Сложные техники окрашивания: Сложные техники окрашивания волос в Химках

3.3. Результаты биомеханики

Биомеханические тесты — фундаментальный инструмент в оценке результатов биоматериалов / устройств, имплантированных в кость. Среди оценки остеоинтеграционного процесса с точки зрения образования новой кости и контакта кости с имплантатом оценка механической компетентности дает информацию о состоянии вновь сформированной кости и ее способности выдерживать нагрузку. Поскольку конечной целью является получение костной ткани, максимально близкой к здоровой нативной, очевидно, что механические испытания являются незаменимой оценкой регенерации ткани.Многие из этих тестов являются деструктивными и должны выполняться на свежих или замороженных тканях, что исключает возможность использования одних и тех же образцов для гистологического анализа, требуя де-факто использования огромного количества животных. Заливка ПММА позволяет нам проводить на одних и тех же образцах как гистологию, так и некоторые механические испытания, такие как микротвердость и наноиндентирование, принимая во внимание, в окончательной оценке, что заливка смолой увеличивает микротвердость на 30-40% [16]. Для обоих методов соблюдается процедура, аналогичная той, которая применяется при приготовлении гистологических препаратов, с уделением особого внимания этапу полировки, который должен быть особенно точным, чтобы избежать появления царапин на поверхности, которые могут повлиять на тест.Испытание на микротвердость — это метод измерения твердости материала в микроскопическом масштабе. Он используется для получения необходимых данных при измерении отдельных микроструктур в более крупной матрице или при испытании очень тонких материалов, подобных фольге, или при определении градиента твердости образца по поперечному сечению. Образцы должны помещаться в столик для образцов и располагаться перпендикулярно наконечнику индентора. Измеритель микротвердости должен быть изолирован от вибраций. Анализ микротвердости, основанный на измерении сопротивления кости проникновению небольшой алмазной пирамиды, дал точный и воспроизводимый показатель степени минерализации.Степень минерализации кости (DMB) не только влияет на механическое сопротивление кости [17], но также частично определяет минеральную плотность кости [18]. По сравнению с тестом на микротвердость, тест на наноиндентирование включает меньшие нагрузки и, таким образом, позволяет нам исследовать меньшую часть костной ткани, вплоть до размера отдельных трабекул. Типичными механическими параметрами, полученными в результате испытаний на наноиндентирование, являются приведенный модуль упругости ( E _R ) и контактная твердость при вдавливании ( H, _IT ).Примечательно, что модуль упругости и твердость хорошо коррелируют со степенью минерализации ткани [19–21].

4. Обсуждение

Рост индустрии медицинских устройств обеспечивает появление множества новых медицинских устройств, поверхностей, биоматериалов, каркасов и технологий для использования в ортопедии. Осведомленность о нормативно-правовой среде и необходимости тестирования безопасности, осуществимости и эффективности перед клиническим использованием имеет основополагающее значение для проведения биологической оценки этих материалов.В этом конкурсе доклиническая оценка является обязательной и требует дальнейшего базового понимания материаловедения и биоинженерии, чтобы облегчить интерпретацию сложных интерфейсных реакций между биоматериалами, клеточными и секреторными факторами и тканевыми реакциями, которые модулируют успех или неудачу медицинских устройств. Таким образом, гистологическое исследование является незаменимым условием для оценки безопасности и эффективности медицинских устройств с костной имплантацией.

С момента зарождения гистологии и создания методов сохранения, обработки и визуализации тканей основной целью дисциплины было найти лучший способ анализа биологических образцов, сохраняя, насколько это возможно, их структуру. не теряя при этом возможности оценки таких характеристик, как антигенность белка, механические свойства и т. д.Эта попытка всегда была особенно сложной для костной ткани из-за ее особой минерализованной структуры, которая дает уникальные характеристики твердости. Все более широкое использование биоматериалов в ортопедии при проведении хирургических операций по поводу травматических, дегенеративных, воспалительных и онкологических заболеваний увеличило сложность гистологической обработки, требуя принятия методов заделки, подходящих для разрезания без удаления имплантата, но все же это возможно. чтобы позволить биологическое исследование ткани.Гистологическая обработка предлагает широкий спектр вариантов с точки зрения техники вложения, позволяя выбрать наиболее подходящую для соотношения анализируемой ткани и результата для оценки.

Заливка парафином остается наиболее популярной техникой для гистологической оценки из-за ее относительной простоты и скорости выполнения, требующей очень ограниченного количества единиц оборудования. Однако костные ткани необходимо обрабатывать декальцинирующими растворами, чтобы удалить минерализованный компонент ткани и позволить фазу разрезания.Эта процедура очень сложна, поскольку точная оценка степени декальцификации, достигаемой образцом, является определяющим фактором между получением образца, который может быть оценен или нет. Чрезмерная декальцинация приведет к разрушению костной структуры, в то время как слишком мягкая декальцинация сделает образец твердым, вызывая образование артефактов на этапе резки. Небольшие размеры заливочной формы, которые соответствуют размерам режущего микротома, ограничивают применение этой техники очень маленькими образцами или их частью (например.г., биопсии). Единственный способ оценить реакцию костной ткани на материал — это механическое удаление имплантата и выполнение гистологической и гистоморфометрической оценки с учетом тени, оставленной удаленным имплантатом [22, 23]. Однако эта процедура возможна только с сыпучими материалами. Фактически, пористые материалы или материалы с особым дизайном, предназначенные для прорастания костной ткани, нельзя удалить без повреждения образцов и непоправимого ущерба для оценки.

Среди различных методов заливки, доступных для биологических образцов, высокотемпературный метод на основе ММА остается единственным, способным удовлетворить потребность во внедрении некальцифицированных образцов больших размеров без удаления имплантированного биоматериала и позволяя провести удовлетворительную биологическую оценку ткани. Хотя этот метод требует довольно длительного времени обработки и дорогостоящего и непростого в использовании оборудования для подготовки образцов, он все же предпочтительнее других растворов для заливки, которые ограничены очень маленькими образцами и могут потребовать удаления имплантата.Среди различных доступных смол низкотемпературный MMA, вероятно, является наиболее похожим по характеристикам на высокотемпературный MMA, с преимуществом получения более тонких секций. Однако этот метод включения разделяет с высокотемпературным MMA необходимость в специальном оборудовании и длительном времени обработки, но в отличие от высокотемпературного MMA, заливочные формы позволяют обрабатывать только очень маленькие образцы. Таким образом, при том же оборудовании и процедурах включение в высокотемпературный ММА позволяет работать с любыми типами образцов, как с точки зрения размера, так и с точки зрения типа имплантата.Хотя срезы, залитые ММА, могут подвергаться различным гистологическим и гистоморфометрическим исследованиям, иммуногистохимические анализы все еще остаются проблемой [24]. Фактически, хотя, в отличие от других смол, таких как GMA, MMA можно депластифицировать для проведения иммуногистохимических анализов [25], все согласны с тем, что высокие температуры, достигаемые во время полимеризации MMA, вызывая образование реактивных радикалов, изменяют химическую структуру тканей и одновременно приводят к необратимой потере антигенности белков.Чтобы преодолеть эту ловушку, можно использовать низкотемпературную полимеризацию (от + 4 ° до -30 ° C) с использованием фотонов синего или ультрафиолетового света в качестве инициаторов для сохранения активности ферментов и антигенности белков. Однако эта процедура, очевидно, крайне непригодна, если образцы in vivo и были помечены флуорохромами для гистоморфометрических оценок флуоресценции. Хорошо известно, что наблюдение за флуоресцентными гистологическими образцами должно проводиться при минимальном освещении и в течение короткого времени, чтобы избежать затухания самого флуоресцентного излучения.Поэтому интуитивно понятно, что этот тип процедуры полимеризации может легко сделать недействительными оценки флуоресценции, когда это необходимо. Этот аспект оказывается особенно важным, учитывая, что, несмотря на невероятные достижения в области неразрушающих методов визуализации для визуализации и анализа образцов, таких как микропозитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ) и компьютерная томография (КТ), гистоморфометрические анализы до сих пор остаются незаменимым инструментом для оценки структурных изменений костной ткани.Тем не менее, гистологические образцы позволяют обнаруживать и оценивать такие биологические явления, как воспалительные реакции, некроз или кровоизлияние, изменения в морфологии клеток или наличие клеточного инфильтрата, которые не могут быть выявлены с помощью рентгенографических изображений. Кроме того, учитывая, что повышенная стоимость такого оборудования для визуализации животных (например, микро-КТ / ПЭТ) делает его непригодным для каких-либо лабораторий, использование статической гистоморфометрии остается необходимым для визуализации и измерения структуры кости и динамической гистоморфометрия остается эффективным методом оценки изменений кости с течением времени в отсутствие радиологического мониторинга.Таким образом, несмотря на некоторые ограничения, возможность, предоставляемая встраиванием MMA для объединения всестороннего обзора биологического образца и точного гистологического и гистоморфометрического анализа, делает этот метод по-прежнему лучшим выбором для оценки медицинских устройств, имплантированных в кости. Не менее важно то, что включение в этот тип смолы также позволяет проводить более сложные оценки, такие как твердость на макро- и наноуровнях [26–28]. Эти методы представляют особый интерес в ортопедии, поскольку они позволяют оценить, изменяет ли присутствие материала механические свойства окружающей кости, и определяют твердость вновь сформированной кости после имплантации остеоиндуктивного материала, что позволяет проводить еще более подробную и всестороннюю оценку состояния. медицинские изделия с костной имплантацией.Литература по использованию закладных секций весьма разнообразна и не очень обширна, а в некоторых случаях тип заливочной среды не указывается [29–31]. Исключая, очевидно, включение в парафин, который из-за природы среды включения и необходимости декальцинации не поддается таким испытаниям, для этой цели могут быть оценены различные твердые смолы, доступные для заливки. Однако необходимо учитывать некоторые технические аспекты; например, GMA мягче, чем MMA, и менее подходит для этапов полировки, необходимых перед испытаниями на микротвердость [32].В других случаях использование других смол (например, холодный монтаж Epofix3) требует дополнительных шагов перед проведением механических испытаний, таких как нанесение золотого покрытия [33].

