NTS в Cas3 для разрывания цепи ( 25 ). Здесь тройная структура обеспечивает прямое доказательство того, что механизм передачи действительно важен для вмешательства CRISPR типа I-E. В крио-ЭМ структуре центр нуклеазы HD в Cas3 находится на расстоянии ~ 20 Å от NTS на поверхности Cascade (рис. 4A). Без выступающей выпуклости оцДНК было бы невозможно для Cas3 расщеплять NTS. В нуклеазном центре HD обнаруживаются дополнительные плотности, соответствующие ножницеобразному фосфату и остову двух предшествующих нуклеотидов (рис.4С). Эти нуклеотиды размещаются в активном сайте диметалла HD аналогичным образом, как это наблюдается в структуре Tfu Cas3 / оцДНК ( 24 ). Требуется максимум три дополнительных нуклеотида, чтобы смоделировать целые 9-нуклеотидные NTS на стороне PAM в нуклеазный центр Cas3 (рис. 4C), что объясняет сильное предпочтение Tfu- и Eco Cas3 для никеля после PAM. +9 ( 25 ). Взятые вместе, структурные наблюдения сходятся с предыдущими биохимическими исследованиями, чтобы предположить, что нуклеаза Cas3 рекрутирует оцДНК NTS непосредственно для образования цепей.Захват субстрата зависит от наличия гибкой выпуклости в NTS, а место реакции надреза предопределяется длиной пути рекрутирования.

( A ) Нуклеазный центр Cas3 находится на расстоянии ~ 20 Å от NTS, движущегося по поверхности Каскада. ( B ) Плотность крио-ЭМ предполагает, что NTS (красный) обходит геликазу Cas3 и напрямую обращается к ее нуклеазному центру HD.Этот путь отличается от пути через геликазу (зеленый), наблюдаемого в структуре Tfu Cas3 / оцДНК. (Вставка) Крио-ЭМ плотность, показывающая, что внутри геликазы Cas3 не обнаружены плотности нуклеиновых кислот. ( C ) Путь NTS внутри комплекса Tfu Cascade / R-loop / Cas3. Гибкая выпуклость присутствует в NTS между петлей L3 и CTD Cse1, где ЭМ плотность отсутствует. Выпуклость позволяет нуклеазе Cas3 захватить и порезать NTS. Построение структуры и моделирование объясняют, почему Cas3 предпочитает «ники» после PAM + 9 в NTS.Основу нуклеотидов PAM + 1–4 и PAM + 8–9 можно проследить по крио-ЭМ карте; PAM + 5–7 моделируются. Второстепенные сайты nicking (PAM + 7 и +11) могут быть рационализированы на основе наблюдаемой гибкости NTS.

Моментальный снимок постникинга: никелированные NTS оттягиваются к геликазе Cas3, ожидая повторной нити

В то время как большинство тройных комплексов были захвачены на стадии преникинга, часть комплексов действительно претерпевала NTS-защемление (Fig. 1D). Эти частицы были разделены расчетным путем во время трехмерной классификации.Они сходятся, чтобы дать крио-ЭМ структуру с разрешением 4,7 Å; Изменения в локальном разрешении следует той же тенденции, что и в структуре предварительной прокалывания (рис. S2). Следующие структурные различия привели нас к выводу, что этот снимок представляет собой постник трехкомпонентный комплекс (Fig. 5A). Во-первых, вся ДНК NTS исчезает с ее первоначального пути в области R-петли (рис. 5B). Сценарий кажется аналогичным тому, когда разрывается резинка; две половинки откидываются назад и становятся гибкими. PAM-дистальная дцДНК также исчезает из плотности, предположительно из-за повышенной гибкости, тогда как PAM-проксимальная дцДНК удерживается в своем исходном положении (рис.5Б). По мере того как NTS на стороне PAM исчезает со своего первоначального пути, новый плотный сгусток появляется сбоку от PAM-проксимальной dsDNA, указывая на открытие части геликазы Cas3 (Fig. 5, B и C). Плотность лишена узнаваемой структурной особенности, но ее объем может вместить от 6 до 7 нуклеотидов оцДНК. Наиболее логичным объяснением является то, что плотность соответствует перемещенному NTS после обрезки нити. Отсюда следует, что после гидролиза АТФ геликаза Cas3 будет пронизывать оцДНК через себя и далее в нуклеазу HD, как показано в нашей ранее опубликованной структуре Tfu Cas3 / ssDNA ( 24 ).Это переключает Cas3 в режим процессной деградации ДНК. Контакт Cascade-Cas3 в области геликазы изолирован линкерной областью Cas3. Следовательно, ожидаемые конформационные изменения в геликазе Cas3 в каждом цикле гидролиза АТФ не будут разрушать комплекс Cas3-Cascade. Это дополнительно рационализирует наблюдение, что Cas3 способен разрушать дцДНК, находясь на вершине Cascade, прежде чем в конечном итоге освободиться ( 26 , 27 ).

