Меню Закрыть

Сложные техники окрашивания: Сложные техники окрашивания волос в Химках

Содержание

Техники окрашивания для длинных волос

Поделиться статьёй:

Окрашивание волос — самый простой и верный способ изменить что-либо в своей жизни. Для этого необходимо просто найти мастера, который поймет ваши желания и изменит ваш образ, подчеркнув стиль, красоту и индивидуальность. А вместе с этим изменится и ваша жизнь.

Основные виды окрашивания длинных волос

К основным видам окрашивания волос, применяющимися уже на протяжении двух десятилетий, можно отнести мелирование, колорирование и балаяж.

Во время мелирования осветляются только отдельные прядки. Благодаря тому, что большая масса волос остается нетронутой, это достаточно щадящий способ окрашивания. При этом, мелирование позволяет получить более светлый тон и заметно освежить образ.

Колорирование выполняется по аналогии с мелированием, только пряди не осветляются, а окрашиваются в любой выбранный оттенок.

Окраска волос способом балаяж прекрасно подходит для творческих и креативных людей, желающих подчеркнуть свою индивидуальность.

Во время процедуры окрашиваются лишь кончики волос, а цвет выбранного оттенка зависит только от фантазии клиента.

Подробнее узнать о различных методиках окрашивания длинных волос можно на курсах профессионального окрашивания. На занятиях вы познакомитесь с различными видами окрашивания волос. Научитесь выполнять сложные окрашивания на практике и подбирать удачные цвета и оттенки.

Популярные способы окрашивания

На сегодняшний день среди современных видов окрашивания длинных волос особой популярностью пользуются техники омбре, шатуш, брондирование волос.

Окрашивания волос омбре

Придя к нам из Голливуда и сыскав популярность несколько лет назад, техника омбре остается актуальна который сезон. Она универсальна – подходит блондинкам,  брюнеткам, рыжим и прекрасно выглядит на волосах любой длинны. Благодаря тому, что в результате окрашивания создается эффект перехода от темных корней к более светлым кончикам, прическа выглядит стильной и объемной.

Окрашивания волос шатуш

Окрашивание волос в технике шатуш, как и при окрашивании омбре, позволяет получить на волосах эффект выгоревших волос. Она оказывает минимальное негативное влияние на волосы и не занимает большое количество времени. Мастер чередует темные и светлые пряди, тщательно растушевывая краску до получения ровного, естественного перехода. Такое окрашивание не требует дальнейшего тонирования и позволяет замаскировать отрастающие корни волос.

Брондирование волос

Брондирование волос – одна из самых модных техник окрашивания в этом сезоне. В ходе процедуры используется микс из 3-4 близких оттенков от темного к светлому. Главная задача стилиста — подобрать оттенки, подходящие к типу внешности и выглядящие максимально естественно — пшеничный, перламутровый,бежевый, янтарный и пр. Такое окрашивание позволит сделать образ ярче и выразительнее.

Еще один метод окрашивания, идеально подходящий для длинных волос и набирающий популярность в последнее время — нанесение рисунка. Процедура схожа с трафаретной техникой — рисунок выполняется на бумаге, а потом, с помощью кисти или спонжа, наносится на волосы. Такой тип окрашивания подойдет для дерзких, молодых  девушек, желающих добавить яркости и креативности в свой облик.

Поделиться статьёй:

Объявления Сахалина

Все города

Южно-Сахалинск

Александровск-Сахалинский

Анива

Быков

Вахрушев

Горнозаводск

Долинск

Ильинский

Корсаков

Красногорск

Курильск

Макаров

Малокурильское

Невельск

Ноглики

Оха

Поронайск

Северо-Курильск

Смирных

Томари

Тымовское

Углегорск

Холмск

Чехов

Шахтерск

Южно-Курильск

Абакан

Анапа

Артём

Архангельск

Астрахань

Барнаул

Белгород

Бийск

Биробиджан

Благовещенск

Брянск

Ванино

Владивосток

Владикавказ

Владимир

Волгоград

Волжский

Вологда

Воронеж

Геленджик

Грозный

Дзержинск

Евпатория

Ейск

Екатеринбург

Иваново

Ижевск

Иркутск

Казань

Калининград

Калуга

Кемерово

Керчь

Киров

Кисловодск

Комсомольск-на-Амуре

Кострома

Краснодар

Красноярск

Курган

Курск

Липецк

Магадан

Магнитогорск

Махачкала

Москва

Мурманск

Набережные Челны

Находка

Нижневартовск

Нижний Новгород

Нижний Тагил

Новокузнецк

Новороссийск

Новосибирск

Омск

Орёл

Оренбург

Пенза

Пермь

Петрозаводск

Петропавловск-Камчатский

Пятигорск

Ростов-на-Дону

Рязань

Самара

Санкт-Петербург

Саранск

Саратов

Севастополь

Симферополь

Смоленск

Сочи

Ставрополь

Стерлитамак

Сургут

Таганрог

Тамбов

Тверь

Тольятти

Томск

Тула

Тюмень

Улан-Удэ

Ульяновск

Уссурийск

Уфа

Хабаровск

Чебоксары

Челябинск

Череповец

Чита

Якутск

Ялта

Ярославль

Балаяж – это когда солнце запуталось в волосах! Эффектная техника окрашивания

Многие модницы, идущие в ногу с веяниями моды, прибегают к креативному окрашиванию волос. Сегодня существует масса интересных техник: ombre, растяжки цвета, калорирование, мелирование. Но самой популярной, наиболее эффектной считается балаяж. Это универсальный вид тонирования, подходящий под любой цвет, тип волос и даже под любую стрижку. Профессионалы студии красоты ProZa рекомендуют перед покраской подстричься, придать форму локонам, конечно, если в этом есть необходимость. Безупречный результат техники окрашивания балаяж – это более пышные, объемные пряди волосков в насыщенном глубоком цвете. Мерцающие, струящиеся локоны, будто яркое солнце запуталось в волосах, придают образу романтичности, чувственности, женственности.

Особенности окрашивания волос в технике балаяж

Балаяж в переводе – это «взмах» или «мазок», соответственно можно представить технику исполнения:

  • Краска наносится на пряди легкими и «небрежными» мазками.
  • Оттенок распределяется не только по вертикали, но и по горизонтали, во избежание эффекта «грязного цвета».
  • Пряди выбираются маленькие, длина мазка каждый раз меняется, делается тщательная растяжка оттенка. Мастер как бы сгоняет оттенок от верха пряди вниз, поэтому самый интенсивный тон образуется на кончиках.

В итоге светлые тона оказываются на разной высоте, что и создает эффект естественных выгоревших прядей. Во время тонирования волос не используют фольгу, шапочку, следовательно, волосы не прогреваются. Однако данный метод очень сложный в исполнении. Добиться самостоятельно эффекта плавного перехода от натуральных прядей к окрашенным очень непросто.

Для обладательниц русых локонов вариации сочетаний цветов не ограничены. Вспомогательные оттенки пепельного, жемчужного тона – идеальное решение для модниц с холодноватым цветом естественных волос. Для натуральных волос теплого оттенка при окрашивании выбирают теплые тона пшеничной палитры, ореха, меда.

Светлые волосы самые сложные в окрашивании техникой балаяж. Наиболее часто естественный блонд «разбавляют» оттенками томленых сливок и соломы. С целью достижения более яркого контрастного эффекта используют тона: сливочный крем, кофе с молоком, карамель, ольха и прочие.

Рыжеволосым дамам окрашивание рекомендуют выполнять в янтарной палитре: бронзовых и медных цветах разной градации.

Основные преимущества методики балаяж

Окрашенные этой техникой локоны выглядят роскошно. С целью создания плавного перехода используют нескольких оттенков цветовой палитры от мягких до четких и контрастных. Для каждого цвета, длины прядей есть свой подход и методика. Техника обладает множеством достоинств:

  • Щадящим окрашиванием, возможностью оставлять корни своего родного оттенка без необходимости постоянно их подкрашивания.
  • Сохранением естественного вида локонов.
  • Омолаживающим и освежающим эффектом. В солидном возрасте с однотонным окрашиванием рекомендуют быть осторожными, чтобы визуально не прибавить себе лет. Более того, мерцающие блики седины в этой методике исполнения, смотрятся гармонично и натурально.

Особенно эффектно тонирование выглядит на темных оттенках макушки волос с яркими контрастными переходами до осветленных кончиков. Также имеет место сочетание неординарных цветов: черного и розового (лилового), синего и темного. Актуальны такие окрашивания, как:

  • имитация бликов на прядках волос – отличный способ сохранить естественную красоту локонов;
  • карамельный – оттенок может переходить от темного до ярко-рыжего, а может быть в виде карамельных мерцающих бликов по всей длине.

Прическа мечты с профессионалами студии ProZa – это реальность

Тонирование методом балаяж целесообразно доверить опытным специалистам салона красоты ProZa. Мастера оперативно справятся с поставленной задачей. Хотите подольше сохранить «солнечные переливы» в ваших локонах? Воспользуйтесь бесплатными рекомендациями по правильному уходу за волосами. Студия обеспечивает внимательный и творческий подход к выполнению поставленных задач, а также невысокую стоимость на оказываемые качественные услуги.

Балаяж – эффект «поцелуя солнца» с правильно определенными акцентами для каждой черты вашего лица.

4.

1: Введение в окрашивание — Биология LibreTexts

Зачем нужно окрашивать бактерии?

Большинство типов клеток не имеют большого количества естественного пигмента, поэтому их трудно увидеть под световым микроскопом, если они не окрашены. Чтобы сделать бактериальные клетки более заметными, используются несколько типов красителей. Кроме того, можно использовать специальные методы окрашивания для определения биохимических или структурных свойств клеток, таких как тип клеточной стенки и наличие или отсутствие эндоспор.Этот тип информации может помочь ученым идентифицировать и классифицировать микроорганизмы, а также может использоваться поставщиками медицинских услуг для диагностики причины бактериальной инфекции.

Простое пятно

Одним из типов процедуры окрашивания, который может быть использован, является простое пятно , в котором используется только одно пятно, и все типы бактерий выглядят как цвет этого пятна при просмотре под микроскопом. Некоторые пятна, обычно используемые для простого окрашивания, включают кристаллический фиолетовый, сафранин и метиленовый синий.Простые красители можно использовать для определения морфологии и расположения бактерий, но они не дают никакой дополнительной информации. Живые бактерии почти бесцветны и не имеют достаточного контраста с водой, в которой они находятся во взвешенном состоянии, чтобы быть четко видимыми. Цель окрашивания — увеличить контраст между организмами и фоном, чтобы их было легче увидеть в световом микроскопе. При простом окрашивании бактериальный мазок окрашивается раствором одного красителя, который окрашивает все клетки в один цвет без дифференциации типов или структур клеток.Единственный краситель, используемый здесь в нашей лаборатории, — это метиленовый синий, основной краситель. Основные красители, имеющие положительный заряд, прочно связываются с отрицательно заряженными компонентами клетки, такими как бактериальные нуклеиновые кислоты и стенки клеток.

Изображение 1: Вид под микроскопом Bacillus (палочковидные) бактерии, окрашенные просто кристаллическим фиолетовым. Выделено и получено Мунтасиром Аламом, факультет микробиологии Университета Дакки в 2007 году. Https://commons.wikimedia.org/wiki/F…micrograph.jpg

Смотрите видео 1: как наносить простое морилку

Посмотреть видео 1: Как нанести простое окрашивание на бактериальную культуру, NC BioNetwork (4:05) URL: https: // youtu.be / 8ODeT9DLHKI

Пятно по Граму

Ученые часто предпочитают проводить дифференциальное окрашивание , так как это позволяет им собрать дополнительную информацию о бактериях, с которыми они работают. В дифференциальных красителях используется более одного красителя, и клетки будут иметь разный внешний вид в зависимости от их химических или структурных свойств. Некоторыми примерами дифференциальных красителей являются окраска по Граму, кислотостойкая окраска и окраска на эндоспоры. Вы узнаете, как подготовить бактериальные клетки к окрашиванию, и узнаете о технике окрашивания по Граму.

Эта широко используемая процедура окрашивания была впервые разработана датским бактериологом Гансом Кристианом Грамом в 1882 году (опубликована в 1884 году) при работе с образцами тканей легких пациентов, умерших от пневмонии. С тех пор процедура окрашивания по Граму широко используется микробиологами во всем мире для получения важной информации о видах бактерий, с которыми они работают. Знание реакции по Граму клинического изолята может помочь медицинскому работнику поставить диагноз и выбрать подходящий антибиотик для лечения.

Результаты окрашивания по Граму

отражают различия в составе клеточной стенки. Грамположительные клетки имеют толстые слои пептидогликана (углевода) в клеточных стенках; Грамотрицательных бактерий очень мало. Грамположительные бактерии также содержат тейхоевую кислоту, а грамотрицательные — нет. Грамотрицательные клетки имеют внешнюю мембрану, которая напоминает бислой фосфолипидов клеточной мембраны. Наружная мембрана содержит липополисахариды (ЛПС), которые выделяются в виде эндотоксинов при гибели грамотрицательных клеток. Это может беспокоить человека с инфекцией, вызванной грамотрицательным организмом.

Изображение 2: Микроскопическое изображение окрашивания по Граму смешанных грамположительных кокков ( Staphylococcus aureus ATCC 25923, фиолетовый) и грамотрицательных бацилл ( Escherichia coli ATCC 11775, красный). Увеличение: 1000. Изображение Ю. Тамбе. https://commons.wikimedia.org/wiki/F…m_stain_01.jpg

На рисунке 1 ниже показаны основные различия между грамположительными и грамотрицательными клеточными стенками.Различия в составе клеточной стенки отражаются в том, как клетки реагируют с красителями, используемыми в процедуре окрашивания по Граму.

Окрашивание по Граму

лучше всего проводить на свежих культурах — более старые клетки могут иметь поврежденные клеточные стенки и не давать правильной реакции по Граму. Некоторые виды известны как с грамм-переменной , поэтому на вашем слайде могут быть видны как грамположительные, так и грамотрицательные реакции.

Неправильная техника окрашивания может привести к неточным результатам.Одним из наиболее важных этапов окрашивания по Граму является этап обесцвечивания (использование спирта / ацетона). Если обесцвечивающее средство не оставить на достаточно долгое время, оно не сможет различить грамположительные и грамотрицательные бактерии. На этом этапе используется обесцвечивающее средство из смеси спирта и ацетона. Его функция у грамотрицательных бактерий заключается в удалении внешней клеточной мембраны и тонкого слоя пептидогликана. Клеточная мембрана в основном состоит из липидов и чувствительна к спиртам. При растворении этих слоев комплекс кристаллического фиолетового и йода также удаляется, и, таким образом, негативы по Граму теперь могут поглощать вторичное окрашивание, сафранин, которое используется на последнем этапе окрашивания по Граму, окрашивая их в розовато-красный цвет и дифференцируя их. между ними и грамположительными, которые с их толстым пептидогликановым слоем сохранили первичное окрашивание, кристаллический фиолетовый, и выглядят пурпурно-синим. С другой стороны, если вы используете слишком много обесцвечивающего средства, он может обесцветить ваш образец на предметном стекле, что приведет к потере комплекса кристаллический фиолетовый (основное пятно) -йод. Этап обесцвечивания чувствителен из-за структуры клеточной стенки. Даже грамположительные бактерии с их толстыми клеточными стенками могут чрезмерно обесцвечиваться, что приводит к потере пептидогликанового слоя и комплекса кристаллического фиолетово-йода. Когда на последнем этапе применяется вторичная окраска, сафранин, грамположительные бактерии улавливают это пятно и приобретают красновато-розовый цвет вместо пурпурного / синего.Посмотрите видео 2, чтобы увидеть пример этого.

Еще одна распространенная ошибка — при приготовлении бактериального мазка, который делается на первом этапе любой процедуры окрашивания. Это включает нанесение тонкой пленки бактерий на предметное стекло микроскопа, а затем термофиксации либо горелкой Бунзена, либо бактицинератором, либо нагревателем предметных стекол. Основная цель этого шага — прикрепить бактериальные клетки к предметному стеклу микроскопа (он также денатурирует белки и убивает их).Если вы забудете сделать этот шаг, то клетки будут «смыты» на всех последующих этапах процесса окрашивания. На вашем слайде буквально не останется клеток, которые можно было бы окрасить!

Хотя подавляющее большинство бактерий являются грамположительными или грамотрицательными, важно помнить, что не все бактерии могут быть окрашены с помощью этой процедуры (например, микоплазмы, у которых нет клеточной стенки, плохо окрашиваются красителем по Граму).