Таким образом, несмотря на многие технологические достижения, микроскопические анализы остаются неотъемлемой частью исследования биомедицинских материалов и частью ухода за пациентами. Преимущества этого метода находят свое наибольшее воплощение в области ортопедических трансляционных исследований, например, проводимых в учреждениях, которые объединяют клиническую практику и экспериментальные исследования.Фактически, в этих контекстах тесное и постоянное сотрудничество между клиникой и исследователями подразумевает наличие клинических образцов, полученных в результате операции по артропластике или замены протезов в связи с ростовщичеством, биологической неудачей или опухолью. Среди диагностических аспектов, которые не рассматриваются в этой статье, возможность обработки и анализа образцов этого типа в полном объеме позволяет проводить тщательное и, по возможности, систематическое исследование с течением времени для дальнейшего понимания механизмов, лежащих в основе биологических реакций на имплантаты и оценить механические пределы и производительность.Информация, касающаяся степени остеоинтеграции, наличия побочных реакций, типа и степени, большего или меньшего роста кости, а также оценки качества кости, в том числе с точки зрения механической компетентности, имеют большое значение для выявление слабых и сильных сторон медицинских устройств, их оценка при их окончательном применении. Это может помочь в проектировании и разработке все более и более эффективных и долговечных устройств, чтобы свести к минимуму и избежать, насколько это возможно, необходимости удаления или замены и, следовательно, дальнейшего хирургического вмешательства, снижая не только бремя затрат для системы здравоохранения, но, прежде всего, дискомфорт для пациентов.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Работа поддержана грантами Ортопедического института Риццоли (Ricerca Corrente).

Гистологический метод 5. Окрашивание. Атлас гистологии растений и животных.

При световой микроскопии большинство тканей животных бесцветны, за исключением тех, которые содержат некоторые пигменты, такие как гемоглобин в крови или меланин в эпидермисе.Однако в тканях растений наблюдается более широкий спектр пигментов, что позволяет проводить некоторые исследования с помощью световой микроскопии. Клеточная стенка помогает различать клетки и структуры тканей растений. Когда были изобретены первые световые микроскопы, лабораторные исследователи должны были выяснить, как окрашивать ткани, чтобы наблюдать их морфологические особенности. Некоторые распространенные пигменты, такие как кармин и эозин, растворенные в воде, могут окрашивать некоторые тканевые структуры. Расширение тканевой промышленности в XIX веке и необходимость окрашивать одежду привели к быстрому развитию большого разнообразия красителей и пигментов.Многие из этих веществ использовались в качестве красителей в гистологии животных и растений с середины 19 века в наши дни. За это время гистологическое окрашивание стало свидетелем огромного развития новых методов и синтетических красителей, которые удовлетворяют большинство потребностей исследователей. Молекулярные биологи разработали новые методы маркировки клеток и тканей, такие как иммуноокрашивание с использованием антител или гибридизация in situ с использованием зондов, меченных ARN и ДНК. Существуют даже более сложные техники, такие как трансгенные животные с модифицированными генами, которые при экспрессии производят флуоресцентные белки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP), которые можно наблюдать с помощью флуоресцентных микроскопов.

На этих страницах мы будем иметь дело с основными и общими методами, используемыми в большинстве гистологических лабораторий, но мы не будем вдаваться в подробные протоколы более сложных методов. Мы делим общие хитологические техники на пять групп:

а) Общее окрашивание — это методы окрашивания, в которых используются окрашенные вещества или красители, которые связываются с тканевыми структурами за счет электрохимического сродства.

б) Гистохимия включает методы, включающие химическую модификацию некоторых молекул, уже присутствующих в тканях, которые позволяют связывать красители.В этот раздел также будут включены методы окрашивания, основанные на ферментативной активности тканевых ферментов.

в) Лектины, такие как селектины, представляют собой белки, несущие молекулярные домены, которые способны распознавать углеводы и углеводные связи. Распознавание настолько специфично, что лектины используются для идентификации углеводов, присутствующих в гликопротеинах клеточных мембран и внеклеточного матрикса, а также мукополисахаридов. Лектины распознают некоторые типы клеток и тканей и используются в качестве инструментов для изучения этих тканевых компонентов.

г) Иммуногистохимия — очень мощный метод, основанный на специфичности антител. Антитела образуются в результате иммунного ответа животного-хозяина после инъекции чужеродной молекулы, антигена. Очищенные антитела животного-хозяина используются для распознавания этой молекулы в срезах ткани.

д) Гибридизация in situ используется в гистологии для изучения экспрессии генов путем обнаружения информационной РНК (мРНК). Он основан на распознавании двух нуклеотидных одиночных цепей, имеющих комплементарные последовательности.Это признание известно как гибридизация. Одна из последовательностей называется зондом, который помечается маркером и используется для идентификации конкретной мРНК в срезе. Гибридизация in situ — это высокоспецифичный метод обнаружения, поскольку гибридизуются только комплементарные мРНК.

Американский журнал дерматопатологии

Что вы по профессии? Academic MedicineAcute Уход NursingAddiction MedicineAdministrationAdvanced Практика NursingAllergy и ImmunologyAllied здоровьеАльтернативная и комплементарной MedicineAnesthesiologyAnesthesiology NursingAudiology & Ear и HearingBasic ScienceCardiologyCardiothoracic SurgeryCardiovascular NursingCardiovascular SurgeryChild NeurologyChild PsychiatryChiropracticsClinical SciencesColorectal SurgeryCommunity HealthCritical CareCritical Уход NursingDentistryDermatologyEmergency MedicineEmergency NursingEndocrinologyEndoncrinologyForensic MedicineGastroenterologyGeneral SurgeryGeneticsGeriatricsGynecologic OncologyHand SurgeryHead & Neck SurgeryHematology / OncologyHospice & Паллиативная CareHospital MedicineInfectious DiseaseInfusion Сестринское делоВнутренняя / Общая медицинаВнутренняя / лечебная ординатураБиблиотечное обслуживание Материнское обслуживание ребенкаМедицинская онкологияМедицинские исследованияНеонатальный / перинатальный неонатальный / перинатальный уходНефрологияНеврологияНейрохирургияМедицинско-административное сестринское дело ecialtiesNursing-educationNutrition & DieteticsObstetrics & GynecologyObstetrics & Gynecology NursingOccupational & Environmental MedicineOncology NursingOncology SurgeryOphthalmology / OptometryOral и челюстно SurgeryOrthopedic NursingOrthopedics / Позвоночник / Спорт Медицина SurgeryOtolaryngologyPain MedicinePathologyPediatric SurgeryPediatricsPharmacologyPharmacyPhysical Медицина и RehabilitationPhysical Терапия и женщин Здоровье Физическое TherapyPlastic SurgeryPodiatary-generalPodiatry-generalPrimary Уход / Семейная медицина / Общие PracticePsychiatric Сестринское делоПсихиатрияПсихологияОбщественное здравоохранениеПульмонологияРадиационная онкология / ТерапияРадиологияРевматологияНавыки и процедурыСонотерапияСпорт и упражнения / Тренировки / ФитнесСпортивная медицинаХирургический уходПереходный уходТрансплантационная хирургияТерапия травмТравматическая хирургияУрологияЖенское здоровьеУход за ранамиДругое

Что ваша специальность? Addiction MedicineAllergy & Clinical ImmunologyAnesthesiologyAudiology & Speech-Language PathologyCardiologyCardiothoracic SurgeryCritical Уход MedicineDentistry, Oral Surgery & MedicineDermatologyDermatologic SurgeryEmergency MedicineEndocrinology & MetabolismFamily или General PracticeGastroenterology & HepatologyGenetic MedicineGeriatrics & GerontologyHematologyHospitalistImmunologyInfectious DiseasesInternal MedicineLegal / Forensic MedicineNephrologyNeurologyNeurosurgeryNursingNutrition & DieteticsObstetrics & GynecologyOncologyOphthalmologyOrthopedicsOtorhinolaryngologyPain ManagementPathologyPediatricsPlastic / Восстановительная SugeryPharmacology & PharmacyPhysiologyPsychiatryPsychologyPublic, Окружающая среда и гигиена трудаРадиология, ядерная медицина и медицинская визуализацияФизическая медицина и реабилитация Респираторная / легочная медицинаРевматологияСпортивная медицина / наукаХирургия (общая) Травматологическая хирургияТоксикологияТрансплантационная хирургияУрологияСосудистая хирургияВироло у меня нет медицинской специальности

Каковы ваши условия работы? Больница на 250 коекБольница на более 250 коекУправление престарелыми или хосписы Психиатрическое или реабилитационное учреждениеЧастная практикаГрупповая практикаКорпорация (фармацевтика, биотехнология, инженерия и т. Д.) Докторантура Университета или Медицинского факультета Магистратура или 4-летнего Академического Университета Общественный колледж Правительство Другое

границ | Оптимизация протокола для набора жизнеспособности бактерий LIVE / DEAD® BacLightTM для быстрого определения бактериальной нагрузки

Введение

Уровень устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) становится все более серьезным бременем для здоровья, особенно в отношении бактерий, вызывающих общие инфекции (ВОЗ, 2014, 2017).Ключевой стратегией решения проблемы УПП является улучшение инфекционного контроля, важным аспектом которого является быстрая и надежная диагностика.