( A и B ) Различия в плотности между состояниями до и после NTS-nicking. Обе карты фильтруются до 6 Å без применения B-фактора. Лишние плотности в трехмерной реконструкции postnicking отмечены зеленым цветом в красном пунктирном круге. Исчезнувшие плотности выделены серыми пунктирными линиями и черным пунктирным кружком. ( C ) Увеличенное изображение состояния постникания, подчеркивающее судьбу NTS после разрыва нити.Плотности, которые раньше приводили к центру нуклеазы HD, теперь отсутствуют, тогда как дополнительные плотности накапливаются при открытии геликазы Cas3.

Обсуждение

Этим исследованием мы завершаем определение структурно-функциональных характеристик ключевых молекулярных событий, ведущих к началу интерференции CRISPR в системе типа I-E. Тема перед деградацией ДНК-мишени, по-видимому, подчеркивает строгость, устанавливая последовательность причинных событий. Чтобы уменьшить отклонение от цели, необходимы две отдельные эффекторные макромолекулы, и их взаимодействие контролируется с помощью механизма захвата конформации, зависящего от R-петли.Это гарантирует, что субстрат ДНК не будет преждевременно расщеплен до того, как будет подтверждена вся целевая последовательность. В начале вмешательства CRISPR, при срабатывании NTS, механизм затем переключается на повышение эффективности. Вместо того, чтобы останавливаться на генерации двухцепочечного разрыва, как это делают Cas9, Cas12a и другие одноэффекторные системы CRISPR, геликаза-нуклеаза Cas3 вызывает более серьезные повреждения за счет процессивной деградации ДНК. Эти характеристики могут объяснить, почему тип I превратился в наиболее распространенную систему CRISPR-Cas в природе.Было бы интересно посмотреть, можно ли перепрограммировать систему типа I для работы в качестве инструмента редактирования генома.

После рекрутирования Cas3 и образования NTS, Cas3 входит в режим процессивной деградации ДНК. Исследования одиночных молекул показали, что первоначально Cas3 остается связанным с Cascade и наматывает дцДНК на себя, захватывая петлю ДНК и создавая область оцДНК внутри ( 26 , 27 ). По мере накопления напряжения Cas3 диссоциирует от Cascade стохастическим образом и путешествует в одиночку на расстояния в килобаз ( 26 , 27 ).Удивительно, но в этих исследованиях не наблюдалось явного разрыва дцДНК. Это не согласуется с эффективностью интерференции, наблюдаемой in vivo. Несоответствие между объемной биохимией и биохимией одиночных молекул оставляет пустое место в нашем молекулярном понимании системы CRISPR типа I.