Рисунок 1: грамположительных и грамотрицательных клеточных стенок

Special Stains

Существует множество процедур окрашивания, используемых для идентификации определенных внешних или внутренних структур, которые не обнаруживаются у всех видов бактерий, таких как окраска капсулы и окраска жгутиков.Для получения изображений и других примеров специализированных пятен см. Ниже и в следующем разделе, 4. 2 специализированные методы бактериального окрашивания.

Капсула Stain

Некоторые бактерии выделяют богатую полисахаридами структуру вне клеточной стенки, называемую гликокаликсом. Если гликокаликс тонкий и неплотно прикрепленный, он называется слоем слизи ; если она толстая и плотно связана с клеткой, она называется капсулой . Гликокаликс может защитить клетку от высыхания и может позволить клетке прилипать к поверхностям, таким как ткани в организме.Они также могут обеспечивать клетки защитой от обнаружения и фагоцитоза иммунными клетками и способствовать образованию биопленки: таким образом, гликокаликс может действовать как фактор вирулентности; (способствует способности организма вызывать болезнь).

Капсулы

могут быть обнаружены с помощью процедуры отрицательного окрашивания , при которой фон (слайд) и бактерии окрашиваются, но капсула не окрашивается. Капсула выглядит как чистая неокрашенная зона вокруг бактериальной клетки. Поскольку капсулы разрушаются при нагревании, процедура окрашивания капсулы выполняется без термической фиксации бактерий.

Серебряное пятно

Жгутики (длинные шиповидные структуры, используемые для подвижности бактерий) и некоторые бактерии (например, спирохет ) слишком тонкие, чтобы их можно было наблюдать с помощью регулярных процедур окрашивания. В этих случаях используется морилка . Нитрат серебра применяется к бактериям вместе со специальной протравой; нитрат серебра осаждается вокруг жгутиков или тонких бактерий, утолщая их, чтобы их можно было наблюдать под световым микроскопом.

Дифференциальное окрашивание — обзор

1 Цитология дистальной части

Первоначально с помощью дифференциального окрашивания в сочетании с экспериментальными манипуляциями было определено, что существует один клеточный тип, ответственный за синтез и высвобождение каждого тропического гормона, за одним исключением. Эти первоначальные наблюдения были позже подтверждены и уточнены исследованиями под электронным микроскопом (рис. 4.6) и иммуноцитохимическими исследованиями с использованием антител, полученных против каждого гормона гипофиза.В следующих описаниях мы даем традиционное обозначение млекопитающих для каждого из этих пяти типов клеток. Клетки, ответственные за секретирование тропных гормонов, обозначены суффиксом — троп . Поскольку тропические гормоны раньше назывались «трофическими гормонами», некоторые авторы до сих пор называют типы клеток суффиксом «-троф».

Рисунок 4.6. Гонадотропный ( слева, ) и кортикотропный ( справа, ) типы клеток.

Обратите внимание на различия в количестве и размере электронно-плотных гранул.Сравните с лактотропом и соматотропом на рис. 4.7.

Адаптировано с разрешения Norman, A.W., Litwack, G., 1997. Hormones, second ed. Academic Press, Сан-Диего, Калифорния.

Тиротроп — наименее распространенный из типов секреторных клеток в дистальной части. Тиротропы имеют длинные цитоплазматические отростки и содержат сферические секреторные гранулы. Они возникают в основном в передне-медиальной части дистальной части и мало варьируются в зависимости от пола и возраста.

Несмотря на химическое сходство ГТГ и ТТГ ( см. , стр. 109), гонадотроп легко отличить от тиреотропа цитологическими и иммунологическими методами.Гонадотропы составляют около 15% –20% клеток дистальной части и распределены по всей дистальной части. По размеру можно выделить две популяции сферических или слегка неправильной формы секреторных гранул. По разнице в иммунореактивности идентифицировали по крайней мере три гонадотропных подтипа. Один подтип содержит только ФСГ, один — только ЛГ, а третий — как ЛГ, так и ФСГ.

Два отдельных типа клеток в дистальной части считаются источниками GH и PRL соответственно (рис.4.7). Соматотроп является наиболее распространенным типом клеток в дистальной части, составляя около 50% клеток, и обнаруживается в основном по боковым краям дистальной части. Второй, называемый лактотропом , секретирует ПРЛ. Лактотропы составляют от 10% до 25% клеток в дистальной части, при этом более низкий показатель характерен для мужчин и нерожавших женщин (никогда не рожавших детей). У детей относительно мало клеток, секретирующих ПРЛ. Лактотропы распределены по всей дистальной части, часто связанной с гонадотропами.По крайней мере два лактотропа были идентифицированы с использованием ультраструктурных критериев. Одна из них представляет собой обычную, редко зернистую клетку с более мелкими сферическими, овальными или неправильными гранулами. Второй тип встречается редко, плотно гранулирован и обычно встречается рядом с капиллярами. Описан третий тип клеток, соматомаммотроп , который секретирует как GH, так и PRL, особенно во время беременности.

Рисунок 4.7. Соматотропные (GH), лактотропные (PRL) и фолликоостеллярные клетки (SC).

Все три типа клеток расположены рядом с капилляром (CAP).Клетки гормона роста (GH) и пролактина (PRL) различаются по размеру и относительному количеству секреторных гранул, тогда как SC не гранулируются и демонстрируют тенденцию к образованию фолликулярной структуры (F), где они контактируют друг с другом. Сравните с гонадотропами и кортикотропами на рис. 4.6.

По материалам Baker, B.L., Yu, Y.Y-Y., 1975. Cell and Tissue Research 156, 443–449.

Кортикотропы , продуцирующие АКТГ, расположены в центральном клине внутри дистальной части и составляют 10-15% от общего числа клеток.Они содержат множество гранул, которые несколько больше, чем у тиреотропов, и обладают иммунореактивностью в отношении АКТГ, ЛПГ и β-эндорфина.

Кортикотропы также иммунореактивны по отношению к нитевидному белку цитокератин , который встречается в перинуклеарной области и обычно не встречается в других тропических клетках. Количество кортикотропов не зависит от возраста или пола, но может заметно различаться при ряде патологических состояний (см. Главу 8).

Тщательные исследования распределения гормонов, рецепторов, присутствующих в тропических клетках гипофиза, и разнообразия генов гормонов, экспрессируемых каждой тропической клеткой, нарисовали гораздо более динамичную картину дистального отдела мозга, чем считалось ранее. У нас есть не только несколько популяций GTH-секретирующих клеток и PRL-секретирующих клеток, но мы также обнаруживаем некоторые клетки, которые производят большее разнообразие тропных гормонов, чем предполагалось ранее. Например, некоторые гонадотропы не только производят ГТГ, но также могут производить ГР. Более того, эти клетки GTH-GH обладают рецепторами для обоих высвобождающих гормонов гипоталамуса, что позволяет предположить, что эти клетки секретируют оба гормона. Было обнаружено, что кортикотропы различаются в зависимости от типа рецепторов, которые они экспрессируют для рилизинг-гормона кортикотропина (CRH) , и по их способности связывать нейропептид вазопрессин.Используя многие из молекулярных методов, описанных в главе 2, исследователи обнаружили присутствие мРНК более чем одного тропического гормона в тропических клетках гипофиза, что означает, что, если эти клетки получат соответствующие сигналы, они могут начать секрецию альтернативных гормонов. Эти новые разработки предполагают гораздо более динамичную цитологию гипофиза, чем считалось ранее.

Шестой тип клеток, обнаруженный в дистальной части тела млекопитающих, представляет собой негранулированные клетки, которые не различаются методами селективного гистологического окрашивания, но иногда могут быть выделены с помощью иммуноцитохимических методов (глава 2).Негранулированные клетки могут представлять собой неактивные, истощенные или недифференцированные клетки, и некоторые из последних могут дифференцироваться в клетки, секретирующие гормоны, в зависимости от стадии развития или физиологических условий или в ответ на экспериментальные манипуляции. Один тип негранулированных клеток, обнаруженный в 1980 году в рамках скрининга аденомы гипофиза, первоначально назывался нулевой клеткой , поскольку не имел особых гистологических, иммунореактивных или ультраструктурных особенностей, кроме наличия нескольких небольших цитоплазматических гранул.Недавняя работа с использованием более чувствительных диагностических инструментов определила нулевые клетки как подтипы гонадотропных клеток, которые могут быть менее активными или неподвижными. Особый тип негранулированных клеток, фоллико-стеллярных клеток , наблюдался у всех позвоночных с помощью электронного микроскопа. Клетки фолликоостеллятов содержат белок S-100 , характерный для нейроглиальных клеток головного мозга, а белок S-100 не обнаружен ни в каких других клетках аденогипофиза. Цитоплазматические отростки этих звездчатых (звездчатых) клеток, связанных с глией, очень длинные и образуют своего рода сеть или ретикулум между капиллярами по всей дистальной части.Их называют фолликулярными из-за того, что их звездчатые отростки иногда окружают или закрывают крошечные пространства. Каждый из этих фолликулов состоит из внеклеточного пространства, полностью окруженного отростками фолликоостеллярных клеток и заполненного жидкостью (рис. 4.7). Микроворсинки, а иногда и реснички выступают в просвет этих фолликулов. Клетки фолликоостеллятов могут выполнять поддерживающую или питательную функцию и, как известно, действуют как фагоцитарные клетки-поглотители.Вероятно, они не являются источником каких-либо тропических гормонов, но они действительно производят паракринные секреции, включая интерлейкин (IL-6) , основной фактор роста фибробластов (bFGF) и фактор роста эндотелиальных клеток сосудов (VEGF) . Секреции фолликоостеллатных клеток в культуре снижают высвобождение GH, PRL и LH после введения веществ, которые обычно вызывают их высвобождение. Наконец, недавние данные показывают, что фолликоостеллатные клетки обладают свойствами стволовых клеток и могут дифференцироваться в другие типы клеток.

Гематологические пятна

Гематологические пятна HARLECO

®

Продукты HARLECO ® — это 90 лет качества окрашивающих растворов и вспомогательных продуктов для гематологической лаборатории. Наш обширный ассортимент продукции отвечает потребностям вашей повседневной лабораторной работы и многих других специальных приложений. Большинство сухих красителей и растворов HARLECO ® очень похожи на классические составы. Мы также предлагаем полные линейки продуктов для пробоподготовки и некоторые новые формулы для более безопасных фиксаторов и обработки проб.

Hemacolor

® быстрое окрашивание

Наша передовая линейка Hemacolor ® поможет вам быстро окрашивать и дифференцировать мазки крови. Независимо от того, выполняются ли они вручную или автоматически, растворы и наборы Hemacolor ® позволяют эффективно достичь яркости и воспроизводимости окрашивания по Паппенгейму всего за 30 секунд.

  • Растворы и наборы Hemacolor ® содержат буферные таблетки плюс 3 готовых к использованию высокостабильных раствора (фиксирующий, красный и синий растворы).
  • Также доступны индивидуальные растворы для быстрого окрашивания Hemacolor ®
  • Система автоматического окрашивания Hemacolor ® была разработана для автоматического окрашивания мазков крови и костного мозга в сочетании с окрашивателем для предметных стекол Hematek ® (Siemens Healthcare Diagnostics).

Цитохимические реактивы и наборы

Мы впервые применили метод цитохимии, демонстрирующий многочисленные клинически важные клеточные ферменты, путем коммерческого внедрения стабилизированных солей диазония и замещенных субстратов нафтола.Мы также представили стабилизированные базовые решения (база Fast Red Violet LB, база Fast Blue BB и база Fast Garnet GBC), которые позволяют легко регулировать объемы рабочих реагентов в соответствии с вашими потребностями. Все наши наборы представлены в удобных, простых в использовании форматах и ​​могут использоваться в клинических и исследовательских целях.

ГЕМАТОГНОСТ Fe

® набор для окрашивания

Определите местонахождение клеточных компонентов и проанализируйте ферментативную активность в крови с помощью нашего полного набора готовых к использованию реагентов для цитохимического окрашивания.Эти высококачественные решения обеспечивают надежную и оптимальную визуализацию цитохимии ферментов и патологические изменения в крови пациента. Наборы HEMATOGNOST Fe ® обнаруживают свободное ионное железо (Fe 3+ ) в клетках посредством реакции берлинской синей (берлинской синей), которая позволяет диагностировать различные состояния, включая гемохроматоз, асбестоз или заболевания костного мозга.

Вспомогательные средства для гематологии

Обеспечьте правильную фиксацию и установку ваших гематологических образцов и добейтесь стабильных и воспроизводимых результатов с помощью нашего обширного ассортимента вспомогательных продуктов.Найдите все необходимое для подготовки, исправления, окрашивания, хранения и крепления гематологических образцов:

  • Буферные таблетки для приготовления растворов для ополаскивания со стабильным pH
  • Иммерсионные масла для микроскопии с большим увеличением
  • Монтажные среды и монтажные агенты водные и неводные
  • Принадлежности для лабораторий гематологии и гистологии прочие

Midas

® III-Plus автоматический краситель

Автоматический краситель Midas ® III-Plus дает вам возможность автоматизировать все гематологические и бактериологические окрашивания.Поскольку прибор полностью программируется, вы можете дублировать существующие методы окрашивания и гарантировать стабильные результаты для мазков периферической крови и костного мозга, а также бактериологических мазков.

Гистологические, гистоморфометрические и биомеханические исследования медицинских устройств с костной имплантацией: заливка твердой смолой

Растущая частота дегенеративных заболеваний опорно-двигательного аппарата, а также изменения образа жизни привели к увеличению хирургических процедур с использованием имплантированных медицинских устройств в ортопедии.При изучении границы раздела имплантат / ткань в твердых материалах (например, металлах или плотном пластике) и / или в крупных костных сегментах необходимо заделать твердую пластмассу неповрежденной некальцинированной тканевой оболочки с имплантатом in situ . Целью данной работы является описание достижений и возможностей внедрения высокотемпературного метилметакрилата (ММА) для гистологической, гистоморфометрической и биомеханической оценки медицинских устройств с костной имплантацией. В отличие от обычных методов, гистология обработки некальцинированной кости с использованием высокотемпературного ММА требует сложной и точной методологии обработки образцов, а также наличия сложного оборудования и программного обеспечения как для подготовки образцов, так и для анализа.Встраивание ММА позволяет оценивать биологические реакции на наличие имплантированных медицинских устройств без удаления имплантата, позволяя одновременно проводить качественную и количественную гистологическую оценку, как статическую, так и динамическую гистоморфометрию, а также биомеханические анализы, невозможные при декальцификации тканей. Заливка ММА, несмотря на то, что это сложная процедура, по-прежнему предпочтительнее других видов заделки на основе смолы из-за ее специфических характеристик, которые позволяют исследовать образцы больших размеров, также имплантированные твердыми материалами, без уменьшения размера образца или удаления материала.Динамические измерения разрешены вместе с биомеханическими исследованиями на границе раздела кость-биоматериал, что позволяет получить исчерпывающую и точную оценку безопасности и эффективности медицинских устройств для ортопедической регенеративной, реконструктивной и репаративной хирургии.

1. Введение

Ортопедические медицинские устройства оказались чрезвычайно успешными в восстановлении подвижности, уменьшении боли и улучшении качества жизни миллионов людей каждый год [1, 2]. В настоящее время в качестве костных имплантатов и каркасов для регенеративной, реконструктивной и репаративной медицины разрабатываются различные виды синтетических или композитных материалов со сложными топографическими характеристиками и технологиями производства [3].Последний этап утверждения медицинского устройства для использования пациентом проходит через исчерпывающий нормативный процесс для предотвращения клинических осложнений или любых других близких или отдаленных побочных эффектов. В этом нормативном процессе тестирование нового материала включает анализов in vitro, с клеточными культурами и анализов in vivo, с использованием подходящих животных моделей. Биосовместимость, то есть процесс оценки материалов, используемых при производстве медицинских устройств (или их компонентов), регулируется серией международных стандартов ISO 10993.

В биомедицинских исследованиях, когда in vitro исследования неприменимы или не являются исчерпывающими, исследования на животных являются обязательными для изучения безопасности и установления доказательств того, что медицинские устройства в качестве биоматериалов, каркасов, костных заменителей и т. инженерные конструкции. В целом, небольшие лабораторные животные предпочтительны из-за большей простоты содержания и содержания, а также из-за точного ответа на биологические механизмы. Использование крупных животных может быть оправдано на основании специальных научных соображений относительно конкретного исследуемого материала или, если необходимо, с учетом размера имплантата, с тестированием всего устройства или для удовлетворения определенных патофизиологических условий и условий нагрузки.