Тест на чувствительность к противомикробным препаратам (AST) используется для определения чувствительности бактерий к потенциальному лечению антибиотиками (Jorgensen and Ferraro, 2009). Обычно используются методы, основанные на культуре, когда живые клетки растут на бактериологической среде, а мертвые — нет (Berney et al., 2007; Jorgensen and Ferraro, 2009). Методы, основанные на культуре, дают информацию только о жизнеспособных и культивируемых клетках и подвержены ошибкам из-за факторов, участвующих в росте бактерий на чашках с агаром (Davis, 2014).Кроме того, методы, основанные на культуре, являются медленными [обычно достигаются в течение двух-пяти дней (Lagier et al., 2015)], что может привести к назначению неподходящего антибиотика в клинических условиях из-за срочности лечения (ВОЗ, 2014). Использование неправильного антибиотика приводит к неэффективности лечения, увеличению заболеваемости и смертности пациентов и может способствовать дальнейшему развитию УПП у бактерий (ВОЗ, 2014, 2017). Улучшенная, более быстрая диагностика, которая может помочь в выборе антибиотика, может обойти эту проблему.

К AST применялись методы быстрой амплификации нуклеиновых кислот и масс-спектрометрии (Lagier et al., 2015; Sparbier et al., 2016). Однако первые могут информировать только о наличии устойчивости у ограниченного числа видов бактерий (Sparbier et al., 2016), а вторые — о том, какие лекарства не подходят для использования, не предоставляя при этом никаких указаний по выбору эффективного антибиотика для лечения. (ван Белкум и др., 2017). Таким образом, несмотря на развитие новых методов, все еще существует потребность в более быстрых и информативных методах AST. Идеальный метод AST позволит быстро получить ответ с минимальными шагами обработки (Jorgensen and Ferraro, 2009).В дополнение к улучшенному уходу за пациентом, быстрое AST снизит затраты за счет сокращения дополнительных лабораторных тестов, инвазивных процедур и продолжительности госпитализации (Doern et al., 1994; Barenfanger et al., 1999).

Альтернативой обнаружению на основе культуры является оценка других показателей жизнеспособности клеток с использованием флуоресцентных красителей, включая мембранный потенциал и целостность мембраны (Berney et al., 2007; Stiefel et al., 2015). LIVE / DEAD ^® BacLight ^TM Bacterial Viability Kit (BacLight Kit) дифференцирует живые и мертвые клетки с использованием целостности мембраны в качестве показателя жизнеспособности клеток и основан на процедуре двойного окрашивания с использованием SYTO 9 и йодида пропидия (PI) ( Berney et al., 2007; Stiefel et al., 2015). Максимумы возбуждения / испускания этих красителей составляют ~ 480/500 нм для SYTO 9 и ~ 490/635 нм для PI (Invitrogen, 2004). Оба красителя интеркалируют нуклеиновыми кислотами, что приводит к усилению флуоресцентного сигнала; однако они различаются по свойствам проницаемости мембран (Freire et al., 2015; Stiefel et al., 2015). SYTO 9 может пересекать все мембраны бактериальных клеток, облегчая подсчет целых клеток при использовании отдельно, в то время как PI может проникать только в клетки с поврежденными мембранами, позволяя дифференцировать живые и мертвые клетки на основе относительной зеленой и красной флуоресценции от окрашивания SYTO 9 и PI (Berney et al. ., 2007; Freire et al., 2015; Stiefel et al., 2015). Предыдущая работа продемонстрировала, что окрашивание SYTO 9 и PI суспензий живых и мертвых клеток Escherichia coli может дать надежный абсолютный подсчет клеток (до 2,5% живых и 20% мертвых) при использовании проточного цитометра и эталонных шариков (Ou et al. др., 2017).

Измерения флуоресценции обычно проводятся с использованием микроскопа, флуориметра или проточного цитометра (Ambriz-Aviña et al., 2014). Флуорометры и проточные цитометры, включая топовые модели, имеют ограниченное спектральное разрешение, в то время как Optrode позволяет быстро собирать спектры высокого разрешения.Дополнительная информация, доступная в спектрах высокого разрешения, позволяет обнаруживать незначительные различия в спектрах и позволяет проводить более точный спектральный анализ. В настоящее время абсолютное количественное определение живых и мертвых клеток в образце может быть эффективно выполнено только с помощью проточной цитометрии (McClain et al., 2001). Недостатками использования проточных цитометров являются стоимость и портативность (Ambriz-Aviña et al., 2014). В последние годы были достигнуты успехи в портативности, такие как Accuri C6 от BD Biosciences; однако применимость проточных цитометров все еще ограничена стоимостью.Более дешевая альтернатива использованию проточного цитометра для количественного определения флуоресценции — это волоконная спектроскопическая система с временным разрешением, называемая Optrode, разработанная в Университете Окленда (Hewitt et al., 2012). Вкратце, оптрод работает, направляя лазер через волоконный зонд в образец, который, в свою очередь, собирает излучаемый от образца свет и направляет его на спектрометр (Vanholsbeeck et al., 2014). Спектрометр регистрирует сигнал флуоресценции и подключается к компьютеру для дальнейшего спектрального анализа (Vanholsbeeck et al., 2014). Обнаружение бактериальных клеток на основе флуоресценции было достигнуто с использованием Optrode для E. coli , окрашенного акридиновым оранжевым (Guo et al., 2017).

Определение жизнеспособности клеток с помощью набора BacLight Kit имеет несколько преимуществ по сравнению с подсчетом колоний на чашках с агаром. Окрашивание живых / мертвых происходит быстро, и гибель клеток для любого заданного процесса может быть определена количественно напрямую и почти в реальном времени, а не ретроспективно, исходя из количества введенных клеток и образовавшихся колоний (Berney et al., 2007; Stiefel et al., 2015). Этот метод позволяет обнаруживать состояния клеток, отличные от живых, как те, которые способны расти на чашке с агаром, и мертвые, как те, которые не могут расти, включая живые поврежденные клетки, которые не могут расти на чашках с агаром (Davis, 2014; Stiefel et al. ., 2015; Леонард и др., 2016). Придирчивый характер бактерий означает, что оценка жизнеспособности на основе культур может привести к недооценке жизнеспособных клеток, что может повлиять на потенциальные применения (Suller and Lloyd, 1999; Davis, 2014; Léonard et al., 2016). Наконец, живое / мертвое окрашивание позволяет визуализировать потерю целостности мембраны с течением времени (Nocker et al., 2017).

Применение набора BacLight Kit для оценки жизнеспособности бактерий хорошо изучено. Различные концентрации красителя, время инкубации красителя, штаммы бактерий, среды для роста и окрашивания, а также длины волн возбуждения и излучения были использованы со смешанными результатами (Prakash Singh, 2006; Berney et al., 2007; Hoerr et al., 2007; Kort et al., 2010; Thomas et al., 2011; Eberhart et al., 2012; Freire et al., 2015; Stiefel et al., 2015; Пак и Ким, 2018). Большинство исследований следовали инструкциям BacLight Kit — рост клеток в богатой среде и промывание в физиологическом растворе перед окрашиванием, создание суспензий живых и мертвых клеток для построения стандартной кривой и расчет соотношения красной и зеленой флуоресценции для определения доля живых клеток в образце (Prakash Singh, 2006; Hoerr et al., 2007; Eberhart et al., 2012; Freire et al., 2015; Stiefel et al., 2015; Park and Kim, 2018).Однако ни в одном из опубликованных исследований не был установлен анализ, в котором культуры выращивают и окрашивают в одних и тех же средах, и не было сделано никаких улучшений в отношении соотношения зеленой и красной флуоресценции. Кроме того, различия между окрашиванием каждым красителем отдельно и окрашиванием в комбинации не изучались, за исключением одного исследования (Armstrong and He, 2001). В нескольких исследованиях к AST применялись методы, основанные на флуоресценции; однако эти методы были сложными, в них использовался ряд красителей для оценки различных показателей жизнеспособности с многообещающими, но неоднозначными результатами (Walberg et al., 1996; Саллер и Ллойд, 1999; Gauthier et al., 2002). Следовательно, существует потенциал для применения и оптимизации использования BacLight Kit для AST.

В этой работе мы исследуем экспериментальные параметры с целью разработки улучшенного анализа AST для определения активности антибиотиков на E. coli MG1655 с использованием Optrode и BacLight Kit в качестве меры жизнеспособности клеток. Мы показываем, что BacLight Kit может использоваться для обнаружения живых и мертвых суспензий E. coli MG1655 как в физиологическом растворе, так и в среде с минимальными солями A с 0.2% глюкоза. Эти данные были использованы для оптимизации модели интенсивности флуоресценции SYTO 9 и PI относительно живой и мертвой популяции. Сравнение результатов в физиологическом растворе и минимальных средах позволило подтвердить использование последней среды для спектрометрии живых / мертвых с E. coli MG1655. Одним из заметных преимуществ использования минимальной среды является рост и окрашивание бактерий, встречающихся в одной и той же среде, что исключает необходимость мыть образцы. На нашей модели была продемонстрирована более сложная формула для расчета доли живых клеток в образце, скорректированное соотношение красителей, которое превосходит соотношение зеленой и красной флуоресценции, рекомендованное в инструкциях к набору BacLight.В ходе этой работы мы исследовали взаимодействие между SYTO 9 и PI и пришли к выводу, что взаимодействие изменяется от аддитивного до возбуждения PI с помощью SYTO 9 по мере увеличения концентрации мертвых клеток.