Фаги могут избежать наблюдения CRISPR, приобретая мутации в PAM или в области протоспейсера. Механизм, называемый примированной адаптацией, присутствует в системе CRISPR-Cas типа I, где Cascade и Cas3 управляют преимущественным приобретением новых спейсеров с помощью Cas1-Cas2 от фагов-убегающих, которые приобрели мутации в области протоспейсера.Молекулярные детали остаются неясными; однако недавняя визуализация одиночных молекул непосредственно визуализировала Cas1-Cas2, позволяя Cascade специфически рекрутировать Cas3 в протоспейсеры, соседние с мутантным PAM ( 26 , 27 ). Интересно предположить, что примированные последовательности PAM могут запускать Cascade для принятия в настоящее время неопределенной конформации для рекрутирования Cas3 и Cas1-Cas2, инициируя процесс приобретения примированного спейсера. Необходимы дополнительные исследования, чтобы выяснить, как именно Cascade / Cas3 / Cas1-Cas2 выбирает протоспейсеры во время праймированной адаптации.

Материалы и методы

Подробное описание материалов и методов содержится в дополнительных материалах. Вкратце, Tfu Cascade / R-loop и Tfu Cas3 получали, как описано ( 24 , 25 ). Тройной комплекс собирали путем инкубации Tfu Cascade / R-loop и Twin-Strep-HRV- Tfu Cas3 в молярном соотношении 1: 2 при 4 ° C в течение 60 мин с последующим опусканием Strep-tag до удаление несвязанной Tfu Cascade / R-loop, расщепление PreScission Protease для удаления метки Twin-Strep и эксклюзионная хроматография для удаления избытка Cas3.Сбор крио-ЭМ данных, получение изображений и реконструкция структуры выполнялись аналогично описанной процедуре ( 25 ). Статистика обработки и уточнения данных для двух крио-ЭМ структур сведена в таблице S1.

Благодарности: Мы благодарим Р. Батталья, А. Долана и С. Нг за критическое прочтение рукописи и И. Финкельштейна за обсуждения. Финансирование: Исследования в лаборатории Ке поддерживаются Национальными институтами здравоохранения (GM118174 и GM102543). Вклад авторов: Y.X., M.Lu., M.Li., and A.K. разработал исследование. Y.X. и М.Л. вносят основной вклад в биохимические воссоздания, определение структуры и структурно-функциональный анализ. A.E.D. внес вклад в исследования мутагенеза. M.Li. и А.К. привели к структурному и биохимическому анализу. А.К. а остальные авторы написали рукопись. Конкурирующие интересы: У авторов нет конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Трехмерные крио-ЭМ карты плотности комплекса Tfu Cascade / R-loop / Cas3 депонированы в банке данных электронной микроскопии под номерами доступа.EMD-7347 (состояние перед установкой) и EMD-7346 (состояние после установки отметки). Атомная координата для состояния предварительной фиксации депонирована в PDB под номером доступа. 6C66.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или уточнить у системного администратора.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Высокоинтенсивная флуоресценция в ближнем ИК-диапазоне в точках полупроводникового полимера, достигнутая с помощью каскадной стратегии FRET

Полупроводниковые полимерные точки (Pdots), излучающие в ближнем ИК-диапазоне (NIR) со сверхъяркой флуоресценцией, были приготовлены для специфического клеточного нацеливания.Был синтезирован ряд π-сопряженных полимеров с образованием вододиспергируемых многокомпонентных точек Pdot методом соосаждения с помощью ультразвуковой обработки. За счет оптимизации каскадной передачи энергии в Pdots была достигнута высокая интенсивность NIR-флуоресценции ( Φ = 0,32) с настраиваемыми возбуждениями, большим разделением поглощения и испускания (до 330 нм) и узкими полосами излучения (FWHM = 44 нм). Флуоресцентная визуализация отдельных частиц показывает, что готовые NIR Pdots были более чем в три раза ярче, чем коммерчески доступный Qdot705 с сопоставимыми размерами при идентичных условиях возбуждения и детектирования.Благодаря ковалентному введению групп карбоновой кислоты в боковые цепи полимера, биоконъюгирование между Pdots, излучающими БИК, и стрептавидинами может быть легко завершено через этих функциональных групп на поверхности Pdots. Более того, с помощью проточной цитометрии и конфокальной флуоресцентной микроскопии конъюгаты Pdot-стрептавидин, излучающие БИК, доказали, что они могут эффективно маркировать рецепторы EpCAM на поверхности клеток MCF-7, посредством специфического связывания между стрептавидином и биотином.