При изучении границы раздела имплантат / ткань твердых материалов (например, металлов, плотных пластиков) и / или при использовании крупных животных для имплантации материалов в увеличенном масштабе внедрение неповрежденной тканевой оболочки с имплантатом in situ с использованием жесткого пластика. Пластиковая заливка некальцинированных костных тканей — это хорошо зарекомендовавшая себя стратегия гистопатологического и гистоморфометрического исследования образцов, которые не могут быть должным образом оценены с помощью классической парафиновой заливки декальцинированных костных тканей.На сегодняшний день заделка высокотемпературным метилметакрилатом (ММА), несмотря на сложность процедуры, по-прежнему предпочтительнее других видов заделки на основе смолы из-за ее специфических характеристик. По сравнению, например, с водорастворимым ММА, таким как метакрилат гликоль (GMA), высокотемпературный ММА лучше проникает в образцы больших размеров и в то же время может быть удален секциями для улучшения качества окрашивания и оценка морфологии тканей [4]. Кроме того, по сравнению с низкотемпературными смолами на основе ММА, которые позволяют получить более тонкие срезы и, следовательно, лучшую гистопатологическую оценку среза, включение в высокотемпературный ММА может быть предпочтительным.Фактически, это позволяет нам оценивать образцы гораздо большего размера за относительно короткое время и с менее трудоемкими проходами, поскольку другие смолы позволяют оценивать образцы размером до 1,5 см × 1,5 см. Однако внедрение высокотемпературных растворов для заливки на основе ММА для гистологии требует, чтобы лаборатории создали соответствующие рабочие места для всех этапов обработки и заливки, а также для последующих этапов реализации гистологических препаратов. Наличие соответствующих вытяжных шкафов для химических веществ является обязательным для безопасного обращения и подготовки не только для фиксаторов на основе формальдегида, но и для растворов для инфильтрации и заливки на основе ММА, чтобы избежать или минимизировать воздействие паров мономера.Кроме того, удаление мономера ММА и первого раствора для инфильтрации требует специальных процедур. По сравнению с другими наиболее распространенными методами заливки, такими как парафин, заливка высокотемпературным ММА предусматривает более длительные этапы обезвоживания с потреблением спирта и требует дополнительных реагентов для этапов заливки. Принимая во внимание высокую температуру полимеризации ММА, для включения образца необходимы специальные кассеты / формы для заливки, устойчивые к температуре, и гораздо больше внимания следует уделять ориентации образца, потому что, в отличие от воска, полимеризация ММА является необратимой реакцией.Качество финального образца, встроенного в MMA, зависит от правильности выполнения всех вышеупомянутых процедур; только после точной обработки можно проводить различные гистологические, гистоморфометрические и биомеханические исследования.

Поскольку гистология, гистоморфометрия и биомеханика являются ключевыми методологиями оценки медицинских устройств, имплантированных в кости, чрезвычайно важно обновить концепцию «заливки твердой смолой» как метода, не позволяющего проводить точные оценки. Цель данной работы — описать метод изготовления медицинских устройств с костной имплантацией, встроенных в высокотемпературный ММА, и выделить оценки, которые позволяет выполнить этот метод.

2. Материалы и методы

После того, как медицинское устройство с костной имплантацией будет собрано, очень важно быстро выполнить этапы обработки, чтобы предотвратить разрушение ткани, вызванное протеолитическими ферментами, и, на более позднем этапе, сохранить его микроархитектуру, делая его более устойчивым к последующим этапам обработки.

2.1. Фиксация и обезвоживание

Фиксация используется для предотвращения разложения тканей и сохранения структуры клеток и матрикса, а также для усиления последующего окрашивания.Медицинские устройства с костной имплантацией необходимо фиксировать сразу после сбора урожая, чтобы избежать артефактов. Хотя доступно множество фиксаторов, эти образцы обычно фиксируются в 4% параформальдегиде при комнатной температуре. Поскольку важно помещать образцы в избыток фиксатора, начиная с минимально допустимого соотношения фиксатор / ткань 1:20, время фиксации также зависит от размеров образца. Минимальным временем фиксации считается 24 часа. После периода фиксации медицинские изделия с имплантированной костной тканью тщательно промывают в дистиллированной воде в течение не менее 4–6 часов с частой сменой воды, а затем промывают в проточной водопроводной воде еще 4 часа, чтобы удалить весь фиксатор.Чтобы полностью исключить содержание воды в образце, их дегидратируют при увеличивающейся концентрации спиртов с шагом не менее 24 часов каждый, начиная с 50% этанола, 70%, дважды 96% и трижды 100%, в зависимости от размера образца. .

2.2. Embedding

После обезвоживания процедура внедрения высокотемпературного MMA для медицинских устройств с костной имплантацией состоит из следующих основных этапов: (1) Инфильтрация образца мономером MMA в течение 24 часов (2) Инфильтрация образца MMA с добавление пероксида бензоила и тергитола в раствор в течение 24 часов (3) Включение в раствор для заливки: ММА с добавлением пероксида бензоила и тергитола, к которому медленно добавляется низкомолекулярный полиметилметакрилат (ПММА)

После полной суспензии ПММА достигается, принимая во внимание тот факт, что приготовление окончательного раствора для заливки может занять несколько часов, образцы помещаются в полученный раствор в специальные полиэтиленовые кассеты / формы и, наконец, ориентируются в соответствии с требованиями резки.Процесс полимеризации представляет собой экзотермическую цепную реакцию и проводится при строго контролируемых температурах, поскольку реакция может достигать очень высоких температур и быть очень бурной, вызывая образование пузырьков внутри подготовки и движение образцов, что может привести к изменению ориентации, предрасполагающей к следующему: фаза резки. На время полимеризации также влияют многие факторы, помимо температуры, такие как размер образца. Для образцов размером более 3 см потребуется больше времени для завершения заделки, в том числе порядка нескольких недель, в то время как образцы меньшего размера могут занять всего несколько дней.Вся фаза полимеризации, а также приготовление раствора на основе ММА и все стадии инфильтрации должны проводиться под химическим вытяжным шкафом, чтобы избежать диспергирования мономера в воздухе, когда он находится в жидкой форме.

2.3. Разделение и шлифование

После полимеризации блоки извлекаются для их кассет / форм и разрезаются хирургической пилой. Системы резки оснащены алмазными дисками, которые могут очень точно измельчать как свежие, так и залитые образцы, с непрерывным водяным охлаждением, обеспечиваемым замкнутой системой рециркуляции, чтобы избежать тепловых изменений, которые могут вызвать артефакты или ожоги от трения.Обеспечение идеального «затвердевания» ММА является обязательным для успешного выполнения последующих шагов; если MMA все еще мягкий, результаты резки практически невозможно получить с точностью, и результат в виде матовой поверхности блока, который, как ожидается, будет прозрачным и прозрачным, может произойти после контакта с водой. Чтобы сократить время резания и сохранить целостность образцов, система захвата может колебаться, а направление инструмента может быть изменено на обратное, а для регулировки скорости резания предусмотрен механизм подачи.Эти параметры особенно полезны при наличии очень твердых металлических материалов, подобных имплантату, для которых снижение скорости резания и колебания образца облегчают фазу резания, что затруднено из-за твердости образца и трения, которое образуется при контакте с лезвием. Срезы, полученные после разрезания, обычно могут иметь толщину 100 ± 10 мкм м, которую можно измерить с помощью метрического калибра для измерения толщины, вычтя толщину гистологического предметного стекла.Полученный срез должен быть приклеен к пластиковым предметным стеклам подходящего размера с помощью соответствующего цианоакрилатного клея, с особым вниманием, чтобы избежать образования пузырьков и обеспечить идеальную адгезию образца к предметному стеклу для получения плоской поверхности. Это упростит последующие этапы шлифовки и полировки, а также обеспечит чистое поле для наблюдения под микроскопом, а также повысит качество гистологической подготовки. После завершения адгезии, примерно через 60 минут, разрезы истончаются абразивной системой с использованием абразивной бумаги с различным зерном, от 300 до 4000 (от более до менее абразивной поверхности), с шагом примерно 15 минут каждый, до толщины. 25 ± 10 мкм м.Этот этап особенно сложен, потому что чрезмерное истирание может привести к ослаблению всего или части образца, особенно если поверхность образца, полученного после резки, не полностью одинакова или в присутствии металлических материалов, которые истончаются медленнее, чем окружающие. кость. Кроме того, эта процедура может вызвать образование линий на поверхности залитых образцов, особенно когда используется наиболее абразивная бумага для более толстых образцов с очень твердыми имплантатами.Поэтому поверхность образца сглаживается полировальной системой с использованием бархатистых салфеток, иногда в сочетании с алмазной пастой или раствором оксида алюминия, рекомендованных для поверхностей, трудно полируемых и подверженных воздействию керамических и ферритовых материалов [5–7].

2.4. Окрашивание

В общем, методы окрашивания залитых пластиком тканей требуют модификаций, потому что эти процедуры обычно выполняются без удаления пластика, и поэтому используются разные временные режимы. Однако для кости, залитой ММА, могут быть выбраны различные протоколы окрашивания, и на выбор может повлиять вид оценки, которую необходимо выполнить.Процедуры окрашивания, которые обычно используются в нашей лаборатории, отражают попытку первичной оценки остеоинтеграции или остеоиндукции материала. Для обнаружения отложений кальция обычно предпочтительны окрашивание как по фон Коссе, так и по ализариновому красному. Трихром Гольднера, использующий также гематоксилин, может лучше идентифицировать клеточные компоненты и отличать новообразованный костный матрикс (красный) от зрелого (зеленый) и кальцинированного хряща. Окрашивание по Ван-Гизону позволяет нам обнаруживать ядра, окрашенные в черный цвет, и различать остеоид и коллаген (красный цвет), а также кость и мышцы зеленым цветом, и может успешно применяться для оценки границы раздела кость-имплантат, а окрашивание синим цветом Стивенеля позволяет нам для оценки наличия фиброзной ткани.Возможно, одним из наиболее часто используемых красителей остается Safranin O / Fast green, который позволяет окрашивать хрящи в красный цвет, а кости — в зеленый. Комбинация Fast Green с толуидиновым синим позволяет нам обнаруживать ядра темно-синего цвета и отличать старую кость от недавно сформированной кости благодаря интенсивности Fast Green. Фактически, окрашивание позволяет оценить хроматическую разницу между ранее существовавшей костью, зеленая окраска которой более мягкая, и вновь сформированной костью, которая более блестящая. Такое хроматическое различие хорошо представлено на рисунке 1 (а), на котором костный рост вокруг металлического имплантата и в контакте с ним окрашен более интенсивно, чем ранее существовавшая кость.

3. Результаты
3.1. Гистологические результаты медицинских устройств с костной имплантацией

Качество окончательного гистологического препарата зависит от правильного выполнения всех процедур, описанных выше. Гистологическая оценка и характеристика медицинских устройств с костной имплантацией обычно проводится с помощью световой микроскопии. Тем не менее, также можно использовать цифровой сканер слайдов патологии, быстрый сканер с высоким разрешением, способный преобразовывать стеклянные слайды с патологией в цифровые слайды за несколько минут, получая за одно получение изображения, которое можно наблюдать при различных реальных оптических увеличениях. .Поскольку это цифровой метод с очень строгими параметрами сбора данных, который оператор может изменять лишь частично, распознавание, правильная фокусировка и сбор образца зависят от качества гистологического препарата, особенно с точки зрения толщины среза и эффективного окрашивания.

Параметры биологической реакции, которые можно оценить, также в соответствии с ISO 10993-6: 2016- «Биологическая оценка медицинских устройств» — часть 6 : Тесты на локальные эффекты после имплантации , многочисленны.Чаще всего используются изменения морфологии тканей, наличие фиброза и воспалительных клеток, наличие некроза, васкуляризация, жировая инфильтрация, реакция на инородное тело, минерализация, формирование кости, созревание и плотность, фрагментация материалов, качество кости и врастание кости. Кроме того, критический интерес представляет граница раздела между тканью и материалами. Фактически, очень важно оценить область контакта с костью рядом с имплантатом (остеоинтеграцию), а также наличие промежуточных некальцинированных тканей.Очевидно, что следует также регистрировать наличие резорбции кости или образования новой кости. Ниже приведены некоторые примеры гистологической оценки медицинских устройств с костной имплантацией.

На рисунках 1 (а) и 1 (b) показаны гистологические изображения шероховатого титанового сплава (рисунок 1 (а)) и титанового имплантата с пескоструйной обработкой (рисунок 1 (b)), имплантированных в диафиз большеберцовой кости овцы. Микроскопический анализ через три и шесть месяцев после имплантации показал, что промежуток между существовавшей ранее кортикальной костью и имплантатом заполнен вновь сформированной пластинчатой ​​костью, и для обоих имплантатов наблюдается прямой контакт кости с имплантатом.Однако в той же области рисунка 1 (b) при более высоком увеличении новообразованная кость казалась отделенной от имплантата тонким слоем соединительной ткани. Остеоинтеграция per se не связана с какими-либо конкретными характеристиками поверхности, потому что большое количество различных поверхностей достигают клинической остеоинтеграции. Однако более сильные или слабые реакции костей могут быть связаны с характеристиками поверхности. Тем не менее, важно подчеркнуть, что изображения с большим увеличением позволили нам не обнаружить никаких признаков инфекции (полиморфноядерные клетки, лимфоциты, макрофаги и многоядерные клетки), неправильного положения имплантата или расшатывания имплантата (Рисунок 1 (b)).Другой пример показан на рисунке 1 (c), на котором представлено гистологическое изображение титанового винта, имплантированного в мыщелок бедренной кости барана. Гистологический анализ через три месяца после имплантации показал полную и хорошую остеоинтеграцию имплантата, а также наличие новообразованной губчатой ​​кости и активной остеоидной ткани (некальцинированные ткани), строго связанной с поверхностью имплантата. Новая кость состояла в основном из тканой кости с наибольшей плотностью в области, близкой к естественной кости. Тканую кость часто рассматривают как примитивный тип костной ткани, для которой характерны хаотическая, похожая на войлок ориентация коллагеновых фибрилл, многочисленные остеоциты неправильной формы и, вначале, относительно низкая минеральная плотность [8–10].Другой пример показан на рисунке 2, где гистологически оценивали весь позвонок овцы, чтобы оценить влияние процедуры введения двух электродов на жизнеспособность костной ткани. При большем увеличении можно увидеть присутствие новообразованной кости во всей губчатой ​​кости вокруг электродов, тем самым подчеркивая, что процедура введения не влияет на жизнеспособность костной ткани. Фактически, ранее существовавшие трабекулы между электродами были покрыты остеобластами (OB) с очевидно равномерно распределенными остеоцитами [11].Титановый имплантат, покрытый гидроксиапатитом (рис. 3), был имплантирован в мыщелок бедренной кости кролика. Титановый имплантат, покрытый гидроксиапатитом, показал отличную интеграцию имплантата с недавно сформированной губчатой ​​костью, покрытой OB и остеоидной тканью (рис. 3).

Другой превосходный пример использования ММА представлен на рисунке 4, биологическое повреждение титанового винта, покрытого гидроксиапатитом шейки бедренной кости человека. Был проведен гистологический анализ перипротезных тканевых реакций, включая некроз, инфильтрацию лимфоцитов, гистиоцитоз и интрацитоплазматический металлический дебрис.Кроме того, также регистрировалась оценка области контакта с костью рядом с имплантатом и наличие промежуточных некальцинированных тканей, а также наличие резорбции кости или образования новой кости. Гистологические исследования таких устройств позволили нам лучше понять характеристики качества кости и ее микроархитектуру даже после их имплантации. Эти аспекты имеют большое значение для разработки и совершенствования медицинских устройств будущего.