Материалы и методы

Бактериальный штамм

Escherichia coli K-12 штамм MG1655 (далее E. coli MG1655) был выбран для обнаружения живых / мертвых в этой работе, поскольку это хорошо охарактеризованный и широко используемый штамм (Sezonov et al., 2007). E. coli MG1655 выращивали при 37 ° C, при необходимости, при встряхивании при 200 об / мин.

Среды и химикаты

Реагенты для клеточной биологии были приобретены у Sigma-Aldrich. Общие реагенты и химические вещества включали хлорид натрия, триптический соевый бульон (TSB), агар и изопропанол. E. coli культивировали в TSB или в среде с минимальными солями A. Минимальная среда A использовалась для поддержки роста в минимальной среде, обеспечивающей только основные питательные вещества. Один литр 5-кратного минимального раствора А был приготовлен по следующему рецепту: 5 г (NH ₄ ) ₂ SO ₄ ,22.5 г KH ₂ PO ₄ , 52,5 г K ₂ HPO ₄ , 2,5 г HOC (COONa) (CH ₂ COONa) ₂ ⋅2H ₂ O (цитрат натрия 2H ₂ О). После автоклавирования этот раствор разбавляли в 1 раз стерильной водой и следующими стерильными растворами на литр: 1 мл 1 M MgSO ₄ 7H ₂ O и 10 мл 20% раствора глюкозы (вес / объем). Набор для определения жизнеспособности бактерий LIVE / DEAD ^® BacLight ^TM (L7012) был приобретен у Invitrogen.

Подготовка живых и мертвых

живых и мертвых культур E. coli готовили в соответствии с инструкциями, данными с набором BacLight (Invitrogen, 2004). Для экспериментов, проводимых в физиологическом растворе, были предприняты следующие шаги: мутная ночная культура E. coli в TSB была субкультивирована при разведении 1:20 в свежем TSB и выращивалась в течение примерно 30 минут до OD ₆₀₀ , равного 0,4–0,6. был достигнут. Субкультивированные клетки собирали центрифугированием при 7000 × g в течение 7 минут при комнатной температуре и концентрировали в 10 раз в 0.85% (мас. / Об.) Физиологический раствор. Для живых клеток субкультуру разводили в 10 раз физиологическим раствором. Для мертвых клеток субкультуру разводили в 10 раз 70% изопропанолом. Суспензии живых и мертвых клеток инкубировали при 28 ° C со встряхиванием 200 об / мин в течение 15 мин. Живые и мертвые клетки собирали центрифугированием при 7000 × g в течение 7 минут при комнатной температуре, и осадки ресуспендировали в физиологическом растворе примерно при 1 × 10 ⁸ КОЕ / мл (OD ₆₀₀ 0,255). Живые клетки были ретроспективно подсчитаны с использованием метода распределения на чашках.Количество мертвых клеток было получено из подсчета живых клеток на планшете. Для подтверждения гибели клеток использовали чашки для распределения суспензии мертвых клеток. В экспериментах, проводимых в минимальных средах, использовался тот же протокол, за исключением того, что субкультура выращивалась в течение 3,5 часов, что отражает более медленную скорость роста в минимальных средах. Для экспериментов по оптимизации протокола 1 × 10 ⁸ КОЕ / мл живых и мертвых суспензий E. coli были смешаны для создания суспензий, содержащих 0, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 75, 90, 95 , 97.5, 99 и 100% живые (в пределах ∼1 × 10 ⁶ — 1 × 10 ⁸ КОЕ / мл). Для экспериментов, направленных на изучение взаимодействий красителей, были приготовлены суспензии при 0, 25, 50, 75 и 100% живом состоянии.

Окрашивание образцов с помощью SYTO 9 и PI

Рабочие растворы SYTO 9 и PI были приготовлены в 0,85% физиологическом растворе в янтарных микроцентрифужных пробирках (SSIbio) при 33,4 и 400 мкМ соответственно и хранили на льду. Окрашенные образцы устанавливали путем добавления 50 мкл рабочего раствора SYTO 9, 50 мкл рабочего раствора PI и / или 0.85% физиологический раствор (для общего объема 100 мкл) на 0,9 мл культуры в желтой пробирке. Конечные концентрации SYTO 9 и PI составляли 1,67 и 20 мкМ. Для экспериментов по оптимизации в минимальной среде каждую суспензию живых и мертвых клеток окрашивали SYTO 9, PI и SYTO 9 с PI. Для экспериментов по оптимизации в физиологическом растворе и исследования взаимодействия красителей каждую суспензию живых и мертвых клеток окрашивали только PI и SYTO 9 с помощью PI. Образцы перемешивали на вихревой платформе в течение 15 мин.

Лечение

Субкультуру 1 × 10 ⁸ КОЕ / мл готовили, как указано выше, и помещали аликвоты в четыре пробирки — для обработки SYTO 9, обработки PI, обработки SYTO 9 и PI, а также необработанного контроля. Образцы инкубировали при 37 ° C со встряхиванием 200 об / мин. В каждую временную точку — 0,25, 0,5, 2 и 5 часов — отбирали аликвоты из всех обработок для подсчета путем подсчета на планшете и интенсивности флуоресценции, измеренной на Optrode. Для обработанных образцов аликвоту 1 мл добавляли в желтую пробирку для измерений Optrode.Для необработанного контроля аликвоту 0,9 мл окрашивали SYTO 9, PI и SYTO 9 с PI, как описано выше.

Измерение флуоресценции образца с помощью Optrode

Флуорометр Optrode использовался для возбуждения образцов, а затем для сбора и измерения света, испускаемого в результате возбуждения. Измерения проводились с использованием скрипта непрерывных измерений, который синхронизирует лазер и спектрометр для непрерывного измерения времени интегрирования 20 мс в течение всего 10 с.Из каждой пробирки было проведено три измерения, и между измерениями зонд промыли 70% этанолом. Фоновые показания были взяты в трех экземплярах из неокрашенных сред, за исключением исследования флуоресценции ростовых сред, для которых неокрашенный физиологический раствор использовался для фоновых показаний. Мощность лазера, поддерживаемая на уровне 10 мВт, контролировалась во время измерения с помощью измерителя мощности и фотодиода для каждого эксперимента.

Обработка файлов данных Optrode

Сценарий на R использовался для обработки файлов данных (hdf5), сгенерированных измерениями Optrode (R Core Team, 2013).Этот сценарий суммирует первые три собранных спектра (эффективное время интегрирования 60 мс), нормализует сумму до 1 мс и 1 мВт, а затем вычитает средний спектр фона, нормализованный к тем же условиям. Пользователь может определить диапазоны длин волн для интегрирования и количество последовательных спектров, которые будут использоваться для анализа. Результатом является таблица данных, содержащая нормализованные интенсивности флуоресценции (выраженные в относительных единицах флуоресценции, RFU) для диапазонов длин волн для каждого выполненного измерения.

Для экспериментов по оптимизации были исследованы интенсивности флуоресценции в следующих спектральных диапазонах: 505–515 нм, 509–529 нм и 510–540 нм для излучения SYTO 9 и 600–610 нм, 609–629 нм и 620 нм. –650 нм для выбросов PI.В инструкциях к набору BacLight рекомендуется использовать 510–540 нм и 620–650 нм. Другие диапазоны интегрирования длин волн были выбраны на основе предыдущей работы, которая определила, что эти диапазоны имеют более характерные пики SYTO 9 и PI, чем диапазоны, указанные в инструкциях BacLight Kit (Ou et al., 2016). Для исследования взаимодействия красителей исследовали интенсивности флуоресценции измеренных образцов в диапазоне длин волн 600–610 нм.

Обработка биологических данных и статистический анализ

Интенсивность флуоресценции SYTO 9 и PI, полученная путем интегрирования в определенных диапазонах длин волн, может использоваться для определения доли живых клеток в образце, используя формулу, приведенную в инструкциях BacLight Kit, называемую соотношением набора, определенную в уравнении ( 1).

доля живых клеток∝ SYTO 9PI (1)

Где SYTO 9 и PI — интенсивности флуоресценции, интегрированные в определенном диапазоне длин волн для SYTO 9 и PI, соответственно.

Однако предыдущая работа над этим проектом показала, что зависимость между соотношением наборов и процентным содержанием живых бактерий не была линейной (Ou et al., 2016). Поэтому было разработано более сложное соотношение, названное скорректированным соотношением красителей, уравнение (2) (Ou et al., 2016).

% Живых клеток∝ (100 × SYTO 9PI) / (1 + SYTO 9PI) (2)

Для экспериментов по оптимизации использовались излучения SYTO 9 и PI в определенных диапазонах длин волн для построения графиков разброса интенсивности флуоресценции в зависимости от экспериментально определенного% живого для каждого условия окрашивания. Для исследования взаимодействия красителей интенсивность флуоресценции при 600–610 нм наносили на график против экспериментально определенного% живого. Для данных, полученных в результате экспериментов по оптимизации, долю живых клеток, полученную из формулы набора и скорректированного соотношения красителей, использовали для построения диаграммы разброса относительно экспериментально определенного процента живых клеток.

Каждый график разброса был проанализирован с использованием анализа линейной регрессии, который соответствует прямой линии для получения наиболее подходящего значения наклона и точки пересечения. Степень соответствия линии количественно определяется коэффициентом детерминации ( R ² ), который представляет собой дробную часть от 0,0 до 1,0. Более высокие значения указывают на то, что модель лучше соответствует данным, т.е. чем ближе значение R ² к 1, тем большая часть общей дисперсии Y объясняется моделью.Значение R ² использовалось для информирования о том, какой диапазон длин волн соответствует наилучшему моделированию% живого изображения. Статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версии 7 (GraphPad Software, Inc.).