У вас есть доступ к этой статье

Сверхлегкий складной стол от Cascade Wild — Garage Grown Gear

отправка в течение 1-2 рабочих дней | Базируется в Корнелиус, Орегон | Стандартное восточное время.2016

Вытащите свое снаряжение из грязи и грязи с складным столом Cascade Wild! Цельная конструкция, поэтому нет необходимости в незакрепленных деталях и мешках для вещей. На каждом конце стола есть 5-дюймовая полоса высокоинтенсивной микропризматической световозвращающей ленты, которая будет служить отражающим маяком, когда вы вернетесь в лагерь после наступления темноты.

Эти столы UL с рекомендуемым пределом веса в 10 фунтов легко помещаются в боковой карман для бутылки с водой без необходимости использования мешка для вещей. Эргономичный дизайн позволяет столу ставить бревна поперек или продольно.Для приготовления изысканных блюд добавьте дополнительную разделочную доску. Нужна большая поверхность? Две или более таблицы могут соединяться вместе!

Характеристики:

• Водонепроницаемый и грязеотталкивающий гофрированный пластик с воздушными канавками, аналогичный картону
• Очень высокое отношение прочности к массе
• Подходит для канистры, миски, кофейной кружки и посуды
• Два или более стола соединяются вместе для увеличения поверхности для приготовления еды
• Легко чистится влажной тряпкой
• Температура плавления 324 градуса по Фаренгейту — непроницаемость для пролитой кипящей воды
• Рекомендуемый предел веса 10 фунтов
• Подходит для пеших прогулок, кемпинга на мотоциклах, кемпинга в гамаке, каякинга, рыбалки, скалолазания и других видов отдыха на природе

_______________________________________________

Технические характеристики:

• Столешница размером 8 x 12 дюймов находится на высоте 3 1/4 дюйма от земли
• Складывается в компактную упаковку 4 «x 12» x 3/4 «

Вес: 2.2 унции

Материалы:

• Конструкция из 100% пластика
• Светоотражающая лента
• Круги на липучке и пластиковые кнопки # 20

Невозможно удалить пространство Confluence из-за ошибки «удаленный объект будет повторно сохранен каскадом» | Confluence

Проблема

Невозможно удалить пространство Confluence. Процесс зависает в пользовательском интерфейсе, и в atlassian-confluence появляется следующее.журнал

  2019-08-26 12: 00: 17,288 ОШИБКА [Длительная задача: длительная задача удаления пространства] [atlassian.confluence.event.ConfluenceEventDispatcher] run Произошло исключение при попытке отправить событие [com.atlassian.confluence. event.events.space.SpaceWillRemoveEvent [source=com.atlassian.confluence.spaces.DefaultSpaceManager@650ee893]] от вызывающего [com.atlassian.confluence.event.ConfluenceListenerHandlersConfiguration$TimingListenerHandlerda971d$1@2
 - площадь: 11111111 | URL: / пробелы / doremovespace.действие | traceId: e0eb56d25a6493e4 | userName: admin | referer: http: // localhost: 8090 / space / removespace.action? key = KEY | действие: doremovespace
java.lang.RuntimeException: удаленный объект будет повторно сохранен каскадом (удалить удаленный объект из ассоциаций): [com.atlassian.confluence.pages.Page # 1111111]. Слушатель: com.atlassian.confluence.core.listeners.BundledContentSpaceRemovalListener событие: com.atlassian.confluence.event.events.space.SpaceWillRemoveEvent
    в com.atlassian.event.internal.SingleParameterMethodListenerInvoker.invoke (SingleParameterMethodListenerInvoker.java:55)  

Причина

Обратите внимание, что вы можете увидеть несколько ошибок, подобных приведенной выше, в журналах с упоминанием различных объектов. Чтобы убедиться, что вы столкнулись с этой проблемой, прежде чем запускать обходной путь, проверьте, есть ли в одном из сообщений связанный элемент, указанный ниже:

  com.atlassian.confluence.pages.Page #   

Если вы видите одно или несколько сообщений с упомянутым объектом, то причиной проблемы являются страницы в корзине.