3.2. Результаты гистоморфометрии медицинских устройств с костной имплантацией

Для оценки медицинских устройств с костной имплантацией необходимо использовать количественную гистоморфометрию в дополнение к качественному гистологическому анализу. . Гистоморфометрия определяется как методика количественного анализа поддающихся измерению гистологических параметров (таких как длина, расстояние, площадь, количество представляющих интерес компонентов и т. Д.).). Первая попытка унифицировать номенклатуру, относящуюся к гистоморфометрии кости, относится к 1980-м годам, когда был опубликован первый отчет по этой теме, чтобы обеспечить стандартизацию и сопоставить результаты различных исследований [12]. Обновленную стандартную номенклатуру, символы и единицы для гистоморфометрии кости можно найти в обзоре Dempster et al. который в 2013 г. опубликовал обновленный отчет Комитета по номенклатуре гистоморфометрии Американского общества исследований костей и минералов (ASBMR) [13].При гистоморфометрическом анализе медицинских устройств, имплантированных в кость, наиболее часто используемые полезные параметры представлены в таблице 1. Выбор гистоморфометрических параметров для измерения основан на биологических и механических характеристиках материалов, имплантированных в кость, и учитывает необходимость выделения если цель, для которой он был протестирован, обычно была достигнута оценка степени остеоинтеграции и остеокондуктивных / индуктивных свойств. Что касается гистологической оценки, первым шагом в приближении к гистоморфометрии кости для медицинских устройств с костной имплантацией является определение области интереса (ROI), выполнение измерений, обычно включающих место имплантата и / или периимплантную кость, и определение фиксированной области. расстояние от дефекта, созданного для вставки материала.Пример определения рамки измерения представлен на рисунке 5 (а), представляющем титановый винт с гидроксиапатитовым покрытием, имплантированный в позвоночную ножку овцы [8–10]. Красная рамка указывает область интереса, в которой выполняются измерения, и включает имплантат и периимплантатную кость. Иногда могут приниматься во внимание разные ROI для выполнения мер, постепенно удаляющихся от имплантата, как показано на рисунке 5 (b), на котором концентрические круги изображены вокруг круглого титанового имплантата, определяя такое же количество ROI для количественной оценки. рост кости вокруг материала в гребне подвздошной кости модели овцы [8–10].Как только ROI определен, он фиксируется для всех измеренных копий, отбрасывая любые образцы, в которых имплант не находится на месте или которые не были вырезаны в соответствии с правильной плоскостью разреза, чтобы минимизировать смещение в измерениях. Количественная оценка площади и длины кости и материалов лежит в основе многих других сложных оценок для оценки ключевых свойств исследуемых материалов. Выполнение таких мер требует использования сложного программного обеспечения для анализа изображений и специальных инструментов, основанных на обработке двоичных изображений, которые позволяют выполнять автоматические и полуавтоматические количественные оценки.При правильном применении этих инструментов эффективность гистологического окрашивания должна быть обязательной, учитывая, что, как показано на Рисунке 2 (b), различные особенности кости могут быть выделены более ярким или более мягким окрашиванием, которое, в свою очередь, может быть выделено и количественно оценивается процессом бинаризации. На рисунке 6 показан пример бинаризации изображения, в котором имплантат окрашен в красный цвет, а кость — в зеленый. Программа способна автоматически измерять бинаризованные поверхности, выделяя разные цвета, определяя как площадь, так и периметр.Эти количественные оценки могут быть выполнены либо для всей определенной области интереса, либо в определенных точках образца, как в случае измерения врастания кости, выполняемого на поверхности между двумя витками винта и линией, соединяющей верхнюю часть винта. катушки. На рисунке 5 (c) представлены мера врастания кости и соответствующая зеркальная площадь, в которой рост кости рассчитывается в пространстве между витками винта и в точной зеркальной области, что позволяет оценить остеоиндуктивные / остеокондуктивные свойства металлический имплант.На основе мер бинаризации можно рассчитать индекс сродства или контакт кости с имплантатом (BIC). Это классический параметр для оценки степени остеоинтеграции имплантата, измеряющий все точки контакта между материалом и костью, как показано на Рисунке 7, на котором отмеченные вручную поверхности контакта титанового имплантата у овцы эпифизы большеберцовой кости отмечены оранжевым цветом [8–10]. Программное обеспечение для анализа может рассчитывать и суммировать длины каждой линии. Одна из основных трудностей многих из этих оценок заключается в том, что вручную выполняемые настройки (например, после бинаризации, чтобы избежать ошибок, связанных со спецификой) или меры (как для меток BIC) необходимы, требуя от хорошо обученных операторов выполнения таких мер, которые в любом случае должны проводиться двойным слепым методом.

BS

Общая площадь материала мм 2 Общая площадь биоматериала


Общий периметр материала мм Площадь кости (B.Ar) мм 2 Измерение количества губчатой ​​кости
Общая площадь (T.Ar) мм 2 Измерение общего количества наблюдаемой кости
Объем кости / объем ткани (BV / TV) % Измерьте процентную долю губчатой ​​кости, включая минерализованную кость и остеоид
Периметр кости (B.Pm) мм Длина наблюдаемой поверхности кости
Поверхность кости / объем ткани (BS / TV) мм 2 / мм 3 Измерьте процент губчатой ​​поверхности кости
Толщина трабекул (Tb.Th) µ м Толщина трабекул, вычисленная по формуле Парфита
Трабекулярное число (Tb.N) мм −1 Количество трабекул на единицу поверхности
Трабекулярный отрыв (Tb.Sp) µ м Измерение расстояния между костными трабекулами
Индекс сродства или контакт кости с имплантатом (BIC) % Длина участков прямой остеоинтеграции без взаимного расположения фиброзных капсул
Врастание кости мм 2 Площадь кости между винтом и линией, соединяющей верх катушек / общая площадь ниже верха катушек
Площадь зеркала мм 2 Зеркальное изображение врастания кости
Толщина кортикального слоя (Ct.Th) µ м Толщина кортикального слоя
Скорость аппозиции минералов (MAR) µ м / день Средняя скорость, при которой отдельные линии остеоида минерализуются
BFR / 17 903 µ м 3 / µ м 2 / день Количество минерализованной кости, образовавшейся на единицу поверхности губчатой ​​кости в день


9MA4 Встраивание также позволяет гистоморфометрическую оценку динамики кости посредством визуализации флуоресцентных маркеров.В нашей лаборатории мы используем различные типы флуорохромов (тетрациклины, ксиленоловый оранжевый, кальцеиновый синий, ализарин красный), которые вводятся in vivo, в запланированные экспериментальные сроки и включаются в костный матрикс во время процесса формирования новой кости. Фигура 8 представляет собой получение флуоресценции области бедренной кости крысы после введения различных флуорохромов с течением времени. Костные трабекулы постепенно размечаются разными цветами, отмечая разные этапы ремоделирования кости.Наблюдение под микроскопом на соответствующих длинах волн для флуоресцентного излучения позволяет оценить статус минерализации и временные интервалы между процессами ремоделирования [14]. Обычно при наличии имплантата оцениваемый ROI находится на границе раздела между костью и имплантатом, чтобы оценить, стимулировало ли присутствие материалов регенерацию кости. Тетрациклины, несомненно, являются наиболее часто используемыми флуорохромами для динамической оценки. Его включение на границе кости и остеоида видно под флуоресцентным микроскопом в виде зеленой линии, которая становится двойной, если выполняется более одного введения.На рисунке 9 ализариновая красная маркировка бедренной кости крысы представлена ​​красным цветом. На изображениях хорошо видно двойное маркирование костных трабекул. Длина флуоресцентных линий и расстояние между ними являются измеряемыми параметрами, которые можно использовать для оценки метаболизма костной ткани [11, 15].


MAR (скорость внесения минералов) — это скорость, с которой OB создают матрицу, которая кальцинируется с постоянной скоростью и включает метки. Таким образом, он измеряет среднюю активность OB в секции.BFR (скорость образования кости) учитывает, какая часть поверхности кости активно минерализуется, что зависит от количества активных OB. Он умножает среднюю работу каждого OB на долю поверхности кости с активными OB. Оба эти параметра требуют ручного измерения флуоресцентных полос. В частности, мера расстояния между двумя полосами одной и той же трабекулы (красные линии), среднее значение которой комбинируется с количеством дней, прошедших между двумя введениями, длиной флуоресцентных полос (желтые линии) и периметр всей трабекулы показан на рисунке 10.


3.3. Результаты биомеханики

Биомеханические тесты — фундаментальный инструмент в оценке результатов биоматериалов / устройств, имплантированных в кость. Среди оценки остеоинтеграционного процесса с точки зрения образования новой кости и контакта кости с имплантатом оценка механической компетентности дает информацию о состоянии вновь сформированной кости и ее способности выдерживать нагрузку. Поскольку конечной целью является получение костной ткани, максимально близкой к здоровой нативной, очевидно, что механические испытания являются незаменимой оценкой регенерации ткани.Многие из этих тестов являются деструктивными и должны выполняться на свежих или замороженных тканях, что исключает возможность использования одних и тех же образцов для гистологического анализа, требуя де-факто использования огромного количества животных. Заливка ПММА позволяет нам проводить на одних и тех же образцах как гистологию, так и некоторые механические испытания, такие как микротвердость и наноиндентирование, принимая во внимание, в окончательной оценке, что заливка смолой увеличивает микротвердость на 30-40% [16]. Для обоих методов соблюдается процедура, аналогичная той, которая применяется при приготовлении гистологических препаратов, с уделением особого внимания этапу полировки, который должен быть особенно точным, чтобы избежать появления царапин на поверхности, которые могут повлиять на тест.Испытание на микротвердость — это метод измерения твердости материала в микроскопическом масштабе. Он используется для получения необходимых данных при измерении отдельных микроструктур в более крупной матрице или при испытании очень тонких материалов, подобных фольге, или при определении градиента твердости образца по поперечному сечению. Образцы должны помещаться в столик для образцов и располагаться перпендикулярно наконечнику индентора. Измеритель микротвердости должен быть изолирован от вибраций. Анализ микротвердости, основанный на измерении сопротивления кости проникновению небольшой алмазной пирамиды, дал точный и воспроизводимый показатель степени минерализации.Степень минерализации кости (DMB) не только влияет на механическое сопротивление кости [17], но также частично определяет минеральную плотность кости [18]. По сравнению с тестом на микротвердость, тест на наноиндентирование включает меньшие нагрузки и, таким образом, позволяет нам исследовать меньшую часть костной ткани, вплоть до размера отдельных трабекул. Типичными механическими параметрами, полученными в результате испытаний на наноиндентирование, являются приведенный модуль упругости ( E R ) и контактная твердость при вдавливании ( H, IT ).Примечательно, что модуль упругости и твердость хорошо коррелируют со степенью минерализации ткани [19–21].

4. Обсуждение

Рост индустрии медицинских устройств обеспечивает появление множества новых медицинских устройств, поверхностей, биоматериалов, каркасов и технологий для использования в ортопедии. Осведомленность о нормативно-правовой среде и необходимости тестирования безопасности, осуществимости и эффективности перед клиническим использованием имеет основополагающее значение для проведения биологической оценки этих материалов.В этом конкурсе доклиническая оценка является обязательной и требует дальнейшего базового понимания материаловедения и биоинженерии, чтобы облегчить интерпретацию сложных интерфейсных реакций между биоматериалами, клеточными и секреторными факторами и тканевыми реакциями, которые модулируют успех или неудачу медицинских устройств. Таким образом, гистологическое исследование является незаменимым условием для оценки безопасности и эффективности медицинских устройств с костной имплантацией.

С момента зарождения гистологии и создания методов сохранения, обработки и визуализации тканей основной целью дисциплины было найти лучший способ анализа биологических образцов, сохраняя, насколько это возможно, их структуру. не теряя при этом возможности оценки таких характеристик, как антигенность белка, механические свойства и т. д.Эта попытка всегда была особенно сложной для костной ткани из-за ее особой минерализованной структуры, которая дает уникальные характеристики твердости. Все более широкое использование биоматериалов в ортопедии при проведении хирургических операций по поводу травматических, дегенеративных, воспалительных и онкологических заболеваний увеличило сложность гистологической обработки, требуя принятия методов заделки, подходящих для разрезания без удаления имплантата, но все же это возможно. чтобы позволить биологическое исследование ткани.Гистологическая обработка предлагает широкий спектр вариантов с точки зрения техники вложения, позволяя выбрать наиболее подходящую для соотношения анализируемой ткани и результата для оценки.

Заливка парафином остается наиболее популярной техникой для гистологической оценки из-за ее относительной простоты и скорости выполнения, требующей очень ограниченного количества единиц оборудования. Однако костные ткани необходимо обрабатывать декальцинирующими растворами, чтобы удалить минерализованный компонент ткани и позволить фазу разрезания.Эта процедура очень сложна, поскольку точная оценка степени декальцификации, достигаемой образцом, является определяющим фактором между получением образца, который может быть оценен или нет. Чрезмерная декальцинация приведет к разрушению костной структуры, в то время как слишком мягкая декальцинация сделает образец твердым, вызывая образование артефактов на этапе резки. Небольшие размеры заливочной формы, которые соответствуют размерам режущего микротома, ограничивают применение этой техники очень маленькими образцами или их частью (например.г., биопсии). Единственный способ оценить реакцию костной ткани на материал — это механическое удаление имплантата и выполнение гистологической и гистоморфометрической оценки с учетом тени, оставленной удаленным имплантатом [22, 23]. Однако эта процедура возможна только с сыпучими материалами. Фактически, пористые материалы или материалы с особым дизайном, предназначенные для прорастания костной ткани, нельзя удалить без повреждения образцов и непоправимого ущерба для оценки.

Среди различных методов заливки, доступных для биологических образцов, высокотемпературный метод на основе ММА остается единственным, способным удовлетворить потребность во внедрении некальцифицированных образцов больших размеров без удаления имплантированного биоматериала и позволяя провести удовлетворительную биологическую оценку ткани. Хотя этот метод требует довольно длительного времени обработки и дорогостоящего и непростого в использовании оборудования для подготовки образцов, он все же предпочтительнее других растворов для заливки, которые ограничены очень маленькими образцами и могут потребовать удаления имплантата.Среди различных доступных смол низкотемпературный MMA, вероятно, является наиболее похожим по характеристикам на высокотемпературный MMA, с преимуществом получения более тонких секций. Однако этот метод включения разделяет с высокотемпературным MMA необходимость в специальном оборудовании и длительном времени обработки, но в отличие от высокотемпературного MMA, заливочные формы позволяют обрабатывать только очень маленькие образцы. Таким образом, при том же оборудовании и процедурах включение в высокотемпературный ММА позволяет работать с любыми типами образцов, как с точки зрения размера, так и с точки зрения типа имплантата.Хотя срезы, залитые ММА, могут подвергаться различным гистологическим и гистоморфометрическим исследованиям, иммуногистохимические анализы все еще остаются проблемой [24]. Фактически, хотя, в отличие от других смол, таких как GMA, MMA можно депластифицировать для проведения иммуногистохимических анализов [25], все согласны с тем, что высокие температуры, достигаемые во время полимеризации MMA, вызывая образование реактивных радикалов, изменяют химическую структуру тканей и одновременно приводят к необратимой потере антигенности белков.Чтобы преодолеть эту ловушку, можно использовать низкотемпературную полимеризацию (от + 4 ° до -30 ° C) с использованием фотонов синего или ультрафиолетового света в качестве инициаторов для сохранения активности ферментов и антигенности белков. Однако эта процедура, очевидно, крайне непригодна, если образцы in vivo и были помечены флуорохромами для гистоморфометрических оценок флуоресценции. Хорошо известно, что наблюдение за флуоресцентными гистологическими образцами должно проводиться при минимальном освещении и в течение короткого времени, чтобы избежать затухания самого флуоресцентного излучения.Поэтому интуитивно понятно, что этот тип процедуры полимеризации может легко сделать недействительными оценки флуоресценции, когда это необходимо. Этот аспект оказывается особенно важным, учитывая, что, несмотря на невероятные достижения в области неразрушающих методов визуализации для визуализации и анализа образцов, таких как микропозитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ) и компьютерная томография (КТ), гистоморфометрические анализы до сих пор остаются незаменимым инструментом для оценки структурных изменений костной ткани.Тем не менее, гистологические образцы позволяют обнаруживать и оценивать такие биологические явления, как воспалительные реакции, некроз или кровоизлияние, изменения в морфологии клеток или наличие клеточного инфильтрата, которые не могут быть выявлены с помощью рентгенографических изображений. Кроме того, учитывая, что повышенная стоимость такого оборудования для визуализации животных (например, микро-КТ / ПЭТ) делает его непригодным для каких-либо лабораторий, использование статической гистоморфометрии остается необходимым для визуализации и измерения структуры кости и динамической гистоморфометрия остается эффективным методом оценки изменений кости с течением времени в отсутствие радиологического мониторинга.Таким образом, несмотря на некоторые ограничения, возможность, предоставляемая встраиванием MMA для объединения всестороннего обзора биологического образца и точного гистологического и гистоморфометрического анализа, делает этот метод по-прежнему лучшим выбором для оценки медицинских устройств, имплантированных в кости. Не менее важно то, что включение в этот тип смолы также позволяет проводить более сложные оценки, такие как твердость на макро- и наноуровнях [26–28]. Эти методы представляют особый интерес в ортопедии, поскольку они позволяют оценить, изменяет ли присутствие материала механические свойства окружающей кости, и определяют твердость вновь сформированной кости после имплантации остеоиндуктивного материала, что позволяет проводить еще более подробную и всестороннюю оценку состояния. медицинские изделия с костной имплантацией.Литература по использованию закладных секций весьма разнообразна и не очень обширна, а в некоторых случаях тип заливочной среды не указывается [29–31]. Исключая, очевидно, включение в парафин, который из-за природы среды включения и необходимости декальцинации не поддается таким испытаниям, для этой цели могут быть оценены различные твердые смолы, доступные для заливки. Однако необходимо учитывать некоторые технические аспекты; например, GMA мягче, чем MMA, и менее подходит для этапов полировки, необходимых перед испытаниями на микротвердость [32].В других случаях использование других смол (например, холодный монтаж Epofix3) требует дополнительных шагов перед проведением механических испытаний, таких как нанесение золотого покрытия [33].