Для исследования влияния SYTO 9 и PI на жизнеспособность клеток с течением времени была определена значительная разница между условиями путем вычисления площади под кривой (AUC) для каждой обработки и сравнения значений AUC с использованием теста Краскела-Уоллиса с P -значение <0.05, что указывает на общую значительную разницу. Затем был использован тест Данна для множественного сравнения post hoc для поиска значительных различий между обработками со значением P <0,05, указывающим на значительную разницу.

Для исследования взаимодействия красителей значительную разницу между условиями определяли с помощью анализа ковариации (ANCOVA). ANCOVA сначала сравнивает наклон линий со значением P <0,05, указывающим на значительную разницу.Если значение P > 0,05, тогда ANCOVA сравнивает точки пересечения линий со значением P <0,05, что указывает на значительную разницу. Нормализованная абсолютная разница в интенсивности флуоресценции между E. coli , окрашенной только PI, и PI с SYTO 9 была рассчитана с использованием уравнения (3). Эти данные были проанализированы с использованием теста Краскела-Уоллиса со значением P <0,05, что указывает на общую значительную разницу. Затем использовали тест Данна для множественного сравнения post hoc для поиска значительных различий между интенсивностью флуоресценции каждой суспензии живых и мертвых клеток со значением P <0.05, что указывает на значительную разницу.

Нормализованная разница в красных выбросах = (SYTO 9 и PI-PI) / PI (3)

Где SYTO 9 и PI и PI — интенсивности красной флуоресценции, интегрированные при 600–610 нм только для SYTO 9 и PI и PI, соответственно.

Результаты

Расследование СМИ

Насыщенная среда (TSB) и минимальная среда (минимальное количество солей A с 0,2% глюкозы) сравнивали с физиологическим раствором, который не поддерживает рост, необходимый для AST.Сигналы флуоресценции SYTO 9 и PI в физиологическом растворе и минимальной среде были аналогичными, в то время как в TSB интенсивности были почти на два порядка сильнее (Рисунок 1). Rich media не подходит для протокола без промывки. Для дальнейшего тестирования была выбрана минимальная среда.

Рисунок 1. Флуоресценция питательной среды. TSB, минимальную среду солей A с 0,2% глюкозы (MM) и 0,85% физиологический раствор (контроль) окрашивали SYTO 9 или PI. Интенсивность флуоресценции была получена путем интегрирования спектров при 505–515 нм для излучений SYTO 9 (кружки) и 600–610 нм для излучений PI (квадраты) с представлением медианного значения трех измерений.

Оптимизация анализа данных

Были исследованы несколько параметров, помимо тех, что указаны в инструкциях BacLight Kit. Интеграция в диапазонах длин волн 505–515 нм и 600–610 нм для SYTO 9 и PI, соответственно, дала наиболее линейные результаты при сравнении интенсивности сигнала или соотношения красителей с долей живых клеток в суспензии E. coli , в минимальной среде и физиологическом растворе (Рисунки 2A – F). Для сравнения, более низкие значения R ² были получены при 509–529 нм и 510–540 нм для SYTO 9 и 609–629 нм и 620–650 нм для PI (рисунки 2A, B).Аналогичным образом, более низкие значения R ² были получены для 509–529 нм и 609–629 нм, а также 510–540 нм и 609–629 для доли живых клеток, рассчитанной из набора и скорректированного соотношения красителей (рисунки 2В, Г).

Рис. 2. Спектрометрия живых / мертвых на живых и мертвых суспензиях E. coli в минимальной среде и физиологическом растворе. Интенсивность SYTO 9 в минимальной среде (A) , интенсивность PI в минимальной среде (B) , доля живых клеток в минимальной среде, полученная из набора, соотношение (C) ,% живых клеток в минимальной среде, полученной из скорректированное соотношение красителя (D) , доля живых клеток в физиологическом растворе, полученная из набора, соотношение (E) и% живых клеток в физиологическом растворе, полученное из скорректированного соотношения красителей (F) для живых и мертвых E.coli , полученные путем интегрирования в трех различных диапазонах длин волн для каждого красителя. Значение R ² было получено из анализа линейной регрессии данных для каждого диапазона длин волн. Представленные данные — это медиана с диапазоном от шести биологических повторов.

Возможность использования набора или скорректированного соотношения красителей для определения доли живых клеток в окрашенной культуре была исследована в минимальной среде и физиологическом растворе с использованием диапазонов длин волн 505–515 нм и 600–610 нм.В минимальной среде и физиологическом растворе меньшие полосы погрешностей и более высокое значение R ² для скорректированного соотношения красителей по сравнению с соотношением в наборе поддерживали использование скорректированного соотношения красителей (Рисунки 2C – F). Связь между интенсивностью сигнала и скорректированным соотношением красителей была наиболее сильной при использовании минимальной среды (рисунки 2D, F). Эти результаты дополнительно подтверждают обнаружение живых и мертвых клеток с использованием SYTO 9 и PI в минимальной среде.

Предел обнаружения

В минимальных средах выбросы SYTO 9 и PI уменьшаются с увеличением% живого (рис. 3A, B).% Живого, рассчитанный на основе скорректированного соотношения красителей, уменьшается в соответствии с экспериментально определенным% живого до прежнего плато, составляющего ~ 5% живого (~ 5 × 10 ⁶ КОЕ / мл) (Рисунок 3C). В физиологическом растворе процент живых организмов, рассчитанный на основе скорректированного соотношения красителей, уменьшается по мере того, как экспериментально определенный процент живых организмов уменьшается до ~ 25% живых организмов (~ 2,5 × 10 ⁷ КОЕ / мл), после чего наступает плато (Рисунок 3D).

Рис. 3. Взаимосвязь между спектрометрией живых / мертвых клеток и количеством жизнеспособных клеток на планшете в минимальной среде и физиологическом растворе.Выбросы SYTO 9 в минимальных средах ( A ; кружки), выбросы PI в минимальных средах ( B ; треугольники), скорректированное соотношение красителей в минимальных средах ( C ; ромбы) и скорректированное соотношение красителей в физиологическом растворе ( D ; ромбы) по сравнению с подсчетом жизнеспособных клеток ( A – D ; квадраты) для живых и мертвых суспензий E. coli . Интенсивность флуоресценции получали путем интегрирования 505–515 нм и 600–610 нм. Представленные данные — это медиана с диапазоном от шести биологических повторов.

Влияние инкубации SYTO 9 и PI на

Было исследовано влияние окрашивания образца в начале эксперимента с динамикой времени, что позволяет немедленно измерить флуоресценцию образца (Pore, 1994). После 5-часовой обработки инкубация с обоими красителями имеет наибольший ингибирующий эффект (примерно 0,5–1 log уменьшения) на количество клеток, за которым следует SYTO 9 (примерно 0,5 log), как определено подсчетом жизнеспособных пластинок (рис. 4A). Клетки E. coli , инкубированные с ИП, присутствовали в количестве жизнеспособных клеток, аналогичных количеству необработанных клеток (фиг. 4А).Более высокие интенсивности флуоресценции были зарегистрированы для клеток, инкубированных с SYTO 9 и PI индивидуально по сравнению с необработанными клетками (рис. 4B), что, возможно, указывает на снижение жизнеспособности, поскольку более высокие интенсивности флуоресценции были обнаружены для клеток, убитых изопропанолом, по сравнению с необработанными клетками (рис. 3A, B). . Скорректированное соотношение красителей в образцах, инкубированных с обоими красителями, было ниже, чем в необработанном контроле (фиг. 4C), что позволяет предположить, что инкубация с красителями снижает жизнеспособность клеток (фиг. 4A).

Рисунок 4. Влияние окрашивания живых / мертвых на жизнеспособность E. coli . Клетки E. coli в минимальной среде окрашивали SYTO 9 и PI по отдельности и в комбинации с течением времени. Необработанные клетки окрашивали в каждый момент времени. В моменты времени 0,25, 0,5, 2 и 5 ч отбирали аликвоты для определения жизнеспособности клеток путем подсчета жизнеспособных клеток на планшете (A) и путем измерения флуоресценции окрашенных культур (B, C) . Интенсивность флуоресценции получали путем интегрирования 505–515 нм (кружки) и 600–610 нм (треугольники).Скорректированное соотношение красителей (квадраты) использовали для определения% живого. Представленные данные — это медиана с диапазоном от трех биологических повторов.

Исследование взаимодействия красителей

Интенсивность флуоресценции (600-610 нм) из E. coli , окрашенных SYTO 9 и PI, больше, чем только PI; присутствие SYTO 9 может опосредовать увеличение красных выбросов (рис. 5). Повышенное красное излучение может быть связано с перекрытием спектров или перекрестными помехами или может указывать на то, что излучение SYTO 9 возбуждает PI (Stiefel et al., 2015). Перекрестные помехи возникают, когда излучение одного красителя перекрывает диапазон длин волн излучения второго красителя (Armstrong and He, 2001; Stiefel et al., 2015). SYTO 9 излучает флуоресценцию до ∼650 нм (Armstrong and He, 2001) и, следовательно, может вносить вклад в излучение в диапазоне 600–610 нм, что обычно приписывается только PI. Излучение SYTO 9 может возбуждать PI, поскольку спектр излучения SYTO 9 перекрывается со спектром возбуждения PI (Stocks, 2004), что приводит к гашению зеленого (505–515 нм) излучения и усилению красного (600–610 нм). ) выбросы.

Рисунок 5. Взаимодействие между SYTO 9 и PI. (A) Интенсивности флуоресценции при 600-610 нм от живых и мертвых суспензий E. coli в минимальной среде, окрашенной только PI (кружки) и PI с SYTO 9 (квадраты). Линия наилучшего соответствия для каждого условия окрашивания была построена с использованием линейного регрессионного анализа, а значительная разница между условиями была определена с использованием ANCOVA. Наклоны линий существенно различались ( P -значение: <0.05). Представленные данные - это медиана с диапазоном от трех биологических повторов. (B) Абсолютная разница в интенсивности флуоресценции между E. coli , окрашенной только PI, и PI с SYTO 9, нормированной только на PI. Статистическая значимость представлена ​​ ^* (критерий Краскела-Уоллиса, P -значение: <0,05, множественное сравнение Данна post hoc ). Представленные данные взяты из трех биологических повторов со средней линией.