Обходной путь

Чтобы избежать этой проблемы, очистите мусор перед удалением пространства следующим образом:

1. Перейдите в пространство, которое вы хотите удалить, и выберите Инструменты пространства> Инструменты содержимого в нижней части боковой панели
2. Выберите Корзина
3. Выберите Очистить все , чтобы полностью очистить корзину
4. Попробуйте снова удалить пространство

Примечание

Пока не ясно, как воспроизвести эту проблему.В идеале инструмент удаления пространства удалял бы все связанные с ним объекты автоматически. Однако есть еще не определенное особое условие, которое может вызвать эту ситуацию.

Литые охладители Roto | Каскад Маунтин Тех

Роторно-формованные охладители известны своей долговечностью и длительным удерживанием льда, благодаря чему ваши продукты и напитки остаются прохладными и охлажденными при хранении льда в течение нескольких дней. Super Cooler от Cascade Mountain Tech — это охладитель, полученный роторным формованием, который, как доказано, сохраняет лед в течение 7–10 дней.Термин «охладитель ротационной формы» происходит от процесса ротационного формования, с помощью которого они изготавливаются.

, изготовленные методом роторного формования, превосходят другие типы охладителей, поскольку они изготовлены с помощью прочного ротационного формования с использованием высокой температуры и давления для обеспечения наиболее прочной конструкции. Формованный как одно изделие с расплавленным пластиком, непрерывно заливаемым толстой изоляцией, каждая зона охладителя имеет минимальные дефекты и имеет сплошную толстую стенку.

Roto делают продукт очень прочным без каких-либо швов и обеспечивают максимальное время охлаждения для защиты скоропортящихся продуктов. Прочная конструкция также защищает от лесных существ, а суперохладители Cascade Mountain Tech имеют рейтинг сертифицированной устойчивости к медведям Межведомственного комитета по медведям гризли.

Размеры и аксессуары для литых охладителей Roto

Cascade Mountain Tech предлагает два размера охладителей, изготовленных методом роторного формования, с вариантами модели на 45 и 80 литров, обе из которых имеют пенопластовую изоляцию до трех дюймов и прокладку крышки, подходящую для морозильной камеры.Каждый кулер имеет следующие характеристики:

• Сертификат устойчивости к медведям
• Очень толстый пенопласт с изоляцией до 3 дюймов на стенках и крышке
• Чрезвычайно прочная конструкция, изготовленная методом роторно-формовки
• Прочные веревочные ручки
• Резиновые защелки для тяжелых условий эксплуатации
• Ножки нескользящие
• Два встроенных открывалки для бутылок

Охладитель на 45 литров вмещает до 38 банок плюс лед, модель на 80 литров вмещает до 70 банок плюс лед и включает в себя подстаканник и корзину для сухого хранения.Дополнительные аксессуары для наших кулеров Super Rotomolded включают разделитель для разделения продуктов питания и замки для охладителей, чтобы не подпускать более умных, чем среднестатистических, медведей.

Преимущества охладителей Roto Molded

Люди хотят знать, действительно ли суперохладитель роторной формы лучше? Доказано, что наши суперохладители выдерживают суровые условия и практически любую степень неправильного обращения, сохраняя при этом лед до 10 дней. Это очень полезно, когда вы находитесь в дикой местности, где нет доступа для заполнения льда.

Вы получите максимальную пользу и максимально продолжительное удержание льда, если сначала охладите свой кулер. Просто поместите немного льда или замороженные кувшины в кулер за день заранее, чтобы начать с хорошо охлажденного кулера. Ваш суперкулер от Cascade Mountain Tech будет держать вас в прохладе в любом приключении на свежем воздухе с приятными напитками в течение нескольких дней.

Cascade Mountain Tech предлагает долговечные, высококачественные продукты, проверенные самыми заядлыми энтузиастами активного отдыха.