Таким образом, несмотря на многие технологические достижения, микроскопические анализы остаются неотъемлемой частью исследования биомедицинских материалов и частью ухода за пациентами. Преимущества этого метода находят свое наибольшее воплощение в области ортопедических трансляционных исследований, например, проводимых в учреждениях, которые объединяют клиническую практику и экспериментальные исследования.Фактически, в этих контекстах тесное и постоянное сотрудничество между клиникой и исследователями подразумевает наличие клинических образцов, полученных в результате операции по артропластике или замены протезов в связи с ростовщичеством, биологической неудачей или опухолью. Среди диагностических аспектов, которые не рассматриваются в этой статье, возможность обработки и анализа образцов этого типа в полном объеме позволяет проводить тщательное и, по возможности, систематическое исследование с течением времени для дальнейшего понимания механизмов, лежащих в основе биологических реакций на имплантаты и оценить механические пределы и производительность.Информация, касающаяся степени остеоинтеграции, наличия побочных реакций, типа и степени, большего или меньшего роста кости, а также оценки качества кости, в том числе с точки зрения механической компетентности, имеют большое значение для выявление слабых и сильных сторон медицинских устройств, их оценка при их окончательном применении. Это может помочь в проектировании и разработке все более и более эффективных и долговечных устройств, чтобы свести к минимуму и избежать, насколько это возможно, необходимости удаления или замены и, следовательно, дальнейшего хирургического вмешательства, снижая не только бремя затрат для системы здравоохранения, но, прежде всего, дискомфорт для пациентов.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Работа поддержана грантами Ортопедического института Риццоли (Ricerca Corrente).

Гистологический метод 5. Окрашивание. Атлас гистологии растений и животных.

При световой микроскопии большинство тканей животных бесцветны, за исключением тех, которые содержат некоторые пигменты, такие как гемоглобин в крови или меланин в эпидермисе.Однако в тканях растений наблюдается более широкий спектр пигментов, что позволяет проводить некоторые исследования с помощью световой микроскопии. Клеточная стенка помогает различать клетки и структуры тканей растений. Когда были изобретены первые световые микроскопы, лабораторные исследователи должны были выяснить, как окрашивать ткани, чтобы наблюдать их морфологические особенности. Некоторые распространенные пигменты, такие как кармин и эозин, растворенные в воде, могут окрашивать некоторые тканевые структуры. Расширение тканевой промышленности в XIX веке и необходимость окрашивать одежду привели к быстрому развитию большого разнообразия красителей и пигментов.Многие из этих веществ использовались в качестве красителей в гистологии животных и растений с середины 19 века в наши дни. За это время гистологическое окрашивание стало свидетелем огромного развития новых методов и синтетических красителей, которые удовлетворяют большинство потребностей исследователей. Молекулярные биологи разработали новые методы маркировки клеток и тканей, такие как иммуноокрашивание с использованием антител или гибридизация in situ с использованием зондов, меченных ARN и ДНК. Существуют даже более сложные техники, такие как трансгенные животные с модифицированными генами, которые при экспрессии производят флуоресцентные белки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP), которые можно наблюдать с помощью флуоресцентных микроскопов.

На этих страницах мы будем иметь дело с основными и общими методами, используемыми в большинстве гистологических лабораторий, но мы не будем вдаваться в подробные протоколы более сложных методов. Мы делим общие хитологические техники на пять групп:

а) Общее окрашивание — это методы окрашивания, в которых используются окрашенные вещества или красители, которые связываются с тканевыми структурами за счет электрохимического сродства.

б) Гистохимия включает методы, включающие химическую модификацию некоторых молекул, уже присутствующих в тканях, которые позволяют связывать красители.В этот раздел также будут включены методы окрашивания, основанные на ферментативной активности тканевых ферментов.

в) Лектины, такие как селектины, представляют собой белки, несущие молекулярные домены, которые способны распознавать углеводы и углеводные связи. Распознавание настолько специфично, что лектины используются для идентификации углеводов, присутствующих в гликопротеинах клеточных мембран и внеклеточного матрикса, а также мукополисахаридов. Лектины распознают некоторые типы клеток и тканей и используются в качестве инструментов для изучения этих тканевых компонентов.

г) Иммуногистохимия — очень мощный метод, основанный на специфичности антител. Антитела образуются в результате иммунного ответа животного-хозяина после инъекции чужеродной молекулы, антигена. Очищенные антитела животного-хозяина используются для распознавания этой молекулы в срезах ткани.

д) Гибридизация in situ используется в гистологии для изучения экспрессии генов путем обнаружения информационной РНК (мРНК). Он основан на распознавании двух нуклеотидных одиночных цепей, имеющих комплементарные последовательности.Это признание известно как гибридизация. Одна из последовательностей называется зондом, который помечается маркером и используется для идентификации конкретной мРНК в срезе. Гибридизация in situ — это высокоспецифичный метод обнаружения, поскольку гибридизуются только комплементарные мРНК.

Американский журнал дерматопатологии

Что вы по профессии? Academic MedicineAcute Уход NursingAddiction MedicineAdministrationAdvanced Практика NursingAllergy и ImmunologyAllied здоровьеАльтернативная и комплементарной MedicineAnesthesiologyAnesthesiology NursingAudiology & Ear и HearingBasic ScienceCardiologyCardiothoracic SurgeryCardiovascular NursingCardiovascular SurgeryChild NeurologyChild PsychiatryChiropracticsClinical SciencesColorectal SurgeryCommunity HealthCritical CareCritical Уход NursingDentistryDermatologyEmergency MedicineEmergency NursingEndocrinologyEndoncrinologyForensic MedicineGastroenterologyGeneral SurgeryGeneticsGeriatricsGynecologic OncologyHand SurgeryHead & Neck SurgeryHematology / OncologyHospice & Паллиативная CareHospital MedicineInfectious DiseaseInfusion Сестринское делоВнутренняя / Общая медицинаВнутренняя / лечебная ординатураБиблиотечное обслуживание Материнское обслуживание ребенкаМедицинская онкологияМедицинские исследованияНеонатальный / перинатальный неонатальный / перинатальный уходНефрологияНеврологияНейрохирургияМедицинско-административное сестринское дело ecialtiesNursing-educationNutrition & DieteticsObstetrics & GynecologyObstetrics & Gynecology NursingOccupational & Environmental MedicineOncology NursingOncology SurgeryOphthalmology / OptometryOral и челюстно SurgeryOrthopedic NursingOrthopedics / Позвоночник / Спорт Медицина SurgeryOtolaryngologyPain MedicinePathologyPediatric SurgeryPediatricsPharmacologyPharmacyPhysical Медицина и RehabilitationPhysical Терапия и женщин Здоровье Физическое TherapyPlastic SurgeryPodiatary-generalPodiatry-generalPrimary Уход / Семейная медицина / Общие PracticePsychiatric Сестринское делоПсихиатрияПсихологияОбщественное здравоохранениеПульмонологияРадиационная онкология / ТерапияРадиологияРевматологияНавыки и процедурыСонотерапияСпорт и упражнения / Тренировки / ФитнесСпортивная медицинаХирургический уходПереходный уходТрансплантационная хирургияТерапия травмТравматическая хирургияУрологияЖенское здоровьеУход за ранамиДругое

Что ваша специальность? Addiction MedicineAllergy & Clinical ImmunologyAnesthesiologyAudiology & Speech-Language PathologyCardiologyCardiothoracic SurgeryCritical Уход MedicineDentistry, Oral Surgery & MedicineDermatologyDermatologic SurgeryEmergency MedicineEndocrinology & MetabolismFamily или General PracticeGastroenterology & HepatologyGenetic MedicineGeriatrics & GerontologyHematologyHospitalistImmunologyInfectious DiseasesInternal MedicineLegal / Forensic MedicineNephrologyNeurologyNeurosurgeryNursingNutrition & DieteticsObstetrics & GynecologyOncologyOphthalmologyOrthopedicsOtorhinolaryngologyPain ManagementPathologyPediatricsPlastic / Восстановительная SugeryPharmacology & PharmacyPhysiologyPsychiatryPsychologyPublic, Окружающая среда и гигиена трудаРадиология, ядерная медицина и медицинская визуализацияФизическая медицина и реабилитация Респираторная / легочная медицинаРевматологияСпортивная медицина / наукаХирургия (общая) Травматологическая хирургияТоксикологияТрансплантационная хирургияУрологияСосудистая хирургияВироло у меня нет медицинской специальности

Каковы ваши условия работы? Больница на 250 коекБольница на более 250 коекУправление престарелыми или хосписы Психиатрическое или реабилитационное учреждениеЧастная практикаГрупповая практикаКорпорация (фармацевтика, биотехнология, инженерия и т. Д.) Докторантура Университета или Медицинского факультета Магистратура или 4-летнего Академического Университета Общественный колледж Правительство Другое

границ | Оптимизация протокола для набора жизнеспособности бактерий LIVE / DEAD® BacLightTM для быстрого определения бактериальной нагрузки

Введение

Уровень устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) становится все более серьезным бременем для здоровья, особенно в отношении бактерий, вызывающих общие инфекции (ВОЗ, 2014, 2017).Ключевой стратегией решения проблемы УПП является улучшение инфекционного контроля, важным аспектом которого является быстрая и надежная диагностика.

Тест на чувствительность к противомикробным препаратам (AST) используется для определения чувствительности бактерий к потенциальному лечению антибиотиками (Jorgensen and Ferraro, 2009). Обычно используются методы, основанные на культуре, когда живые клетки растут на бактериологической среде, а мертвые — нет (Berney et al., 2007; Jorgensen and Ferraro, 2009). Методы, основанные на культуре, дают информацию только о жизнеспособных и культивируемых клетках и подвержены ошибкам из-за факторов, участвующих в росте бактерий на чашках с агаром (Davis, 2014).Кроме того, методы, основанные на культуре, являются медленными [обычно достигаются в течение двух-пяти дней (Lagier et al., 2015)], что может привести к назначению неподходящего антибиотика в клинических условиях из-за срочности лечения (ВОЗ, 2014). Использование неправильного антибиотика приводит к неэффективности лечения, увеличению заболеваемости и смертности пациентов и может способствовать дальнейшему развитию УПП у бактерий (ВОЗ, 2014, 2017). Улучшенная, более быстрая диагностика, которая может помочь в выборе антибиотика, может обойти эту проблему.

К AST применялись методы быстрой амплификации нуклеиновых кислот и масс-спектрометрии (Lagier et al., 2015; Sparbier et al., 2016). Однако первые могут информировать только о наличии устойчивости у ограниченного числа видов бактерий (Sparbier et al., 2016), а вторые — о том, какие лекарства не подходят для использования, не предоставляя при этом никаких указаний по выбору эффективного антибиотика для лечения. (ван Белкум и др., 2017). Таким образом, несмотря на развитие новых методов, все еще существует потребность в более быстрых и информативных методах AST. Идеальный метод AST позволит быстро получить ответ с минимальными шагами обработки (Jorgensen and Ferraro, 2009).В дополнение к улучшенному уходу за пациентом, быстрое AST снизит затраты за счет сокращения дополнительных лабораторных тестов, инвазивных процедур и продолжительности госпитализации (Doern et al., 1994; Barenfanger et al., 1999).

Альтернативой обнаружению на основе культуры является оценка других показателей жизнеспособности клеток с использованием флуоресцентных красителей, включая мембранный потенциал и целостность мембраны (Berney et al., 2007; Stiefel et al., 2015). LIVE / DEAD ® BacLight TM Bacterial Viability Kit (BacLight Kit) дифференцирует живые и мертвые клетки с использованием целостности мембраны в качестве показателя жизнеспособности клеток и основан на процедуре двойного окрашивания с использованием SYTO 9 и йодида пропидия (PI) ( Berney et al., 2007; Stiefel et al., 2015). Максимумы возбуждения / испускания этих красителей составляют ~ 480/500 нм для SYTO 9 и ~ 490/635 нм для PI (Invitrogen, 2004). Оба красителя интеркалируют нуклеиновыми кислотами, что приводит к усилению флуоресцентного сигнала; однако они различаются по свойствам проницаемости мембран (Freire et al., 2015; Stiefel et al., 2015). SYTO 9 может пересекать все мембраны бактериальных клеток, облегчая подсчет целых клеток при использовании отдельно, в то время как PI может проникать только в клетки с поврежденными мембранами, позволяя дифференцировать живые и мертвые клетки на основе относительной зеленой и красной флуоресценции от окрашивания SYTO 9 и PI (Berney et al. ., 2007; Freire et al., 2015; Stiefel et al., 2015). Предыдущая работа продемонстрировала, что окрашивание SYTO 9 и PI суспензий живых и мертвых клеток Escherichia coli может дать надежный абсолютный подсчет клеток (до 2,5% живых и 20% мертвых) при использовании проточного цитометра и эталонных шариков (Ou et al. др., 2017).

Измерения флуоресценции обычно проводятся с использованием микроскопа, флуориметра или проточного цитометра (Ambriz-Aviña et al., 2014). Флуорометры и проточные цитометры, включая топовые модели, имеют ограниченное спектральное разрешение, в то время как Optrode позволяет быстро собирать спектры высокого разрешения.Дополнительная информация, доступная в спектрах высокого разрешения, позволяет обнаруживать незначительные различия в спектрах и позволяет проводить более точный спектральный анализ. В настоящее время абсолютное количественное определение живых и мертвых клеток в образце может быть эффективно выполнено только с помощью проточной цитометрии (McClain et al., 2001). Недостатками использования проточных цитометров являются стоимость и портативность (Ambriz-Aviña et al., 2014). В последние годы были достигнуты успехи в портативности, такие как Accuri C6 от BD Biosciences; однако применимость проточных цитометров все еще ограничена стоимостью.Более дешевая альтернатива использованию проточного цитометра для количественного определения флуоресценции — это волоконная спектроскопическая система с временным разрешением, называемая Optrode, разработанная в Университете Окленда (Hewitt et al., 2012). Вкратце, оптрод работает, направляя лазер через волоконный зонд в образец, который, в свою очередь, собирает излучаемый от образца свет и направляет его на спектрометр (Vanholsbeeck et al., 2014). Спектрометр регистрирует сигнал флуоресценции и подключается к компьютеру для дальнейшего спектрального анализа (Vanholsbeeck et al., 2014). Обнаружение бактериальных клеток на основе флуоресценции было достигнуто с использованием Optrode для E. coli , окрашенного акридиновым оранжевым (Guo et al., 2017).

Определение жизнеспособности клеток с помощью набора BacLight Kit имеет несколько преимуществ по сравнению с подсчетом колоний на чашках с агаром. Окрашивание живых / мертвых происходит быстро, и гибель клеток для любого заданного процесса может быть определена количественно напрямую и почти в реальном времени, а не ретроспективно, исходя из количества введенных клеток и образовавшихся колоний (Berney et al., 2007; Stiefel et al., 2015). Этот метод позволяет обнаруживать состояния клеток, отличные от живых, как те, которые способны расти на чашке с агаром, и мертвые, как те, которые не могут расти, включая живые поврежденные клетки, которые не могут расти на чашках с агаром (Davis, 2014; Stiefel et al. ., 2015; Леонард и др., 2016). Придирчивый характер бактерий означает, что оценка жизнеспособности на основе культур может привести к недооценке жизнеспособных клеток, что может повлиять на потенциальные применения (Suller and Lloyd, 1999; Davis, 2014; Léonard et al., 2016). Наконец, живое / мертвое окрашивание позволяет визуализировать потерю целостности мембраны с течением времени (Nocker et al., 2017).

Применение набора BacLight Kit для оценки жизнеспособности бактерий хорошо изучено. Различные концентрации красителя, время инкубации красителя, штаммы бактерий, среды для роста и окрашивания, а также длины волн возбуждения и излучения были использованы со смешанными результатами (Prakash Singh, 2006; Berney et al., 2007; Hoerr et al., 2007; Kort et al., 2010; Thomas et al., 2011; Eberhart et al., 2012; Freire et al., 2015; Stiefel et al., 2015; Пак и Ким, 2018). Большинство исследований следовали инструкциям BacLight Kit — рост клеток в богатой среде и промывание в физиологическом растворе перед окрашиванием, создание суспензий живых и мертвых клеток для построения стандартной кривой и расчет соотношения красной и зеленой флуоресценции для определения доля живых клеток в образце (Prakash Singh, 2006; Hoerr et al., 2007; Eberhart et al., 2012; Freire et al., 2015; Stiefel et al., 2015; Park and Kim, 2018).Однако ни в одном из опубликованных исследований не был установлен анализ, в котором культуры выращивают и окрашивают в одних и тех же средах, и не было сделано никаких улучшений в отношении соотношения зеленой и красной флуоресценции. Кроме того, различия между окрашиванием каждым красителем отдельно и окрашиванием в комбинации не изучались, за исключением одного исследования (Armstrong and He, 2001). В нескольких исследованиях к AST применялись методы, основанные на флуоресценции; однако эти методы были сложными, в них использовался ряд красителей для оценки различных показателей жизнеспособности с многообещающими, но неоднозначными результатами (Walberg et al., 1996; Саллер и Ллойд, 1999; Gauthier et al., 2002). Следовательно, существует потенциал для применения и оптимизации использования BacLight Kit для AST.