Сравнивали выбросы красного от клеток, окрашенных только PI и обоими красителями.Интенсивность флуоресценции PI была значительно выше в присутствии SYTO 9 (рис. 5A; линейный регрессионный анализ; наклоны разные; значение P- : <0,05). Была рассчитана абсолютная разница в интенсивности, нормализованная к интенсивности только ИП (рис. 5В). Разница в интенсивности ИП увеличивалась с увеличением концентрации мертвых клеток. Разница между 0 и 100% живыми была статистически значимой (тест Краскела-Уоллиса, P — значение: <0,05, множественное сравнение Данна апостериорный тест ).

Взаимодействие красителя между SYTO 9 и PI было исследовано в суспензиях ряда соотношений живые и мертвые окрашенные клетки E. coli по спектрам флуоресценции 450–750 нм (рис. 6). Эмиссия SYTO 9 намного больше, чем эмиссия PI, особенно для суспензий с высокой концентрацией мертвых клеток. Для 0–75% суспензий живых клеток интенсивность излучения при 600–610 нм от SYTO 9 больше, чем от SYTO 9 с PI, в то время как противоположное верно для PI (рис. 6), что подтверждает утверждение о том, что красители взаимодействуют, приводя к Гашение сигнала SYTO 9 и усиление сигнала PI.Однако для 90–100% суспензий живых клеток выбросы SYTO 9 (600–610 нм) меньше, чем для SYTO 9 с PI (рис. 6), что позволяет предположить, что для окрашенных SYTO 9 и PI клеток сигнал на этой длине волны Диапазон объясняется перекрытием выбросов SYTO 9 в сочетании с выбросами несвязанного красителя PI. Порог концентрации мертвых клеток существует между 75 и 90% суспензий живых клеток, который, как мы предполагаем, отмечает точку, где существует достаточно высокая концентрация мертвых клеток для облегчения связывания обоих красителей с ДНК и последующего взаимодействия тушения / усиления.

Рис. 6. Спектры окрашенных SYTO 9 и PI живых и мертвых суспензий E. coli . Спектры флуоресценции окрашенных SYTO 9 (светло-серый), PI (темно-серый) и SYTO 9 и PI (черный) суспензий живых и мертвых E. coli в минимальной среде. Суспензии выражены в% живых с 100% (A) , 90% (B) , 75% (C) , 50% (D) , 25% (E) , 10% (F) и 0% (G) .Вертикальные линии указывают выбранные диапазоны интегрирования длин волн: 505–515 нм для излучений SYTO 9 и излучений PI 600–610 нм. Оси графиков выбраны, чтобы выделить взаимодействие красителей в красном диапазоне излучения. Представленные данные являются средними для шести биологических повторов.

Обсуждение

Мы адаптировали протокол, описанный в инструкциях BacLight Kit, для применения спектрометрии живых / мертвых клеток к популяциям E. coli , содержащим живые и мертвые клетки.Оптимизированный протокол может быть потенциально применен к AST в качестве альтернативы методам, основанным на культуре. Сначала была выбрана соответствующая среда. В инструкциях к набору BacLight рекомендуется использовать богатую среду для выращивания тестируемых организмов и 0,85% физиологический раствор для окрашивания. Чтобы сократить количество этапов спектрометрии живых / мертвых бактерий, требуется единая среда, подходящая как для выращивания, так и для окрашивания бактерий. TSB, богатая среда, содержит компоненты, которые флуоресцируют после окрашивания SYTO 9 и PI, особенно для первого, в то время как минимальная среда дает такую ​​же интенсивность флуоресценции, как физиологический раствор (рис. 1).Интенсивность флуоресценции немытых образцов в среде с минимальным содержанием солей A может быть измерена, что предотвращает потерю биологической информации из образцов и снижает экспериментальную ошибку (Ou et al., 2017).

Большинство исследований, проведенных с использованием набора BacLight Kit, следуют (Eberhart et al., 2012; Kahlisch et al., 2012; Stiefel et al., 2015) инструкциям по окрашиванию, иногда с небольшими изменениями, включая окрашивание в буфере (Leuko et al., 2004; Jung et al., 2008; Freire et al., 2015) и воды (Hoefel et al., 2003) для определения жизнеспособности планктонных бактериальных клеток. Эти среды не поддерживают разумный рост бактерий и поэтому не подходят для AST. В одном исследовании была предпринята попытка преодолеть проблему необходимости промывать образцы бактерий, зараженных антимикробными препаратами, путем использования богатой среды для начального роста, а затем заражения E. coli в нефлуоресцентной среде, содержащей физиологический раствор и глюкозу (Anaya et al., 2016) . Однако используемые концентрации глюкозы (0,194-0,777 мМ) являются низкими по сравнению с минимальной средой солей А (11.1 мМ), и не будет поддерживать рост в достаточной степени для надежного AST (Anaya et al., 2016). Методология окрашивания, представленная в текущем отчете, заполняет пробел в литературе, относящейся к AST, с использованием основанных на флуоресценции показателей жизнеспособности клеток.

Мы определили оптимальные диапазоны интегрирования длин волн и формулу для расчета доли живых клеток (рис. 2). Экспериментальные параметры, указанные в протоколе BacLight Kit — окрашивание в физиологическом растворе, диапазоны интегрирования длин волн (510–540 нм и 620–650 нм) и соотношение набора — не соответствовали данным.Напротив, окрашивание в минимальной среде, диапазоны интеграции длин волн 505–515 нм и 600–610 нм и скорректированное соотношение красителей генерировали данные с улучшенной подгонкой. Наша адаптированная экспериментальная модель выращивания и окрашивания клеток E. coli MG1655 в минимальной среде позволяет адекватно определять долю живых клеток и является усовершенствованием инструкций BacLight Kit.

Лучшее соответствие, полученное в минимальной среде по сравнению с физиологическим раствором, может указывать на различия в окрашивании клеток.Для окрашенных SYTO 9 и PI живых суспензий от 100% до 0% эмиссия клеток при 505–515 нм составляла 1,8 × 10 ³ –4,01 × 10 ³ относительных единиц флуоресценции (RFU) и 2,11 × 10 ⁴ — 9,28 × 10 ³ RFU, в физиологическом растворе и минимальной среде, соответственно. Эмиссия клеток 600–610 нм составляла 2,68 × 10 ³ –1,26 × 10 ⁴ RFU и 5,36 × 10 ³ –1,33 × 10 ⁴ RFU в физиологическом растворе и минимальной среде, соответственно. Более высокие интенсивности флуоресценции демонстрируют, что E.coli в минимальной среде поглощали большее количество SYTO 9 и PI. Следовательно, окрашивание в минимальной среде имеет большую чувствительность к концентрации клеток, чем окрашивание в физиологическом растворе.

Улучшенное окрашивание клеток E. coli в минимальной среде может отражать более активное состояние. Ранее было замечено, что E. coli в логарифмической фазе имели более высокую интенсивность флуоресценции по сравнению со стационарной фазой при окрашивании SYBR зеленым и PI (Barbesti et al., 2000). Более активные клетки будут иметь более высокое содержание РНК, увеличивая количество сайтов связывания красителей, в то время как дефицит питательных веществ может вызвать изменения клеточной стенки, снижающие проницаемость красителя (Berney et al., 2007). Улучшение окрашивания в минимальной среде больше для 100% суспензий живых клеток (~ 1 log) по сравнению с 0% суспензий живых клеток (~ 0,5 log), что подтверждает утверждение, что усиление сигнала происходит из-за активных живых клеток.

Для спектрометрии «живой / мертвый» требуется калибровочная кривая для конкретных сред и штаммов (рис. 2C; Freire et al., 2015). Калибровочная кривая может информировать о пределе обнаружения (LoD) и может использоваться для подтверждения пригодности скорректированного соотношения красителей для расчета доли живых клеток в образце (Freire et al., 2015; Ou et al., 2017). Обнаружение живых клеток в суспензиях живых и мертвых клеток достигло плато при ~ 5% живых в минимальной среде (рис. 3C) и 25% живых в физиологическом растворе (рис. 3D). Более низкий LoD дополнительно подтверждает применение спектрометрии живых / мертвых к E. coli в минимальных средах. Предыдущая работа по изучению окрашивания живых / мертвых бактерий E. coli 25922 с использованием проточного цитометра продемонстрировала снижение LoD до 2,5% живых и 20% мертвых бактерий в живых и мертвых суспензиях (Ou et al., 2017). Никаких комментариев по поводу LoD мертвых клеток с использованием текущей оптимизированной методологии нельзя, поскольку подсчет по количеству мертвых клеток лишь косвенно информирует о подсчете мертвых клеток.Дальнейшие исследования позволят дополнительно охарактеризовать LoD с помощью проточного цитометра. Хотя LoD для живых клеток не распространяется на снижение количества жизнеспособных клеток на 99,9%, как требуется для определения бактерицидной активности, результаты демонстрируют возможность количественной оценки различий в жизнеспособности популяций E. coli с использованием оптимизированной методологии. . Дальнейшая работа будет сосредоточена на измерении спектров флуоресценции отдельных клеток, чтобы идентифицировать уникальные спектральные сигнатуры для состояний жизнеспособности и, таким образом, не ограничиваться текущим LoD.Измерения отдельных клеток могут быть выполнены с использованием микрожидкостных чипов — небольших платформ, способных разделять и концентрировать клетки для последующей визуализации (Kaminski et al., 2016). Микрофлюидика — это многообещающий следующий шаг, поскольку он связан с минимальным потреблением расходных материалов и бактериальных образцов, а также с более точным обращением с жидкостями (McClain et al., 2001; Kaminski et al., 2016; Lee et al., 2017).