В этой работе мы исследуем экспериментальные параметры с целью разработки улучшенного анализа AST для определения активности антибиотиков на E. coli MG1655 с использованием Optrode и BacLight Kit в качестве меры жизнеспособности клеток. Мы показываем, что BacLight Kit может использоваться для обнаружения живых и мертвых суспензий E. coli MG1655 как в физиологическом растворе, так и в среде с минимальными солями A с 0.2% глюкоза. Эти данные были использованы для оптимизации модели интенсивности флуоресценции SYTO 9 и PI относительно живой и мертвой популяции. Сравнение результатов в физиологическом растворе и минимальных средах позволило подтвердить использование последней среды для спектрометрии живых / мертвых с E. coli MG1655. Одним из заметных преимуществ использования минимальной среды является рост и окрашивание бактерий, встречающихся в одной и той же среде, что исключает необходимость мыть образцы. На нашей модели была продемонстрирована более сложная формула для расчета доли живых клеток в образце, скорректированное соотношение красителей, которое превосходит соотношение зеленой и красной флуоресценции, рекомендованное в инструкциях к набору BacLight.В ходе этой работы мы исследовали взаимодействие между SYTO 9 и PI и пришли к выводу, что взаимодействие изменяется от аддитивного до возбуждения PI с помощью SYTO 9 по мере увеличения концентрации мертвых клеток.

Материалы и методы

Бактериальный штамм

Escherichia coli K-12 штамм MG1655 (далее E. coli MG1655) был выбран для обнаружения живых / мертвых в этой работе, поскольку это хорошо охарактеризованный и широко используемый штамм (Sezonov et al., 2007). E. coli MG1655 выращивали при 37 ° C, при необходимости, при встряхивании при 200 об / мин.

Среды и химикаты

Реагенты для клеточной биологии были приобретены у Sigma-Aldrich. Общие реагенты и химические вещества включали хлорид натрия, триптический соевый бульон (TSB), агар и изопропанол. E. coli культивировали в TSB или в среде с минимальными солями A. Минимальная среда A использовалась для поддержки роста в минимальной среде, обеспечивающей только основные питательные вещества. Один литр 5-кратного минимального раствора А был приготовлен по следующему рецепту: 5 г (NH 4 ) 2 SO 4 ,22.5 г KH 2 PO 4 , 52,5 г K 2 HPO 4 , 2,5 г HOC (COONa) (CH 2 COONa) 2 ⋅2H 2 O (цитрат натрия 2H 2 О). После автоклавирования этот раствор разбавляли в 1 раз стерильной водой и следующими стерильными растворами на литр: 1 мл 1 M MgSO 4 7H 2 O и 10 мл 20% раствора глюкозы (вес / объем). Набор для определения жизнеспособности бактерий LIVE / DEAD ® BacLight TM (L7012) был приобретен у Invitrogen.

Подготовка живых и мертвых

E. coli Культуры

живых и мертвых культур E. coli готовили в соответствии с инструкциями, данными с набором BacLight (Invitrogen, 2004). Для экспериментов, проводимых в физиологическом растворе, были предприняты следующие шаги: мутная ночная культура E. coli в TSB была субкультивирована при разведении 1:20 в свежем TSB и выращивалась в течение примерно 30 минут до OD 600 , равного 0,4–0,6. был достигнут. Субкультивированные клетки собирали центрифугированием при 7000 × g в течение 7 минут при комнатной температуре и концентрировали в 10 раз в 0.85% (мас. / Об.) Физиологический раствор. Для живых клеток субкультуру разводили в 10 раз физиологическим раствором. Для мертвых клеток субкультуру разводили в 10 раз 70% изопропанолом. Суспензии живых и мертвых клеток инкубировали при 28 ° C со встряхиванием 200 об / мин в течение 15 мин. Живые и мертвые клетки собирали центрифугированием при 7000 × g в течение 7 минут при комнатной температуре, и осадки ресуспендировали в физиологическом растворе примерно при 1 × 10 8 КОЕ / мл (OD 600 0,255). Живые клетки были ретроспективно подсчитаны с использованием метода распределения на чашках.Количество мертвых клеток было получено из подсчета живых клеток на планшете. Для подтверждения гибели клеток использовали чашки для распределения суспензии мертвых клеток. В экспериментах, проводимых в минимальных средах, использовался тот же протокол, за исключением того, что субкультура выращивалась в течение 3,5 часов, что отражает более медленную скорость роста в минимальных средах. Для экспериментов по оптимизации протокола 1 × 10 8 КОЕ / мл живых и мертвых суспензий E. coli были смешаны для создания суспензий, содержащих 0, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 75, 90, 95 , 97.5, 99 и 100% живые (в пределах ∼1 × 10 6 — 1 × 10 8 КОЕ / мл). Для экспериментов, направленных на изучение взаимодействий красителей, были приготовлены суспензии при 0, 25, 50, 75 и 100% живом состоянии.

Окрашивание образцов с помощью SYTO 9 и PI

Рабочие растворы SYTO 9 и PI были приготовлены в 0,85% физиологическом растворе в янтарных микроцентрифужных пробирках (SSIbio) при 33,4 и 400 мкМ соответственно и хранили на льду. Окрашенные образцы устанавливали путем добавления 50 мкл рабочего раствора SYTO 9, 50 мкл рабочего раствора PI и / или 0.85% физиологический раствор (для общего объема 100 мкл) на 0,9 мл культуры в желтой пробирке. Конечные концентрации SYTO 9 и PI составляли 1,67 и 20 мкМ. Для экспериментов по оптимизации в минимальной среде каждую суспензию живых и мертвых клеток окрашивали SYTO 9, PI и SYTO 9 с PI. Для экспериментов по оптимизации в физиологическом растворе и исследования взаимодействия красителей каждую суспензию живых и мертвых клеток окрашивали только PI и SYTO 9 с помощью PI. Образцы перемешивали на вихревой платформе в течение 15 мин.

Лечение

E.coli с SYTO 9 и PI для определения влияния на жизнеспособность

Субкультуру 1 × 10 8 КОЕ / мл готовили, как указано выше, и помещали аликвоты в четыре пробирки — для обработки SYTO 9, обработки PI, обработки SYTO 9 и PI, а также необработанного контроля. Образцы инкубировали при 37 ° C со встряхиванием 200 об / мин. В каждую временную точку — 0,25, 0,5, 2 и 5 часов — отбирали аликвоты из всех обработок для подсчета путем подсчета на планшете и интенсивности флуоресценции, измеренной на Optrode. Для обработанных образцов аликвоту 1 мл добавляли в желтую пробирку для измерений Optrode.Для необработанного контроля аликвоту 0,9 мл окрашивали SYTO 9, PI и SYTO 9 с PI, как описано выше.

Измерение флуоресценции образца с помощью Optrode

Флуорометр Optrode использовался для возбуждения образцов, а затем для сбора и измерения света, испускаемого в результате возбуждения. Измерения проводились с использованием скрипта непрерывных измерений, который синхронизирует лазер и спектрометр для непрерывного измерения времени интегрирования 20 мс в течение всего 10 с.Из каждой пробирки было проведено три измерения, и между измерениями зонд промыли 70% этанолом. Фоновые показания были взяты в трех экземплярах из неокрашенных сред, за исключением исследования флуоресценции ростовых сред, для которых неокрашенный физиологический раствор использовался для фоновых показаний. Мощность лазера, поддерживаемая на уровне 10 мВт, контролировалась во время измерения с помощью измерителя мощности и фотодиода для каждого эксперимента.

Обработка файлов данных Optrode

Сценарий на R использовался для обработки файлов данных (hdf5), сгенерированных измерениями Optrode (R Core Team, 2013).Этот сценарий суммирует первые три собранных спектра (эффективное время интегрирования 60 мс), нормализует сумму до 1 мс и 1 мВт, а затем вычитает средний спектр фона, нормализованный к тем же условиям. Пользователь может определить диапазоны длин волн для интегрирования и количество последовательных спектров, которые будут использоваться для анализа. Результатом является таблица данных, содержащая нормализованные интенсивности флуоресценции (выраженные в относительных единицах флуоресценции, RFU) для диапазонов длин волн для каждого выполненного измерения.

Для экспериментов по оптимизации были исследованы интенсивности флуоресценции в следующих спектральных диапазонах: 505–515 нм, 509–529 нм и 510–540 нм для излучения SYTO 9 и 600–610 нм, 609–629 нм и 620 нм. –650 нм для выбросов PI.В инструкциях к набору BacLight рекомендуется использовать 510–540 нм и 620–650 нм. Другие диапазоны интегрирования длин волн были выбраны на основе предыдущей работы, которая определила, что эти диапазоны имеют более характерные пики SYTO 9 и PI, чем диапазоны, указанные в инструкциях BacLight Kit (Ou et al., 2016). Для исследования взаимодействия красителей исследовали интенсивности флуоресценции измеренных образцов в диапазоне длин волн 600–610 нм.

Обработка биологических данных и статистический анализ

Интенсивность флуоресценции SYTO 9 и PI, полученная путем интегрирования в определенных диапазонах длин волн, может использоваться для определения доли живых клеток в образце, используя формулу, приведенную в инструкциях BacLight Kit, называемую соотношением набора, определенную в уравнении ( 1).

доля живых клеток∝ SYTO 9PI (1)

Где SYTO 9 и PI — интенсивности флуоресценции, интегрированные в определенном диапазоне длин волн для SYTO 9 и PI, соответственно.

Однако предыдущая работа над этим проектом показала, что зависимость между соотношением наборов и процентным содержанием живых бактерий не была линейной (Ou et al., 2016). Поэтому было разработано более сложное соотношение, названное скорректированным соотношением красителей, уравнение (2) (Ou et al., 2016).

% Живых клеток∝ (100 × SYTO 9PI) / (1 + SYTO 9PI) (2)

Для экспериментов по оптимизации использовались излучения SYTO 9 и PI в определенных диапазонах длин волн для построения графиков разброса интенсивности флуоресценции в зависимости от экспериментально определенного% живого для каждого условия окрашивания. Для исследования взаимодействия красителей интенсивность флуоресценции при 600–610 нм наносили на график против экспериментально определенного% живого. Для данных, полученных в результате экспериментов по оптимизации, долю живых клеток, полученную из формулы набора и скорректированного соотношения красителей, использовали для построения диаграммы разброса относительно экспериментально определенного процента живых клеток.

Каждый график разброса был проанализирован с использованием анализа линейной регрессии, который соответствует прямой линии для получения наиболее подходящего значения наклона и точки пересечения. Степень соответствия линии количественно определяется коэффициентом детерминации ( R 2 ), который представляет собой дробную часть от 0,0 до 1,0. Более высокие значения указывают на то, что модель лучше соответствует данным, т.е. чем ближе значение R 2 к 1, тем большая часть общей дисперсии Y объясняется моделью.Значение R 2 использовалось для информирования о том, какой диапазон длин волн соответствует наилучшему моделированию% живого изображения. Статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версии 7 (GraphPad Software, Inc.).

Для исследования влияния SYTO 9 и PI на жизнеспособность клеток с течением времени была определена значительная разница между условиями путем вычисления площади под кривой (AUC) для каждой обработки и сравнения значений AUC с использованием теста Краскела-Уоллиса с P -значение <0.05, что указывает на общую значительную разницу. Затем был использован тест Данна для множественного сравнения post hoc для поиска значительных различий между обработками со значением P <0,05, указывающим на значительную разницу.

Для исследования взаимодействия красителей значительную разницу между условиями определяли с помощью анализа ковариации (ANCOVA). ANCOVA сначала сравнивает наклон линий со значением P <0,05, указывающим на значительную разницу.Если значение P > 0,05, тогда ANCOVA сравнивает точки пересечения линий со значением P <0,05, что указывает на значительную разницу. Нормализованная абсолютная разница в интенсивности флуоресценции между E. coli , окрашенной только PI, и PI с SYTO 9 была рассчитана с использованием уравнения (3). Эти данные были проанализированы с использованием теста Краскела-Уоллиса со значением P <0,05, что указывает на общую значительную разницу. Затем использовали тест Данна для множественного сравнения post hoc для поиска значительных различий между интенсивностью флуоресценции каждой суспензии живых и мертвых клеток со значением P <0.05, что указывает на значительную разницу.

Нормализованная разница в красных выбросах = (SYTO 9 и PI-PI) / PI (3)

Где SYTO 9 и PI и PI — интенсивности красной флуоресценции, интегрированные при 600–610 нм только для SYTO 9 и PI и PI, соответственно.

Результаты

Расследование СМИ

Насыщенная среда (TSB) и минимальная среда (минимальное количество солей A с 0,2% глюкозы) сравнивали с физиологическим раствором, который не поддерживает рост, необходимый для AST.Сигналы флуоресценции SYTO 9 и PI в физиологическом растворе и минимальной среде были аналогичными, в то время как в TSB интенсивности были почти на два порядка сильнее (Рисунок 1). Rich media не подходит для протокола без промывки. Для дальнейшего тестирования была выбрана минимальная среда.

Рисунок 1. Флуоресценция питательной среды. TSB, минимальную среду солей A с 0,2% глюкозы (MM) и 0,85% физиологический раствор (контроль) окрашивали SYTO 9 или PI. Интенсивность флуоресценции была получена путем интегрирования спектров при 505–515 нм для излучений SYTO 9 (кружки) и 600–610 нм для излучений PI (квадраты) с представлением медианного значения трех измерений.

Оптимизация анализа данных

Были исследованы несколько параметров, помимо тех, что указаны в инструкциях BacLight Kit. Интеграция в диапазонах длин волн 505–515 нм и 600–610 нм для SYTO 9 и PI, соответственно, дала наиболее линейные результаты при сравнении интенсивности сигнала или соотношения красителей с долей живых клеток в суспензии E. coli , в минимальной среде и физиологическом растворе (Рисунки 2A – F). Для сравнения, более низкие значения R 2 были получены при 509–529 нм и 510–540 нм для SYTO 9 и 609–629 нм и 620–650 нм для PI (рисунки 2A, B).Аналогичным образом, более низкие значения R 2 были получены для 509–529 нм и 609–629 нм, а также 510–540 нм и 609–629 для доли живых клеток, рассчитанной из набора и скорректированного соотношения красителей (рисунки 2В, Г).

Рис. 2. Спектрометрия живых / мертвых на живых и мертвых суспензиях E. coli в минимальной среде и физиологическом растворе. Интенсивность SYTO 9 в минимальной среде (A) , интенсивность PI в минимальной среде (B) , доля живых клеток в минимальной среде, полученная из набора, соотношение (C) ,% живых клеток в минимальной среде, полученной из скорректированное соотношение красителя (D) , доля живых клеток в физиологическом растворе, полученная из набора, соотношение (E) и% живых клеток в физиологическом растворе, полученное из скорректированного соотношения красителей (F) для живых и мертвых E.coli , полученные путем интегрирования в трех различных диапазонах длин волн для каждого красителя. Значение R 2 было получено из анализа линейной регрессии данных для каждого диапазона длин волн. Представленные данные — это медиана с диапазоном от шести биологических повторов.

Возможность использования набора или скорректированного соотношения красителей для определения доли живых клеток в окрашенной культуре была исследована в минимальной среде и физиологическом растворе с использованием диапазонов длин волн 505–515 нм и 600–610 нм.В минимальной среде и физиологическом растворе меньшие полосы погрешностей и более высокое значение R 2 для скорректированного соотношения красителей по сравнению с соотношением в наборе поддерживали использование скорректированного соотношения красителей (Рисунки 2C – F). Связь между интенсивностью сигнала и скорректированным соотношением красителей была наиболее сильной при использовании минимальной среды (рисунки 2D, F). Эти результаты дополнительно подтверждают обнаружение живых и мертвых клеток с использованием SYTO 9 и PI в минимальной среде.