Было исследовано окрашивание образца в нулевой момент времени, чтобы исключить необходимость 15-минутного периода окрашивания в каждый момент времени.Мы обнаружили ингибирующий эффект красителей, особенно SYTO 9 и PI вместе (рис. 4). Хотя различия не были статистически значимыми, тенденции информативны, поскольку все, что влияет на физиологию и рост клеток, может исказить результаты. Следовательно, для надежного тестирования живых / мертвых красители следует добавлять в аликвоты, взятые в каждый момент времени.

BacLight Kit предположил, что PI заменяет SYTO 9, что приводит к изменению цвета излучения клеток с поврежденными мембранами с зеленого на красный.Однако это происходит только при определенных относительных концентрациях красителя и нуклеиновых кислот (Stocks, 2004). В бесклеточной системе ДНК, окрашенной разными пропорциями PI и SYTO 9, PI необходим для насыщения нуклеиновой кислоты (> 0,4 ​​M PI на 1 M пары оснований ДНК) для того, чтобы произошло замещение (Stocks, 2004). Когда нуклеиновая кислота превышала PI, у обоих красителей оставалось место для связывания ДНК (Stocks, 2004). Окрашивание обоими красителями привело к гашению зеленого и усиленного красного излучения, что свидетельствует о взаимодействии красителей (Stocks, 2004).

Мы исследовали возникновение взаимодействия красителей. SYTO 9 увеличил выбросы PI для всех протестированных суспензий живых и мертвых клеток (рис. 5A). Нормализованная разница в интенсивности излучения при 600–610 нм между одним PI и PI с SYTO 9 (уравнение 3) показала, что ≥25% мертвых клеток необходимы для заметного усиления излучения PI с помощью SYTO 9 (рисунок 5B), что подтверждается спектры, представленные на фиг. 6. Это отражает большее количество взаимодействий, происходящих из-за более сильного окрашивания мертвых клеток SYTO 9 и PI (фиг. 3A, B) по сравнению с живыми клетками, что приводит к увеличению возможностей для взаимодействия.Считается, что мертвые клетки E. coli имеют повышенное окрашивание SYTO 9 по сравнению с живыми клетками, поскольку внутренняя и внешняя мембраны живых клеток не полностью проницаемы для SYTO 9 (Stiefel et al., 2015). Влияние взаимодействия красителя было значительным только для 0% против 100% живых (рис. 5B), то есть в мертвых клетках, где максимальное количество PI связано с ДНК и может взаимодействовать с SYTO 9. Влияние степени SYTO 9 и окрашивание PI при взаимодействии красителей дополнительно демонстрируется интенсивностью флуоресценции дважды окрашенных суспензий живых и мертвых клеток при 505–515 нм.Интенсивность флуоресценции от 100% до 0% живых суспензий варьировала от 2,11 × 10 ⁴ –9,28 × 10 ³ RFU в минимальной среде и 1,8 × 10 ³ –4,01 × 10 ³ RFU в физиологическом растворе. В минимальных средах уменьшение интенсивности флуоресценции по мере увеличения концентрации мертвых клеток предполагает, что эмиссия SYTO 9 подавляется одновременно с увеличением эмиссии PI. Напротив, в физиологическом растворе интенсивность флуоресценции увеличивается с концентрацией мертвых клеток, что может отражать более низкую степень окрашивания SYTO 9 и PI и, следовательно, меньшую степень взаимодействия красителя.

Мы наблюдали повышенную эмиссию 600-610 нм от клеток, окрашенных SYTO 9 и PI по сравнению с одним PI (рис. 5), что свидетельствует о взаимодействии красителя и предполагает, что PI не вытеснил весь SYTO 9. Эмиссия 505-515 нм от 0% живых суспензий E. coli , окрашенных SYTO 9 и PI, подтверждает этот вывод (рис. 6). Эмиссия при 600–610 нм от 100% живых клеток, окрашенных SYTO 9 или PI, была меньше, чем у клеток, окрашенных обоими красителями (рис. 6), что позволяет предположить, что тушение / усиление практически отсутствует.Увеличение выбросов 600–610 нм, вероятно, будет связано с выбросами SYTO 9 в сочетании с несвязанными выбросами PI (фон). Взаимодействие красителей изменяется от перекрестных помех к возбуждению PI с помощью SYTO 9 между 90% и 75% живых клеток, на что указывает относительная эмиссия 505–515 нм между SYTO 9 и SYTO 9 с PI (рис. 6). 75% суспензия живых клеток содержит достаточно высокую концентрацию мертвых клеток, чтобы позволить обоим красителям связываться и происходить взаимодействие. Зеленое и красное излучение происходят не только от живых и мертвых клеток соответственно, что необходимо учитывать при интерпретации результатов спектрометрии живых / мертвых клеток.Необходимы дальнейшие исследования, чтобы полностью понять влияние взаимодействия красителей в различных условиях.

Оптимизирован протокол подсчета живых / мертвых клеток на основе флуоресценции с атрибутами, подходящими для исследований AST. Измерения флуоресценции образцов, полученных в соответствии с оптимизированным протоколом, можно проводить с использованием любого оборудования, которое измеряет флуоресценцию, включая проточный цитометр, спектрофлуориметр, ридер для микропланшетов и Optrode. Преимущества оптимизированной методологии включают отсутствие необходимости промывать образцы перед окрашиванием для предотвращения потери биологической информации, использование нефлуоресцентной среды, которая поддерживает рост бактерий, необходимых для обнаружения действия антибиотика, более высокие уровни окрашивания E.coli и генерация живых / мертвых спектрометрических данных с лучшим соответствием, чем данные, полученные в соответствии с инструкциями набора. Недостатки этой методологии включают высокую LoD (∼5 × 10 ⁶ КОЕ / мл) и взаимодействие красителей, на которое влияет количество мертвых клеток, что может быть проблематичным при тестировании образцов, зараженных антибиотиками, в которых количество мертвых клеток неизвестны.

Заключение

Набор LIVE / DEAD ^® BacLight ^TM для определения бактериальной жизнеспособности может применяться к E.coli MG1655 в среде с минимальными солями А с 0,2% глюкозы для определения жизнеспособности образцов, которые не требовали промывки перед окрашиванием. Оптимальные диапазоны интегрирования длин волн для исследования флуоресцентного излучения SYTO 9 и PI составляют 505–515 нм и 600–610 нм, соответственно. Эти интегрированные площади пиков использовали в скорректированном соотношении красителей, которое лучше коррелировало с долей живых клеток, чем с соотношением в наборе. Взаимодействие с красителем происходит в клетках с поврежденными мембранами, окрашенными как SYTO 9, так и PI.

Авторские взносы

JR задумал, спроектировал и выполнил эксперименты, проанализировал данные, подготовил рисунки и / или таблицы, написал черновики рукописи и утвердил окончательный вариант. КМ предоставил компьютерный код для анализа данных, рассмотрел черновики рукописи и утвердил окончательный вариант. FV и SS участвовали в администрировании проекта, они консультировали по протоколу эксперимента и анализу результатов, рассматривали черновики рукописи и одобряли окончательный вариант.

Финансирование

JR благодарит Фонд развития исследований факультетов Оклендского университета (FRDF) (Быстрое тестирование на чувствительность к антибиотикам, 3714262) за финансирование постдокторской работы. Мы благодарны Министерству бизнеса, инноваций и занятости Новой Зеландии за финансирование проекта Food Safe; программа исследования бактериального подсчета (UOAX1411) в реальном времени.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Список литературы

Амбрис-Авинья, В., Контрерас-Гардуньо, Дж. А., и Педраса-Рейес, М. (2014). Применение проточной цитометрии для характеристики физиологических реакций бактерий. Biomed. Res. Int. 2014: 461941. DOI: 10.1155 / 2014/461941

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Анайя, Н. М., Соломон, Ф., Оянедель-Кравер, В. (2016). Влияние наночастиц оксида диспрозия на Escherichia coli . Environ.Sci. Нано 3, 67–73. DOI: 10.1039 / c5en00074b

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Армстронг, Д. У., и Хе, Л. (2001). Определение жизнеспособности клеток в отдельных или смешанных образцах с использованием капиллярного электрофореза, лазерно-индуцированных микрофлюидных флуоресцентных систем. Анал. Chem. 73, 4551–4557. DOI: 10.1021 / ac010449q

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Барбести С., Читтерио С., Лабра М., Барони М. Д., Нери М. Г. и Сгорбати С.(2000). Двух- и трехцветный флуоресцентный проточно-цитометрический анализ иммуноидентифицированных жизнеспособных бактерий. Цитометрия 40, 214–218. DOI: 10.1002 / 1097-0320 (20000701) 40: 3 <214 :: AID-CYTO6> 3.0.CO; 2-M

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Баренфангер Дж., Дрейк К. и Качич Г. (1999). Клинические и финансовые преимущества быстрой идентификации бактерий и определения чувствительности к противомикробным препаратам. J. Clin. Microbiol. 37, 1415–1418.