Предел обнаружения

В минимальных средах выбросы SYTO 9 и PI уменьшаются с увеличением% живого (рис. 3A, B).% Живого, рассчитанный на основе скорректированного соотношения красителей, уменьшается в соответствии с экспериментально определенным% живого до прежнего плато, составляющего ~ 5% живого (~ 5 × 10 6 КОЕ / мл) (Рисунок 3C). В физиологическом растворе процент живых организмов, рассчитанный на основе скорректированного соотношения красителей, уменьшается по мере того, как экспериментально определенный процент живых организмов уменьшается до ~ 25% живых организмов (~ 2,5 × 10 7 КОЕ / мл), после чего наступает плато (Рисунок 3D).

Рис. 3. Взаимосвязь между спектрометрией живых / мертвых клеток и количеством жизнеспособных клеток на планшете в минимальной среде и физиологическом растворе.Выбросы SYTO 9 в минимальных средах ( A ; кружки), выбросы PI в минимальных средах ( B ; треугольники), скорректированное соотношение красителей в минимальных средах ( C ; ромбы) и скорректированное соотношение красителей в физиологическом растворе ( D ; ромбы) по сравнению с подсчетом жизнеспособных клеток ( A – D ; квадраты) для живых и мертвых суспензий E. coli . Интенсивность флуоресценции получали путем интегрирования 505–515 нм и 600–610 нм. Представленные данные — это медиана с диапазоном от шести биологических повторов.

Влияние инкубации SYTO 9 и PI на

E. coli Жизнеспособность

Было исследовано влияние окрашивания образца в начале эксперимента с динамикой времени, что позволяет немедленно измерить флуоресценцию образца (Pore, 1994). После 5-часовой обработки инкубация с обоими красителями имеет наибольший ингибирующий эффект (примерно 0,5–1 log уменьшения) на количество клеток, за которым следует SYTO 9 (примерно 0,5 log), как определено подсчетом жизнеспособных пластинок (рис. 4A). Клетки E. coli , инкубированные с ИП, присутствовали в количестве жизнеспособных клеток, аналогичных количеству необработанных клеток (фиг. 4А).Более высокие интенсивности флуоресценции были зарегистрированы для клеток, инкубированных с SYTO 9 и PI индивидуально по сравнению с необработанными клетками (рис. 4B), что, возможно, указывает на снижение жизнеспособности, поскольку более высокие интенсивности флуоресценции были обнаружены для клеток, убитых изопропанолом, по сравнению с необработанными клетками (рис. 3A, B). . Скорректированное соотношение красителей в образцах, инкубированных с обоими красителями, было ниже, чем в необработанном контроле (фиг. 4C), что позволяет предположить, что инкубация с красителями снижает жизнеспособность клеток (фиг. 4A).

Рисунок 4. Влияние окрашивания живых / мертвых на жизнеспособность E. coli . Клетки E. coli в минимальной среде окрашивали SYTO 9 и PI по отдельности и в комбинации с течением времени. Необработанные клетки окрашивали в каждый момент времени. В моменты времени 0,25, 0,5, 2 и 5 ч отбирали аликвоты для определения жизнеспособности клеток путем подсчета жизнеспособных клеток на планшете (A) и путем измерения флуоресценции окрашенных культур (B, C) . Интенсивность флуоресценции получали путем интегрирования 505–515 нм (кружки) и 600–610 нм (треугольники).Скорректированное соотношение красителей (квадраты) использовали для определения% живого. Представленные данные — это медиана с диапазоном от трех биологических повторов.

Исследование взаимодействия красителей

Интенсивность флуоресценции (600-610 нм) из E. coli , окрашенных SYTO 9 и PI, больше, чем только PI; присутствие SYTO 9 может опосредовать увеличение красных выбросов (рис. 5). Повышенное красное излучение может быть связано с перекрытием спектров или перекрестными помехами или может указывать на то, что излучение SYTO 9 возбуждает PI (Stiefel et al., 2015). Перекрестные помехи возникают, когда излучение одного красителя перекрывает диапазон длин волн излучения второго красителя (Armstrong and He, 2001; Stiefel et al., 2015). SYTO 9 излучает флуоресценцию до ∼650 нм (Armstrong and He, 2001) и, следовательно, может вносить вклад в излучение в диапазоне 600–610 нм, что обычно приписывается только PI. Излучение SYTO 9 может возбуждать PI, поскольку спектр излучения SYTO 9 перекрывается со спектром возбуждения PI (Stocks, 2004), что приводит к гашению зеленого (505–515 нм) излучения и усилению красного (600–610 нм). ) выбросы.

Рисунок 5. Взаимодействие между SYTO 9 и PI. (A) Интенсивности флуоресценции при 600-610 нм от живых и мертвых суспензий E. coli в минимальной среде, окрашенной только PI (кружки) и PI с SYTO 9 (квадраты). Линия наилучшего соответствия для каждого условия окрашивания была построена с использованием линейного регрессионного анализа, а значительная разница между условиями была определена с использованием ANCOVA. Наклоны линий существенно различались ( P -значение: <0.05). Представленные данные - это медиана с диапазоном от трех биологических повторов. (B) Абсолютная разница в интенсивности флуоресценции между E. coli , окрашенной только PI, и PI с SYTO 9, нормированной только на PI. Статистическая значимость представлена ​​ * (критерий Краскела-Уоллиса, P -значение: <0,05, множественное сравнение Данна post hoc ). Представленные данные взяты из трех биологических повторов со средней линией.

Сравнивали выбросы красного от клеток, окрашенных только PI и обоими красителями.Интенсивность флуоресценции PI была значительно выше в присутствии SYTO 9 (рис. 5A; линейный регрессионный анализ; наклоны разные; значение P- : <0,05). Была рассчитана абсолютная разница в интенсивности, нормализованная к интенсивности только ИП (рис. 5В). Разница в интенсивности ИП увеличивалась с увеличением концентрации мертвых клеток. Разница между 0 и 100% живыми была статистически значимой (тест Краскела-Уоллиса, P — значение: <0,05, множественное сравнение Данна апостериорный тест ).

Взаимодействие красителя между SYTO 9 и PI было исследовано в суспензиях ряда соотношений живые и мертвые окрашенные клетки E. coli по спектрам флуоресценции 450–750 нм (рис. 6). Эмиссия SYTO 9 намного больше, чем эмиссия PI, особенно для суспензий с высокой концентрацией мертвых клеток. Для 0–75% суспензий живых клеток интенсивность излучения при 600–610 нм от SYTO 9 больше, чем от SYTO 9 с PI, в то время как противоположное верно для PI (рис. 6), что подтверждает утверждение о том, что красители взаимодействуют, приводя к Гашение сигнала SYTO 9 и усиление сигнала PI.Однако для 90–100% суспензий живых клеток выбросы SYTO 9 (600–610 нм) меньше, чем для SYTO 9 с PI (рис. 6), что позволяет предположить, что для окрашенных SYTO 9 и PI клеток сигнал на этой длине волны Диапазон объясняется перекрытием выбросов SYTO 9 в сочетании с выбросами несвязанного красителя PI. Порог концентрации мертвых клеток существует между 75 и 90% суспензий живых клеток, который, как мы предполагаем, отмечает точку, где существует достаточно высокая концентрация мертвых клеток для облегчения связывания обоих красителей с ДНК и последующего взаимодействия тушения / усиления.

Рис. 6. Спектры окрашенных SYTO 9 и PI живых и мертвых суспензий E. coli . Спектры флуоресценции окрашенных SYTO 9 (светло-серый), PI (темно-серый) и SYTO 9 и PI (черный) суспензий живых и мертвых E. coli в минимальной среде. Суспензии выражены в% живых с 100% (A) , 90% (B) , 75% (C) , 50% (D) , 25% (E) , 10% (F) и 0% (G) .Вертикальные линии указывают выбранные диапазоны интегрирования длин волн: 505–515 нм для излучений SYTO 9 и излучений PI 600–610 нм. Оси графиков выбраны, чтобы выделить взаимодействие красителей в красном диапазоне излучения. Представленные данные являются средними для шести биологических повторов.

Обсуждение

Мы адаптировали протокол, описанный в инструкциях BacLight Kit, для применения спектрометрии живых / мертвых клеток к популяциям E. coli , содержащим живые и мертвые клетки.Оптимизированный протокол может быть потенциально применен к AST в качестве альтернативы методам, основанным на культуре. Сначала была выбрана соответствующая среда. В инструкциях к набору BacLight рекомендуется использовать богатую среду для выращивания тестируемых организмов и 0,85% физиологический раствор для окрашивания. Чтобы сократить количество этапов спектрометрии живых / мертвых бактерий, требуется единая среда, подходящая как для выращивания, так и для окрашивания бактерий. TSB, богатая среда, содержит компоненты, которые флуоресцируют после окрашивания SYTO 9 и PI, особенно для первого, в то время как минимальная среда дает такую ​​же интенсивность флуоресценции, как физиологический раствор (рис. 1).Интенсивность флуоресценции немытых образцов в среде с минимальным содержанием солей A может быть измерена, что предотвращает потерю биологической информации из образцов и снижает экспериментальную ошибку (Ou et al., 2017).

Большинство исследований, проведенных с использованием набора BacLight Kit, следуют (Eberhart et al., 2012; Kahlisch et al., 2012; Stiefel et al., 2015) инструкциям по окрашиванию, иногда с небольшими изменениями, включая окрашивание в буфере (Leuko et al., 2004; Jung et al., 2008; Freire et al., 2015) и воды (Hoefel et al., 2003) для определения жизнеспособности планктонных бактериальных клеток. Эти среды не поддерживают разумный рост бактерий и поэтому не подходят для AST. В одном исследовании была предпринята попытка преодолеть проблему необходимости промывать образцы бактерий, зараженных антимикробными препаратами, путем использования богатой среды для начального роста, а затем заражения E. coli в нефлуоресцентной среде, содержащей физиологический раствор и глюкозу (Anaya et al., 2016) . Однако используемые концентрации глюкозы (0,194-0,777 мМ) являются низкими по сравнению с минимальной средой солей А (11.1 мМ), и не будет поддерживать рост в достаточной степени для надежного AST (Anaya et al., 2016). Методология окрашивания, представленная в текущем отчете, заполняет пробел в литературе, относящейся к AST, с использованием основанных на флуоресценции показателей жизнеспособности клеток.

Мы определили оптимальные диапазоны интегрирования длин волн и формулу для расчета доли живых клеток (рис. 2). Экспериментальные параметры, указанные в протоколе BacLight Kit — окрашивание в физиологическом растворе, диапазоны интегрирования длин волн (510–540 нм и 620–650 нм) и соотношение набора — не соответствовали данным.Напротив, окрашивание в минимальной среде, диапазоны интеграции длин волн 505–515 нм и 600–610 нм и скорректированное соотношение красителей генерировали данные с улучшенной подгонкой. Наша адаптированная экспериментальная модель выращивания и окрашивания клеток E. coli MG1655 в минимальной среде позволяет адекватно определять долю живых клеток и является усовершенствованием инструкций BacLight Kit.

Лучшее соответствие, полученное в минимальной среде по сравнению с физиологическим раствором, может указывать на различия в окрашивании клеток.Для окрашенных SYTO 9 и PI живых суспензий от 100% до 0% эмиссия клеток при 505–515 нм составляла 1,8 × 10 3 –4,01 × 10 3 относительных единиц флуоресценции (RFU) и 2,11 × 10 4 — 9,28 × 10 3 RFU, в физиологическом растворе и минимальной среде, соответственно. Эмиссия клеток 600–610 нм составляла 2,68 × 10 3 –1,26 × 10 4 RFU и 5,36 × 10 3 –1,33 × 10 4 RFU в физиологическом растворе и минимальной среде, соответственно. Более высокие интенсивности флуоресценции демонстрируют, что E.coli в минимальной среде поглощали большее количество SYTO 9 и PI. Следовательно, окрашивание в минимальной среде имеет большую чувствительность к концентрации клеток, чем окрашивание в физиологическом растворе.

Улучшенное окрашивание клеток E. coli в минимальной среде может отражать более активное состояние. Ранее было замечено, что E. coli в логарифмической фазе имели более высокую интенсивность флуоресценции по сравнению со стационарной фазой при окрашивании SYBR зеленым и PI (Barbesti et al., 2000). Более активные клетки будут иметь более высокое содержание РНК, увеличивая количество сайтов связывания красителей, в то время как дефицит питательных веществ может вызвать изменения клеточной стенки, снижающие проницаемость красителя (Berney et al., 2007). Улучшение окрашивания в минимальной среде больше для 100% суспензий живых клеток (~ 1 log) по сравнению с 0% суспензий живых клеток (~ 0,5 log), что подтверждает утверждение, что усиление сигнала происходит из-за активных живых клеток.

Для спектрометрии «живой / мертвый» требуется калибровочная кривая для конкретных сред и штаммов (рис. 2C; Freire et al., 2015). Калибровочная кривая может информировать о пределе обнаружения (LoD) и может использоваться для подтверждения пригодности скорректированного соотношения красителей для расчета доли живых клеток в образце (Freire et al., 2015; Ou et al., 2017). Обнаружение живых клеток в суспензиях живых и мертвых клеток достигло плато при ~ 5% живых в минимальной среде (рис. 3C) и 25% живых в физиологическом растворе (рис. 3D). Более низкий LoD дополнительно подтверждает применение спектрометрии живых / мертвых к E. coli в минимальных средах. Предыдущая работа по изучению окрашивания живых / мертвых бактерий E. coli 25922 с использованием проточного цитометра продемонстрировала снижение LoD до 2,5% живых и 20% мертвых бактерий в живых и мертвых суспензиях (Ou et al., 2017). Никаких комментариев по поводу LoD мертвых клеток с использованием текущей оптимизированной методологии нельзя, поскольку подсчет по количеству мертвых клеток лишь косвенно информирует о подсчете мертвых клеток.Дальнейшие исследования позволят дополнительно охарактеризовать LoD с помощью проточного цитометра. Хотя LoD для живых клеток не распространяется на снижение количества жизнеспособных клеток на 99,9%, как требуется для определения бактерицидной активности, результаты демонстрируют возможность количественной оценки различий в жизнеспособности популяций E. coli с использованием оптимизированной методологии. . Дальнейшая работа будет сосредоточена на измерении спектров флуоресценции отдельных клеток, чтобы идентифицировать уникальные спектральные сигнатуры для состояний жизнеспособности и, таким образом, не ограничиваться текущим LoD.Измерения отдельных клеток могут быть выполнены с использованием микрожидкостных чипов — небольших платформ, способных разделять и концентрировать клетки для последующей визуализации (Kaminski et al., 2016). Микрофлюидика — это многообещающий следующий шаг, поскольку он связан с минимальным потреблением расходных материалов и бактериальных образцов, а также с более точным обращением с жидкостями (McClain et al., 2001; Kaminski et al., 2016; Lee et al., 2017).

Было исследовано окрашивание образца в нулевой момент времени, чтобы исключить необходимость 15-минутного периода окрашивания в каждый момент времени.Мы обнаружили ингибирующий эффект красителей, особенно SYTO 9 и PI вместе (рис. 4). Хотя различия не были статистически значимыми, тенденции информативны, поскольку все, что влияет на физиологию и рост клеток, может исказить результаты. Следовательно, для надежного тестирования живых / мертвых красители следует добавлять в аликвоты, взятые в каждый момент времени.

BacLight Kit предположил, что PI заменяет SYTO 9, что приводит к изменению цвета излучения клеток с поврежденными мембранами с зеленого на красный.Однако это происходит только при определенных относительных концентрациях красителя и нуклеиновых кислот (Stocks, 2004). В бесклеточной системе ДНК, окрашенной разными пропорциями PI и SYTO 9, PI необходим для насыщения нуклеиновой кислоты (> 0,4 ​​M PI на 1 M пары оснований ДНК) для того, чтобы произошло замещение (Stocks, 2004). Когда нуклеиновая кислота превышала PI, у обоих красителей оставалось место для связывания ДНК (Stocks, 2004). Окрашивание обоими красителями привело к гашению зеленого и усиленного красного излучения, что свидетельствует о взаимодействии красителей (Stocks, 2004).