Google Scholar

Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H.-U. У., Эгли Т. (2007). Оценка и интерпретация жизнеспособности бактерий с помощью набора LIVE / DEAD BacLight в сочетании с проточной цитометрией. Заявл. Environ. Microbiol. 73, 3283–3290. DOI: 10.1128 / AEM.02750-06

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дэвис, К. (2014). Подсчет пробиотических штаммов: обзор культурально-зависимых и альтернативных методов количественного определения жизнеспособных бактерий. J. Microbiol. Методы 103, 9–17. DOI: 10.1016 / j.mimet.2014.04.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дерн, Г. В., Вотур, Р., Годе, М., и Леви, Б. (1994). Клиническое влияние быстрого тестирования чувствительности in vitro и идентификации бактерий. J. Clin. Microbiol. 32, 1757–1762.

Google Scholar

Эберхарт, Л. Дж., Дерингер, Дж. Р., Брайтон, К. А., Савант, А. А., Бессер, Т. Е., и Калл, Д. Р.(2012). Характеристика нового микроцина, убивающего энтерогеморрагический Escherichia coli O157: H7 и O26. Заявл. Environ. Microbiol. 78, 6592–6599. DOI: 10.1128 / AEM.01067-12

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фрейре, Дж. М., Гаспар, Д., де ла Торре, Б. Г., Вейга, А. С., Андреу, Д., и Кастаньо, М. А. (2015). Мониторинг антибактериальной проницаемости в реальном времени с помощью проточной цитометрии с временным разрешением. Biochim. Биофиз.Acta 1848, 554–560. DOI: 10.1016 / j.bbamem.2014.11.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Готье, К., Сен-Пьер, Ю., и Виллемур, Р. (2002). Экспресс-тестирование изолятов и образцов мочевых путей на чувствительность к противомикробным препаратам с помощью проточной цитометрии. J. Med. Microbiol. 51, 192–200. DOI: 10.1099 / 0022-1317-51-3-192

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Го Р., МакГоверин К., Свифт С. и Ванхолсбек Ф.(2017). Быстрая и недорогая оценка количества бактерий в растворе с помощью флуоресцентной спектроскопии. Анал. Биоанал. Chem. 409, 3959–3967. DOI: 10.1007 / s00216-017-0347-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hewitt, B.M., Singhal, N., Elliot, R.G., Chen, A.Y.H., Kuo, J.Y.C., Vanholsbeeck, F., et al. (2012). Новый метод оптоволоконного обнаружения для анализа in situ флуоресцентно меченных биосенсорных организмов. Environ. Sci. Technol. 46, 5414–5421. DOI: 10.1021 / es300164p

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хефель, Д., Грооби, В. Л., Монис, П. Т., Эндрюс, С., и Сент, К. П. (2003). Подсчет бактерий, передающихся через воду, с использованием тестов жизнеспособности и проточной цитометрии: сравнение с методами, основанными на культуре. J. Microbiol. Методы 55, 585–597. DOI: 10.1016 / S0167-7012 (03) 00201-X

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хёрр, В., Зибур, В., Козицкая, С., Кацович, Э., Хольцграбе, У. (2007). Лазерно-индуцированный флуоресцентный капиллярный электрофорез и измерение флуоресцентного микропланшета: два метода количественной оценки эффекта антибиотиков. Анал. Chem. 79, 7510–7518. DOI: 10.1021 / ac071117 +

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Йоргенсен, Дж. Х., Ферраро, М. Дж. (2009). Тестирование на чувствительность к противомикробным препаратам: обзор общих принципов и современной практики. Clin. Заразить. Дис. 49, 1749–1755. DOI: 10.1086 / 647952

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Юнг, В. К., Ку, Х. К., Ким, К. В., Шин, С., Ким, С. Х., и Пак, Ю. Х. (2008). Антибактериальная активность и механизм действия иона серебра в Staphylococcus aureus и Escherichia coli . Заявл. Environ. Microbiol. 74, 2171–2178. DOI: 10.1128 / AEM.02001-07

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Калиш, Л., Хенне, К., Грёбе, Л., Бреттар, И., и Хёфле, М. Г. (2012). Оценка жизнеспособности видов бактерий в питьевой воде с помощью комбинированных клеточных и молекулярных анализов. Microb. Ecol. 63, 383–397. DOI: 10.1007 / s00248-011-9918-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Камински Т.С., Шелер О., Гарстецки П. (2016). Капельная микрофлюидика для микробиологии: методы, приложения и проблемы. Lab. Чип 16, 2168–2187.DOI: 10.1039 / c6lc00367b

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Kort, R., Nocker, A., de Kat, Angelino-Bart, A., van Veen, S., Verheij, H., Schuren, F., et al. (2010). Обнаружение жизнеспособных микроорганизмов в режиме реального времени с помощью внутриклеточной фототаутомерии. BMC Biotechnol. 10:45. DOI: 10.1186 / 1472-6750-10-45

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лагье, Ж. К., Эдуард, С., Паньье, И., Медианников, О., Дранкур, М., и Рауль, Д. (2015). Текущие и прошлые стратегии бактериальной культуры в клинической микробиологии. Clin. Microbiol. Ред. 28, 208–236. DOI: 10.1128 / CMR.00110-14

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Lee, W.-B., Fu, C.-Y., Chang, W.-H., You, H.-L., Wang, C.-H., Lee, M.S., et al. (2017). Микрожидкостное устройство для определения чувствительности к противомикробным препаратам, основанное на методе разбавления бульона. Biosens. Биоэлектрон. 87, 669–678. DOI: 10.1016 / j.bios.2016.09.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Леонар Л., Чибане Л. Б., Бухедда Б. О., Дегрейв П. и Улахал Н. (2016). Последние достижения в области многопараметрической проточной цитометрии для характеристики противомикробного лечения. Фронт. Microbiol. 7: 1225. DOI: 10.3389 / fmicb.2016.01225

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лейко, С., Легат, А., Фендрихан, С., и Стэн-Лоттер, Х. (2004).Оценка набора LIVE / DEAD baclight для обнаружения экстремофильных архей и визуализации микроорганизмов в образцах с повышенной соленостью окружающей среды. Заявл. Environ. Microbiol. 70, 6884–6886. DOI: 10.1128 / AEM.70.11.6884

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Макклейн, М.А., Калбертсон, К.Т., Якобсон, С.С., и Рэмси, Дж. М. (2001). Проточная цитометрия Escherichia coli на микрофлюидных устройствах. Анал. Chem. 73, 5334–5338.DOI: 10.1021 / ac010504v

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Nocker, A., Cheswick, R., Dutheil de la Rochere, P. M., Denis, M., Léziart, T., and Jarvis, P. (2017). Когда бактерии мертвы? Шаг к интерпретации профилей проточной цитометрии после дезинфекции хлором и окрашивания целостности мембраны. Environ. Technol. 38, 891–900. DOI: 10.1080 / 09593330.2016.1262463

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Оу, Ф., Макговерин, К., Свифт, С., и Ванхолсбек, Ф. (2016). «Быстрая оценка жизнеспособности бактерий с помощью оптрода — портативного флуориметра, близкого к реальному времени», в материалах Труды Австралийской конференции по фотонике и волоконным технологиям, 2016 г. (ACOFT, BGPP, NP), , (Сидней: OSA). DOI: 10.1364 / ACOFT.2016.AW3C.6

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Парк, С. Ю., Ким, К. Г. (2018). Сравнительное исследование трех различных тестов на жизнеспособность химически или термически инактивированного Escherichia coli . Environ. Англ. Res. 23, 282–287. DOI: 10.4491 / eer.2017.223

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пор, Р. С. (1994). Определение чувствительности к антибиотикам методом проточной цитометрии. руб. Soc. Противомикробный. Chemother. 34, 613–627. DOI: 10.1093 / jac / 34.5.613

CrossRef Полный текст | Google Scholar

R Основная команда (2013). R: язык и среда для статистических вычислений. Вена: Фонд R для статистических вычислений.

Google Scholar

Штифель П., Шмидт-Эмрих С., Маниура-Вебер К. и Рен К. (2015). Критические аспекты использования тестов жизнеспособности бактериальных клеток с флуорофором SYTO9 и иодидом пропидия. BMC Microbiol. 15:36. DOI: 10.1186 / s12866-015-0376-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Саллер М. Т. и Ллойд Д. (1999). Флуоресцентный мониторинг бактериального повреждения, вызванного антибиотиками, с использованием проточной цитометрии. Цитометрия 35, 235–241. DOI: 10.1002 / (SICI) 1097-0320 (199) 35: 3 <235 :: AID-CYTO6> 3.0.CO; 2-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Thomas, R. J., Webber, D., Hopkins, R., Frost, A., Laws, T., Jayasekera, P. N., et al. (2011). Клеточная мембрана как основное место повреждения во время аэрозолизации Escherichia coli . Заявл. Environ. Microbiol. 77, 920–925. DOI: 10.1128 / AEM.01116-10

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

ван Белкум, А., Велкер, М., Пинкус, Д., Шарье, Ж.-П., и Жирар, В. (2017). Матричная лазерная десорбционная ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия в клинической микробиологии: каковы текущие проблемы? Ann. Лаборатория. Med. 37, 475–483. DOI: 10.3343 / alm.2017.37.6.475

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Vanholsbeeck, F., Swift, S., Cheng, M., and Bogomolny, E. (2014). «Почти в реальном времени, точный и чувствительный флуоресцентный мониторинг микробиологической безопасности», в протоколе Proceedings of the Advanced Photonics , (Сидней: OSA).DOI: 10.1364 / ДАТЧИКИ.2014.SeM4C.6

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уолберг, М., Гаустад, П. и Стин, Х. Б. (1996). Быстрая проточная цитометрическая оценка чувствительности бактерий к мециллинам и ампициллину. J. Antimicrob. Chemother. 37, 1063–1075. DOI: 10.1093 / jac / 37.6.1063

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

ВОЗ (2014). Устойчивость к противомикробным препаратам: Глобальный отчет о надзоре. Женева: ВОЗ.

Google Scholar