Мы исследовали возникновение взаимодействия красителей. SYTO 9 увеличил выбросы PI для всех протестированных суспензий живых и мертвых клеток (рис. 5A). Нормализованная разница в интенсивности излучения при 600–610 нм между одним PI и PI с SYTO 9 (уравнение 3) показала, что ≥25% мертвых клеток необходимы для заметного усиления излучения PI с помощью SYTO 9 (рисунок 5B), что подтверждается спектры, представленные на фиг. 6. Это отражает большее количество взаимодействий, происходящих из-за более сильного окрашивания мертвых клеток SYTO 9 и PI (фиг. 3A, B) по сравнению с живыми клетками, что приводит к увеличению возможностей для взаимодействия.Считается, что мертвые клетки E. coli имеют повышенное окрашивание SYTO 9 по сравнению с живыми клетками, поскольку внутренняя и внешняя мембраны живых клеток не полностью проницаемы для SYTO 9 (Stiefel et al., 2015). Влияние взаимодействия красителя было значительным только для 0% против 100% живых (рис. 5B), то есть в мертвых клетках, где максимальное количество PI связано с ДНК и может взаимодействовать с SYTO 9. Влияние степени SYTO 9 и окрашивание PI при взаимодействии красителей дополнительно демонстрируется интенсивностью флуоресценции дважды окрашенных суспензий живых и мертвых клеток при 505–515 нм.Интенсивность флуоресценции от 100% до 0% живых суспензий варьировала от 2,11 × 10 4 –9,28 × 10 3 RFU в минимальной среде и 1,8 × 10 3 –4,01 × 10 3 RFU в физиологическом растворе. В минимальных средах уменьшение интенсивности флуоресценции по мере увеличения концентрации мертвых клеток предполагает, что эмиссия SYTO 9 подавляется одновременно с увеличением эмиссии PI. Напротив, в физиологическом растворе интенсивность флуоресценции увеличивается с концентрацией мертвых клеток, что может отражать более низкую степень окрашивания SYTO 9 и PI и, следовательно, меньшую степень взаимодействия красителя.

Мы наблюдали повышенную эмиссию 600-610 нм от клеток, окрашенных SYTO 9 и PI по сравнению с одним PI (рис. 5), что свидетельствует о взаимодействии красителя и предполагает, что PI не вытеснил весь SYTO 9. Эмиссия 505-515 нм от 0% живых суспензий E. coli , окрашенных SYTO 9 и PI, подтверждает этот вывод (рис. 6). Эмиссия при 600–610 нм от 100% живых клеток, окрашенных SYTO 9 или PI, была меньше, чем у клеток, окрашенных обоими красителями (рис. 6), что позволяет предположить, что тушение / усиление практически отсутствует.Увеличение выбросов 600–610 нм, вероятно, будет связано с выбросами SYTO 9 в сочетании с несвязанными выбросами PI (фон). Взаимодействие красителей изменяется от перекрестных помех к возбуждению PI с помощью SYTO 9 между 90% и 75% живых клеток, на что указывает относительная эмиссия 505–515 нм между SYTO 9 и SYTO 9 с PI (рис. 6). 75% суспензия живых клеток содержит достаточно высокую концентрацию мертвых клеток, чтобы позволить обоим красителям связываться и происходить взаимодействие. Зеленое и красное излучение происходят не только от живых и мертвых клеток соответственно, что необходимо учитывать при интерпретации результатов спектрометрии живых / мертвых клеток.Необходимы дальнейшие исследования, чтобы полностью понять влияние взаимодействия красителей в различных условиях.

Оптимизирован протокол подсчета живых / мертвых клеток на основе флуоресценции с атрибутами, подходящими для исследований AST. Измерения флуоресценции образцов, полученных в соответствии с оптимизированным протоколом, можно проводить с использованием любого оборудования, которое измеряет флуоресценцию, включая проточный цитометр, спектрофлуориметр, ридер для микропланшетов и Optrode. Преимущества оптимизированной методологии включают отсутствие необходимости промывать образцы перед окрашиванием для предотвращения потери биологической информации, использование нефлуоресцентной среды, которая поддерживает рост бактерий, необходимых для обнаружения действия антибиотика, более высокие уровни окрашивания E.coli и генерация живых / мертвых спектрометрических данных с лучшим соответствием, чем данные, полученные в соответствии с инструкциями набора. Недостатки этой методологии включают высокую LoD (∼5 × 10 6 КОЕ / мл) и взаимодействие красителей, на которое влияет количество мертвых клеток, что может быть проблематичным при тестировании образцов, зараженных антибиотиками, в которых количество мертвых клеток неизвестны.

Заключение

Набор LIVE / DEAD ® BacLight TM для определения бактериальной жизнеспособности может применяться к E.coli MG1655 в среде с минимальными солями А с 0,2% глюкозы для определения жизнеспособности образцов, которые не требовали промывки перед окрашиванием. Оптимальные диапазоны интегрирования длин волн для исследования флуоресцентного излучения SYTO 9 и PI составляют 505–515 нм и 600–610 нм, соответственно. Эти интегрированные площади пиков использовали в скорректированном соотношении красителей, которое лучше коррелировало с долей живых клеток, чем с соотношением в наборе. Взаимодействие с красителем происходит в клетках с поврежденными мембранами, окрашенными как SYTO 9, так и PI.

Авторские взносы

JR задумал, спроектировал и выполнил эксперименты, проанализировал данные, подготовил рисунки и / или таблицы, написал черновики рукописи и утвердил окончательный вариант. КМ предоставил компьютерный код для анализа данных, рассмотрел черновики рукописи и утвердил окончательный вариант. FV и SS участвовали в администрировании проекта, они консультировали по протоколу эксперимента и анализу результатов, рассматривали черновики рукописи и одобряли окончательный вариант.

Финансирование

JR благодарит Фонд развития исследований факультетов Оклендского университета (FRDF) (Быстрое тестирование на чувствительность к антибиотикам, 3714262) за финансирование постдокторской работы. Мы благодарны Министерству бизнеса, инноваций и занятости Новой Зеландии за финансирование проекта Food Safe; программа исследования бактериального подсчета (UOAX1411) в реальном времени.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Список литературы

Амбрис-Авинья, В., Контрерас-Гардуньо, Дж. А., и Педраса-Рейес, М. (2014). Применение проточной цитометрии для характеристики физиологических реакций бактерий. Biomed. Res. Int. 2014: 461941. DOI: 10.1155 / 2014/461941

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Анайя, Н. М., Соломон, Ф., Оянедель-Кравер, В. (2016). Влияние наночастиц оксида диспрозия на Escherichia coli . Environ.Sci. Нано 3, 67–73. DOI: 10.1039 / c5en00074b

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Армстронг, Д. У., и Хе, Л. (2001). Определение жизнеспособности клеток в отдельных или смешанных образцах с использованием капиллярного электрофореза, лазерно-индуцированных микрофлюидных флуоресцентных систем. Анал. Chem. 73, 4551–4557. DOI: 10.1021 / ac010449q

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Барбести С., Читтерио С., Лабра М., Барони М. Д., Нери М. Г. и Сгорбати С.(2000). Двух- и трехцветный флуоресцентный проточно-цитометрический анализ иммуноидентифицированных жизнеспособных бактерий. Цитометрия 40, 214–218. DOI: 10.1002 / 1097-0320 (20000701) 40: 3 <214 :: AID-CYTO6> 3.0.CO; 2-M

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Баренфангер Дж., Дрейк К. и Качич Г. (1999). Клинические и финансовые преимущества быстрой идентификации бактерий и определения чувствительности к противомикробным препаратам. J. Clin. Microbiol. 37, 1415–1418.

Google Scholar

Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H.-U. У., Эгли Т. (2007). Оценка и интерпретация жизнеспособности бактерий с помощью набора LIVE / DEAD BacLight в сочетании с проточной цитометрией. Заявл. Environ. Microbiol. 73, 3283–3290. DOI: 10.1128 / AEM.02750-06

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дэвис, К. (2014). Подсчет пробиотических штаммов: обзор культурально-зависимых и альтернативных методов количественного определения жизнеспособных бактерий. J. Microbiol. Методы 103, 9–17. DOI: 10.1016 / j.mimet.2014.04.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дерн, Г. В., Вотур, Р., Годе, М., и Леви, Б. (1994). Клиническое влияние быстрого тестирования чувствительности in vitro и идентификации бактерий. J. Clin. Microbiol. 32, 1757–1762.

Google Scholar

Эберхарт, Л. Дж., Дерингер, Дж. Р., Брайтон, К. А., Савант, А. А., Бессер, Т. Е., и Калл, Д. Р.(2012). Характеристика нового микроцина, убивающего энтерогеморрагический Escherichia coli O157: H7 и O26. Заявл. Environ. Microbiol. 78, 6592–6599. DOI: 10.1128 / AEM.01067-12

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фрейре, Дж. М., Гаспар, Д., де ла Торре, Б. Г., Вейга, А. С., Андреу, Д., и Кастаньо, М. А. (2015). Мониторинг антибактериальной проницаемости в реальном времени с помощью проточной цитометрии с временным разрешением. Biochim. Биофиз.Acta 1848, 554–560. DOI: 10.1016 / j.bbamem.2014.11.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Готье, К., Сен-Пьер, Ю., и Виллемур, Р. (2002). Экспресс-тестирование изолятов и образцов мочевых путей на чувствительность к противомикробным препаратам с помощью проточной цитометрии. J. Med. Microbiol. 51, 192–200. DOI: 10.1099 / 0022-1317-51-3-192

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Го Р., МакГоверин К., Свифт С. и Ванхолсбек Ф.(2017). Быстрая и недорогая оценка количества бактерий в растворе с помощью флуоресцентной спектроскопии. Анал. Биоанал. Chem. 409, 3959–3967. DOI: 10.1007 / s00216-017-0347-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hewitt, B.M., Singhal, N., Elliot, R.G., Chen, A.Y.H., Kuo, J.Y.C., Vanholsbeeck, F., et al. (2012). Новый метод оптоволоконного обнаружения для анализа in situ флуоресцентно меченных биосенсорных организмов. Environ. Sci. Technol. 46, 5414–5421. DOI: 10.1021 / es300164p

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хефель, Д., Грооби, В. Л., Монис, П. Т., Эндрюс, С., и Сент, К. П. (2003). Подсчет бактерий, передающихся через воду, с использованием тестов жизнеспособности и проточной цитометрии: сравнение с методами, основанными на культуре. J. Microbiol. Методы 55, 585–597. DOI: 10.1016 / S0167-7012 (03) 00201-X

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хёрр, В., Зибур, В., Козицкая, С., Кацович, Э., Хольцграбе, У. (2007). Лазерно-индуцированный флуоресцентный капиллярный электрофорез и измерение флуоресцентного микропланшета: два метода количественной оценки эффекта антибиотиков. Анал. Chem. 79, 7510–7518. DOI: 10.1021 / ac071117 +

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Йоргенсен, Дж. Х., Ферраро, М. Дж. (2009). Тестирование на чувствительность к противомикробным препаратам: обзор общих принципов и современной практики. Clin. Заразить. Дис. 49, 1749–1755. DOI: 10.1086 / 647952

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Юнг, В. К., Ку, Х. К., Ким, К. В., Шин, С., Ким, С. Х., и Пак, Ю. Х. (2008). Антибактериальная активность и механизм действия иона серебра в Staphylococcus aureus и Escherichia coli . Заявл. Environ. Microbiol. 74, 2171–2178. DOI: 10.1128 / AEM.02001-07

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Калиш, Л., Хенне, К., Грёбе, Л., Бреттар, И., и Хёфле, М. Г. (2012). Оценка жизнеспособности видов бактерий в питьевой воде с помощью комбинированных клеточных и молекулярных анализов. Microb. Ecol. 63, 383–397. DOI: 10.1007 / s00248-011-9918-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Камински Т.С., Шелер О., Гарстецки П. (2016). Капельная микрофлюидика для микробиологии: методы, приложения и проблемы. Lab. Чип 16, 2168–2187.DOI: 10.1039 / c6lc00367b

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Kort, R., Nocker, A., de Kat, Angelino-Bart, A., van Veen, S., Verheij, H., Schuren, F., et al. (2010). Обнаружение жизнеспособных микроорганизмов в режиме реального времени с помощью внутриклеточной фототаутомерии. BMC Biotechnol. 10:45. DOI: 10.1186 / 1472-6750-10-45

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лагье, Ж. К., Эдуард, С., Паньье, И., Медианников, О., Дранкур, М., и Рауль, Д. (2015). Текущие и прошлые стратегии бактериальной культуры в клинической микробиологии. Clin. Microbiol. Ред. 28, 208–236. DOI: 10.1128 / CMR.00110-14

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Lee, W.-B., Fu, C.-Y., Chang, W.-H., You, H.-L., Wang, C.-H., Lee, M.S., et al. (2017). Микрожидкостное устройство для определения чувствительности к противомикробным препаратам, основанное на методе разбавления бульона. Biosens. Биоэлектрон. 87, 669–678. DOI: 10.1016 / j.bios.2016.09.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Леонар Л., Чибане Л. Б., Бухедда Б. О., Дегрейв П. и Улахал Н. (2016). Последние достижения в области многопараметрической проточной цитометрии для характеристики противомикробного лечения. Фронт. Microbiol. 7: 1225. DOI: 10.3389 / fmicb.2016.01225

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лейко, С., Легат, А., Фендрихан, С., и Стэн-Лоттер, Х. (2004).Оценка набора LIVE / DEAD baclight для обнаружения экстремофильных архей и визуализации микроорганизмов в образцах с повышенной соленостью окружающей среды. Заявл. Environ. Microbiol. 70, 6884–6886. DOI: 10.1128 / AEM.70.11.6884

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Макклейн, М.А., Калбертсон, К.Т., Якобсон, С.С., и Рэмси, Дж. М. (2001). Проточная цитометрия Escherichia coli на микрофлюидных устройствах. Анал. Chem. 73, 5334–5338.DOI: 10.1021 / ac010504v

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Nocker, A., Cheswick, R., Dutheil de la Rochere, P. M., Denis, M., Léziart, T., and Jarvis, P. (2017). Когда бактерии мертвы? Шаг к интерпретации профилей проточной цитометрии после дезинфекции хлором и окрашивания целостности мембраны. Environ. Technol. 38, 891–900. DOI: 10.1080 / 09593330.2016.1262463

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Оу, Ф., Макговерин, К., Свифт, С., и Ванхолсбек, Ф. (2016). «Быстрая оценка жизнеспособности бактерий с помощью оптрода — портативного флуориметра, близкого к реальному времени», в материалах Труды Австралийской конференции по фотонике и волоконным технологиям, 2016 г. (ACOFT, BGPP, NP), , (Сидней: OSA). DOI: 10.1364 / ACOFT.2016.AW3C.6

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Парк, С. Ю., Ким, К. Г. (2018). Сравнительное исследование трех различных тестов на жизнеспособность химически или термически инактивированного Escherichia coli . Environ. Англ. Res. 23, 282–287. DOI: 10.4491 / eer.2017.223

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пор, Р. С. (1994). Определение чувствительности к антибиотикам методом проточной цитометрии. руб. Soc. Противомикробный. Chemother. 34, 613–627. DOI: 10.1093 / jac / 34.5.613

CrossRef Полный текст | Google Scholar

R Основная команда (2013). R: язык и среда для статистических вычислений. Вена: Фонд R для статистических вычислений.

Google Scholar

Штифель П., Шмидт-Эмрих С., Маниура-Вебер К. и Рен К. (2015). Критические аспекты использования тестов жизнеспособности бактериальных клеток с флуорофором SYTO9 и иодидом пропидия. BMC Microbiol. 15:36. DOI: 10.1186 / s12866-015-0376-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Саллер М. Т. и Ллойд Д. (1999). Флуоресцентный мониторинг бактериального повреждения, вызванного антибиотиками, с использованием проточной цитометрии. Цитометрия 35, 235–241. DOI: 10.1002 / (SICI) 1097-0320 (199) 35: 3 <235 :: AID-CYTO6> 3.0.CO; 2-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Thomas, R. J., Webber, D., Hopkins, R., Frost, A., Laws, T., Jayasekera, P. N., et al. (2011). Клеточная мембрана как основное место повреждения во время аэрозолизации Escherichia coli . Заявл. Environ. Microbiol. 77, 920–925. DOI: 10.1128 / AEM.01116-10

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

ван Белкум, А., Велкер, М., Пинкус, Д., Шарье, Ж.-П., и Жирар, В. (2017). Матричная лазерная десорбционная ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия в клинической микробиологии: каковы текущие проблемы? Ann. Лаборатория. Med. 37, 475–483. DOI: 10.3343 / alm.2017.37.6.475

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Vanholsbeeck, F., Swift, S., Cheng, M., and Bogomolny, E. (2014). «Почти в реальном времени, точный и чувствительный флуоресцентный мониторинг микробиологической безопасности», в протоколе Proceedings of the Advanced Photonics , (Сидней: OSA).DOI: 10.1364 / ДАТЧИКИ.2014.SeM4C.6

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уолберг, М., Гаустад, П. и Стин, Х. Б. (1996). Быстрая проточная цитометрическая оценка чувствительности бактерий к мециллинам и ампициллину. J. Antimicrob. Chemother. 37, 1063–1075. DOI: 10.1093 / jac / 37.6.1063

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

ВОЗ (2014). Устойчивость к противомикробным препаратам: Глобальный отчет о надзоре. Женева: ВОЗ.

Google Scholar

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *